專利名稱：一株凝結(jié)芽孢桿菌及其在l-乳酸鈉制備中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備L-乳酸鈉的專用菌及其所述菌的應(yīng)用，尤其涉及一株凝結(jié) 芽孢桿菌及其在L-乳酸鈉制備中的應(yīng)用；屬食品發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳酸鈉，分子式(]311^303，分子量為112. 06，純凈的乳酸鈉為無(wú)色或近乎無(wú)色的澄 清液體。乳酸鈉廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)。在食品行業(yè)，乳酸鈉可作為食品保 鮮劑、乳化劑、保濕劑、風(fēng)味改進(jìn)劑、品質(zhì)改進(jìn)劑、抗氧化增效劑和PH調(diào)節(jié)劑，能增強(qiáng)風(fēng)味、 抑制食物內(nèi)致病細(xì)菌的生長(zhǎng)、延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期，已在國(guó)外部分替代苯甲酸鈉作防腐劑應(yīng)用 于食品行業(yè)；在醫(yī)藥行業(yè)，乳酸鈉主要作為注射針劑，其主要功能為補(bǔ)充體液和調(diào)節(jié)人體內(nèi) 電解質(zhì)平衡；在化妝品行業(yè)，L-乳酸鈉廣泛用作護(hù)膚品的滋潤(rùn)劑，能使皮膚保持水分，減少 皺紋。乳酸鈉分子中有一個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此具有旋光性。L-乳酸鈉為左旋性，D-乳酸 鈉為右旋性，DL-乳酸鈉為消旋性。只有L-乳酸鈉能為人體所利用，因此開(kāi)發(fā)高光學(xué)純度 L-乳酸鈉的生產(chǎn)技術(shù)具有重要的意義。 乳酸鈉還可用于合成乳酸，進(jìn)而生產(chǎn)可降解聚合物——聚乳酸。聚乳酸具有生物 相容性、生物可降解性及優(yōu)良的機(jī)械性能和物理性能，因而被產(chǎn)業(yè)界認(rèn)為是新世紀(jì)最有發(fā) 展前途的新型包裝材料，將有望逐步替代聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等材料，應(yīng)用前景十分 廣闊。 經(jīng)過(guò)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專利文獻(xiàn)號(hào)CN1076725C，公告日1993-09-29， 記載了一種"好氣菌的繁殖或好氣發(fā)酵的方法"，該技術(shù)利用碳酸鈉或者氫氧化鈉與乳酸直 接反應(yīng)進(jìn)行乳酸鈉生產(chǎn)的工藝，該方法的前提是要有高純度的乳酸，傳統(tǒng)的DL-乳酸價(jià)格 便宜，但是高光學(xué)純度的L-乳酸價(jià)格昂貴，因此不適合與L-乳酸鈉的生產(chǎn)；生物法主要是 利用產(chǎn)乳酸的微生物進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵的過(guò)程中加入碳酸鈣或氫氧化鈣進(jìn)行中和反應(yīng)，得 到乳酸鈣，然后再同碳酸鈉反應(yīng)生成乳酸鈉。還有一種方法是在發(fā)酵的過(guò)程中利用氫氧化 鈉或者碳酸鈉為中和劑，這樣發(fā)酵液中得到的就直接是乳酸鈉，但是由于乳酸鈉對(duì)菌體的 毒害作用，通常發(fā)酵的產(chǎn)量不高。此外，生物法生產(chǎn)的乳酸鈉的構(gòu)型依賴于所使用的微生 物，目前能夠獲得高光學(xué)純度L-乳酸鈉的菌株并不多見(jiàn)，而凝結(jié)芽孢桿菌是一種可產(chǎn)生高 光學(xué)純度L-乳酸的菌株。 進(jìn)一步檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專利文獻(xiàn)號(hào)CN101173242，
公開(kāi)日2008_5_7，記載了一種 "生產(chǎn)L-乳酸的方法及其專用凝結(jié)芽孢桿菌"，該技術(shù)利用一株凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans CASHCGMCC N2 2184)能夠高效的生產(chǎn)L-乳酸，但該專利中利用碳酸鈣為中和 劑，發(fā)酵液中實(shí)際得到的是乳酸牽丐。 美國(guó)專利號(hào)5079164以及中國(guó)專利文獻(xiàn)號(hào)CN1498265A分別記載了兩種利用凝結(jié) 芽 包桿菌Bacillus coagulans DSM 5196禾口凝結(jié)芽孢桿菌Bacillus coagulans SM-7DSM 14043進(jìn)行乳酸生產(chǎn)的方法，但該技術(shù)最終得到的產(chǎn)物也是乳酸鈣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明目的是提供一株凝結(jié)芽孢桿菌及其 在L-乳酸鈉制備中的應(yīng)用。 本發(fā)明所述凝結(jié)芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)室命名為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)
CASN，該菌株從上海嘉定區(qū)某香料廠附近土壤中篩選并誘變得到。所述的凝結(jié)芽孢桿菌
(Bacilluscoagulans)CASN已于2010年01月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱
CCTCC，地址為武漢市武昌珞珈山)，保藏登記號(hào)為CCTCC M 2010035。 本發(fā)明所述凝結(jié)芽孢桿菌在L乳酸鈉制備中的應(yīng)用；是通過(guò)將所述凝結(jié)芽孢桿菌
進(jìn)行培養(yǎng)和發(fā)酵后獲得L-乳酸鈉。
其中所述的培養(yǎng)是指以下兩種方式中的一種實(shí)施 a)依次進(jìn)行的斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)；
b)直接進(jìn)行種子培養(yǎng)。 所述的斜面培養(yǎng)是指將所述凝結(jié)芽孢桿菌接種于含有1. 5 2. Og/100ml的瓊脂 的固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度45 6(TC，培養(yǎng)時(shí)間8 12小時(shí)；
所述的菌體培養(yǎng)溫度優(yōu)選是50 55°C ;
所述的菌體培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選是9 10小時(shí)； 所述的種子培養(yǎng)是指用斜面培養(yǎng)得到的產(chǎn)物或所述凝結(jié)芽孢桿菌接種到種子培 養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度45 6(TC，培養(yǎng)方式為利用漩渦式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)
間6 8小時(shí)； 所述種子培養(yǎng)基每升中含有葡萄糖60 80克，酵母粉10 15克，大豆蛋白胨 5 8克，碳酸鈣10 20克，余量為水；所述種子培養(yǎng)基的pH為5. 5 6。
所述的菌體培養(yǎng)溫度優(yōu)選是50 55°C ;
所述的菌體培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選是6 7小時(shí)； 所述的發(fā)酵是指以所述凝結(jié)芽孢桿菌制得種子液，然后將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng) 基，以溫度45 60°C ，并通入空氣0. 1 1. 5vvm培養(yǎng)12 24小時(shí)，之后停止通氣，繼續(xù)培 養(yǎng)18 48小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中控制攪拌轉(zhuǎn)速在100 500轉(zhuǎn)/分鐘，得含有L乳酸鈉的發(fā)酵 培養(yǎng)液。進(jìn)一步優(yōu)選的方式是以所述凝結(jié)芽孢桿菌制得種子液，然后將種子液接入發(fā)酵培 養(yǎng)基，以溫度50 55°C ，并通入空氣0. 1 0. 5vvm培養(yǎng)18 36小時(shí)，之后停止通氣，繼續(xù) 培養(yǎng)24 48小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中控制攪拌轉(zhuǎn)速在200 300轉(zhuǎn)/分鐘，得含有L_乳酸鈉的 發(fā)酵培養(yǎng)液。 其中，所述發(fā)酵過(guò)程中利用氫氧化鈉或者碳酸鈉控制pH為5. 5 6. 0。
上述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有葡萄糖80 170克/升、氮源5 20克/升，余量為水； 其中所述氮源是指酵母粉5 15克/升、大豆蛋白胨5 15克/升和棉籽蛋白10 20 克/升中的一種或其任意重量比例組合。 實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明從上海嘉定區(qū)某香料廠附近土壤中篩選并誘變得到的凝結(jié)芽孢 桿菌(Bacillus coagulans) CASN CCTCC M 2010035對(duì)L_乳酸鈉耐受性較已有的凝結(jié)芽 孢桿菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC漁2184有明顯提高。具體的，將凝結(jié)芽孢桿菌 (Bacilluscoagulans)CASN CCTCC M 2010035和凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASHCGMCC N2 2184分別在L_乳酸鈉壓力培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時(shí)后，菌株CASH的干重為0. 77克 /升，而菌株CASN的干重達(dá)到1.3克/升，比菌株CASH提高了 68.8%，比較結(jié)果見(jiàn)圖1。
本發(fā)明利用凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans) CASN CCTCC M 2010035，實(shí)現(xiàn)了 以葡萄糖為底物，在45 6(TC條件下以90 95%的糖酸轉(zhuǎn)化率高效發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純度 99%以上的L-乳酸鈉，測(cè)試結(jié)果顯示L-乳酸鈉濃度最高可達(dá)162克/升，體積生產(chǎn)效率 最高可達(dá)5. 2克/升/小時(shí)，另外在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)改變通風(fēng)并控制pH值，能有效提高菌 株對(duì)乳酸鈉的耐受性，并減少副產(chǎn)物的生成，提高轉(zhuǎn)化效率。


圖1為本發(fā)明菌株同凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASH CGMCC漁2184對(duì) L-乳酸鈉耐受性的比較示意圖。 圖2為本發(fā)明制備過(guò)程中葡萄糖和L-乳酸鈉的變化曲線。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。 實(shí)施例1 凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035的分離誘變篩選及 鑒定 1、分離誘變篩選 從上海嘉定區(qū)某香料廠附近取得土樣，每1克土樣加入50毫升營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 (葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，pH為6)中，5(TC富集培養(yǎng)8 12小時(shí)。然后稀釋 涂布到含營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，碳酸鈣20克/升，瓊脂粉 10克/升，pH為6)的培養(yǎng)皿中，5(TC培養(yǎng)24小時(shí)。待長(zhǎng)出單菌落后，挑選菌落面積和透明 圈面積大的菌落280個(gè)，分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖150克/升，酵母粉20克/升，碳 酸鈣80克/升，pH為6)中，5(TC搖床培養(yǎng)48小時(shí)，測(cè)定L_乳酸的產(chǎn)量，挑選產(chǎn)量最高的 菌株，用于下一步紫外誘變。 將初步挑選的菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，5(TC搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，用生理 鹽水洗滌后懸浮，調(diào)成108個(gè)菌/毫升，取5毫升于9厘米培養(yǎng)皿中，距紫外燈30厘米處分 別誘變15秒、30秒、1分鐘和5分鐘，從各不同誘變條件下得到的誘變菌液中分別吸取100 微升，涂布到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在黑暗的條件下5(TC培養(yǎng)14小時(shí)，用生理鹽水將培養(yǎng)皿 上的菌洗滌下來(lái)，分別取100微升接入含5% (5克/100毫升)L-乳酸鈉的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng) 基(葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，L-乳酸鈉50克/升)中，5(TC搖床培養(yǎng)，挑選生 長(zhǎng)最快的一組培養(yǎng)液，稀釋該培養(yǎng)液，涂布在含2% (2克/100毫升)L-乳酸鈉的營(yíng)養(yǎng)固體 培養(yǎng)基(葡萄糖50克/升，酵母粉10克/升，L-乳酸鈉20克/升，瓊脂18克/升)平 板上，待長(zhǎng)出單菌落后，挑選菌落面積大的菌落，接種到含5%卜乳酸鈉的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 中，5(TC搖床培養(yǎng)，挑選生長(zhǎng)最快的菌株。最終得到L-乳酸鈉耐受性最強(qiáng)的菌株。
2、菌株的鑒定
根據(jù)"伯杰系統(tǒng)鑒定手冊(cè)(第八版)"和"常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)"(科學(xué)出版社) 提供的鑒定方法對(duì)上述L-乳酸鈉耐受性最強(qiáng)的菌株進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果表明該菌為桿狀， 長(zhǎng)2. 5 4微米，寬0. 8 0. 9微米，孢子非球形，牙孢囊不膨大?？稍趨捬鯒l件下生長(zhǎng)，可 在pH5.7下生長(zhǎng)，可在6(TC生長(zhǎng)，不能在65t:生長(zhǎng)，能夠在2^氯化鈉生長(zhǎng)，不能在5^氯化 鈉生長(zhǎng)?？衫闷咸烟恰⒗?、甘露醇，不能利用木糖、果糖，能夠水解淀粉、七葉靈，不 能水解酪蛋白、吐溫80、白明膠，精氨酸水解酶陽(yáng)性。該菌株脂肪酸分析的結(jié)果同典型的凝 結(jié)芽孢桿菌。 基于以上特征，上述L-乳酸鈉耐受性最強(qiáng)的菌株鑒定為凝結(jié)芽孢乳桿菌 (Bacilluscoagulans)，實(shí)驗(yàn)室命名凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans) CASN，該菌株已于 2010年01月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址為武漢市武昌珞珈 山)，保藏登記號(hào)為CCTCC M 2010035。
實(shí)施例2 凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035同凝結(jié)芽孢桿菌 (Bacilluscoagulans) CASH CGMCC N2 2184對(duì)L_乳酸鈉耐受性的比較
將凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035和凝結(jié)芽孢桿菌 (Bacilluscoagulans)CASH CGMCC N2 2184分別在L_乳酸鈉壓力培養(yǎng)基(葡萄糖50克/ 升，酵母粉10克/升，L-乳酸鈉0. 5摩爾/升)中培養(yǎng)，20小時(shí)后，菌株CASH的干重為0. 77 克/升，而菌株CASN的干重達(dá)到1. 3克/升，比菌株CASH提高了 68. 8% ，具體的比較結(jié)果 見(jiàn)圖1。 實(shí)施例3 利用凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035在5升發(fā)酵罐 中發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸鈉 該實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下 斜面培養(yǎng)基葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10 克/升，七水合硫酸鎂0. 58克/升，四水合硫酸錳0. 25克/升，碳酸鈣15克/升，瓊脂粉 15克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。 115。C滅菌20分鐘。 種子培養(yǎng)基葡萄糖70克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨5克/升，碳酸鈣15 克/升。該培養(yǎng)基的初始PH為6.5。 115t:條件下滅菌20分鐘。 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)120克/升，酵母粉(北京奧博 星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，商品目錄號(hào)01-013) 10克/升，大豆蛋白胨(北京奧博星生物技 術(shù)責(zé)任有限公司，商品目錄號(hào)01-004) 2克/升。該發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6. 5，不滅菌。
該發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸鈉的方法包括以下步驟 (1)斜面培養(yǎng)將凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans) CASN CCTCC M 2010035菌 種接種于斜面培養(yǎng)基上，5(TC條件下，靜止培養(yǎng)10小時(shí)； (2)種子培養(yǎng)將步驟(1)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝有 100ml種子培養(yǎng)基的300ml三角瓶中，50°C條件下，搖床培養(yǎng)6小時(shí)，轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘 (13mm旋轉(zhuǎn)半徑)，制得種子液； (3)發(fā)酵培養(yǎng)德國(guó)貝朗(BIOSTAT B，B. Bra皿)5升發(fā)酵罐中加入4升發(fā)酵培養(yǎng)基。 在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入400ml種子培養(yǎng)液，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘(33mm旋轉(zhuǎn)半徑)，空氣的通入量為0. 5vvm， 16小時(shí)后停止通風(fēng)，利用10M的氫氧化鈉控制發(fā)酵液的pH為6. 5， 5(TC條件下發(fā)酵30小時(shí)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)10次重復(fù)。每3個(gè)小時(shí)取發(fā)酵液，6，000轉(zhuǎn)/分鐘離心 5分鐘，取上清液檢測(cè)發(fā)酵液中L-乳酸鈉濃度、D-乳酸鈉濃度、葡萄糖濃度，計(jì)算糖酸轉(zhuǎn)化 率、體積生產(chǎn)效率和L-乳酸鈉的光學(xué)純度。 其中，葡萄糖的測(cè)定方法為，發(fā)酵液稀釋后離心，采用生物傳感分析儀 SBA-40C(山東省科學(xué)院)測(cè)定。 L-乳酸鈉和D-乳酸鈉含量的測(cè)定方法為，采用Agilent IIOO液相色譜儀，配備 手性分離柱(日本三菱化學(xué)公司，MCI GEL-CRS10W(3ii )4. 6IDX 50mm，光學(xué)異體分離用)。 具體操作條件為0. 002mol/L硫酸銅作為流動(dòng)相，流量0. 5ml/min，進(jìn)樣量20 y L，紫外檢測(cè) 器，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，操作溫度25t:。利用L-乳酸鈉和D-乳酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出發(fā)酵液中L-乳酸鈉和D-乳酸鈉的含量。 本發(fā)明中，作為標(biāo)準(zhǔn)品的D-乳酸鈉為德國(guó)Sigma-Aldrich公司的產(chǎn)品，其貨 號(hào)為77166-1G ;作為標(biāo)準(zhǔn)品的L-乳酸鈉為德國(guó)Sigma-Aldrich公司的產(chǎn)品，其貨號(hào)為 71718-10G。在如上色譜條件下，D-乳酸保留時(shí)間為10. 150分鐘，L-乳酸保留時(shí)間為12. 293 分鐘。 光學(xué)純度(optical purity)是衡量旋光性樣品中一個(gè)對(duì)映體超過(guò)另一個(gè)對(duì)映體 的量的量度，它可用對(duì)映體過(guò)量值(enantiomeric excess)表示。本發(fā)明中L-乳酸的光學(xué) 純度按以下公式計(jì)算(L-乳酸含量-D-乳酸含量)+ (L-乳酸含量+D-乳酸含量)X 100% 。
糖酸轉(zhuǎn)化率定義為L(zhǎng)-乳酸產(chǎn)量(克/升)+葡萄糖的消耗量(克/升)X 100% 。
體積生產(chǎn)效率定義為L(zhǎng)-乳酸鈉產(chǎn)量(克/升)+發(fā)酵時(shí)間(小時(shí))。
發(fā)酵結(jié)束后，葡萄糖的濃度為1.4克/升±0.6克/升丄_乳酸鈉濃度134克/升 ± 1. 8克/升，糖酸轉(zhuǎn)化率91. 0% ±0. 5%，體積生產(chǎn)效率4. 5克/升/小時(shí)±0. 4克/升 /小時(shí)，L-乳酸鈉光學(xué)純度99. 5% ±0.1%。
實(shí)施例4 利用凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035在5升發(fā)酵罐 中發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸鈉 該實(shí)施例中所用的斜面和種子的培養(yǎng)基的組成以及培養(yǎng)方式同實(shí)施例3。 發(fā)酵初始培養(yǎng)基葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)108克/升，大豆蛋白胨(北
京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，商品目錄號(hào)01-004) 10克/升，棉籽蛋白(北京康明威培
養(yǎng)基技術(shù)有限責(zé)任公司)8克/升。該發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6. 5，不滅菌。 發(fā)酵培養(yǎng)德國(guó)貝朗(BIOSTAT B， B. Bra皿)5升發(fā)酵罐中加入4升發(fā)酵初始培養(yǎng)
基。在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入400ml種子培養(yǎng)液，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分鐘(33mm旋轉(zhuǎn)半
徑)，空氣的通入量為0. 2vvm， 12小時(shí)后停止通風(fēng)，利用10M的碳酸鈉控制發(fā)酵液的pH為
6. 0， 55t:條件下共發(fā)酵24小時(shí)。發(fā)酵液6， 000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清液檢測(cè)發(fā)酵液
中L-乳酸鈉濃度、D-乳酸鈉濃度、葡萄糖濃度，計(jì)算糖酸轉(zhuǎn)化率、體積生產(chǎn)效率和L-乳酸
鈉光學(xué)純度。 結(jié)果表明發(fā)酵結(jié)束后，葡萄糖的濃度為1. 1克/升±0. 2克/升，L-乳酸鈉濃度 125克/升±2. 2克/升，糖酸轉(zhuǎn)化率93. 5 % ±0. 4%，體積生產(chǎn)效率5. 2克/升/小時(shí) ±0. 3克/升/小時(shí)，L-乳酸鈉光學(xué)純度99. 5% ±0. 2%。
實(shí)施例5 利用凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans) CASN CCTCC M 2010035在30升發(fā)酵罐 中發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸 該實(shí)施例中所用的斜面和種子的培養(yǎng)基的組成以及培養(yǎng)方式同實(shí)施例3。
發(fā)酵初始培養(yǎng)基葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)160克/升，酵母粉(北京 奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，商品目錄號(hào)01-013)5克/升，棉籽蛋白(北京康明威培養(yǎng) 基技術(shù)有限責(zé)任公司)20克/升。該發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6. 5，不滅菌。
發(fā)酵培養(yǎng)上海保興30升發(fā)酵罐中加入20升發(fā)酵初始培養(yǎng)基。在發(fā)酵培養(yǎng)基中接 入2升種子培養(yǎng)液，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘(33mm旋轉(zhuǎn)半徑)，空氣的通入量為lvvm， 20小時(shí)后停止通風(fēng)，利用10M的碳酸鈉控制發(fā)酵液的pH為6. 2， 52t:條件下共發(fā)酵48小時(shí)。 其中，發(fā)酵到26小時(shí)(經(jīng)檢測(cè)，此時(shí)發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為19克/升)，停止通風(fēng)，按照 每升發(fā)酵液中補(bǔ)加3克酵母粉的量補(bǔ)加酵母粉、按照每升發(fā)酵液中補(bǔ)加6克棉籽蛋白的量 補(bǔ)加棉籽蛋白；即每個(gè)發(fā)酵罐中60克酵母粉(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，商品目 錄號(hào)01-013) 、120克棉籽蛋白(北京康明威培養(yǎng)基技術(shù)有限責(zé)任公司)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)10次重 復(fù)。發(fā)酵液6， 000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清液檢測(cè)發(fā)酵液中L-乳酸鈉濃度、D-乳酸鈉 濃度、葡萄糖濃度，計(jì)算糖酸轉(zhuǎn)化率、體積生產(chǎn)效率和L-乳酸鈉光學(xué)純度。
結(jié)果表明凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASN CCTCC M 2010035發(fā)酵生產(chǎn) L-乳酸過(guò)程中葡萄糖和L-乳酸鈉的變化曲線如圖2所示。發(fā)酵結(jié)束后，葡萄糖的濃度為 15.0克/升±2.8克/升，L-乳酸鈉濃度162克/升±5.2克/升，糖酸轉(zhuǎn)化率90.2% ±1. 3%，體積生產(chǎn)效率3. 4克/升/小時(shí)±0. 3克/升/小時(shí)，L-乳酸光學(xué)純度99. 7% ±0. 3%。
權(quán)利要求
一株凝結(jié)芽孢桿菌，該菌名為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASN，已于2010年01月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏登記號(hào)為CCTCC M 2010035。
2. 權(quán)利要求1所述凝結(jié)芽孢桿菌在L-乳酸鈉制備中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，以所述凝結(jié)芽孢桿菌制得種子液，然后將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，以溫度45 60°C，并通入空氣0. 1 1. 5vvm培養(yǎng)12 24小時(shí)，之后停止通氣，繼續(xù)培養(yǎng)18 48小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中控制攪拌轉(zhuǎn)速在100 500轉(zhuǎn)/分鐘，得含有L乳酸鈉的發(fā)酵培養(yǎng)液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，以所述凝結(jié)芽孢桿菌制得種子液，然后將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，以溫度50 55°C，并通入空氣0. 1 0. 5vvm培養(yǎng)18 36小時(shí)，之后停止通氣，繼續(xù)培養(yǎng)24 48小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中控制攪拌轉(zhuǎn)速在200 300轉(zhuǎn)/分鐘，得含有L-乳酸鈉的發(fā)酵培養(yǎng)液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵過(guò)程中利用氫氧化鈉或者碳酸鈉控制pH為5. 5 6. 0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有葡萄糖80 170克/升、氮源5 20克/升，余量為水。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述氮源是指酵母粉5 15克/升、大豆蛋白胨5 15克/升和棉籽蛋白10 20克/升中的一種或其任意重量比例組合。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株凝結(jié)芽孢桿菌，該菌名為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASN，已于2010年01月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏登記號(hào)為CCTCC M 2010035。本發(fā)明還公開(kāi)了所述凝結(jié)芽孢桿菌在L-乳酸鈉制備中的應(yīng)用，即通過(guò)將所述凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)和發(fā)酵后獲得L-乳酸鈉。應(yīng)用本發(fā)明所述凝結(jié)芽孢桿菌制得的L-乳酸鈉濃度最高可達(dá)162克/升，體積生產(chǎn)效率最高可達(dá)5.2克/升/小時(shí)。
文檔編號(hào)C12R1/07GK101792727SQ201010137769
公開(kāi)日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月2日
發(fā)明者唐鴻志, 王曉玉, 王秀文, 蓋忠輝, 秦加陽(yáng), 許平, 陶飛, 馬翠卿 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)