專利名稱：一種海藻糖的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海藻糖的生產(chǎn)方法，特別是一種利用惡臭假單胞菌生產(chǎn)海藻糖的 方法，屬于發(fā)酵工程及微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
海藻糖(Trehalose)，又名蘑菇糖、覃糖，它的分子式為C12H22O11 · 2H20，化學(xué)名 α -D- 口比喃葡萄糖基 α -D- 口比喃葡萄糖昔(α -D-glycopyranosyl- α -D-glycopyranosid e)，是由兩個(gè)葡萄糖分子通過(guò)半縮醛羥基縮合而成的非還原性雙糖。廣泛存在于細(xì)菌、酵 母、真菌、藻類和昆蟲(chóng)中。海藻糖具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，可以保護(hù)蛋白質(zhì)，生物膜及敏感細(xì) 胞的細(xì)胞壁免受干旱、冷凍和滲透壓的變化而造成的傷害，可作為不穩(wěn)定藥品、食品和化妝 品的穩(wěn)定劑、多種食品和藥品甜味劑、種子的包衣、冷凍干燥菌株的保護(hù)劑等；海藻糖還可 保護(hù)DNA防止放射線引起的損傷。海藻糖的生產(chǎn)方法包括微生物抽提法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法、基因重組法、 酶轉(zhuǎn)化法等。酶轉(zhuǎn)化法制取海藻糖的途徑有多種，按其作用的底物，主要分為以葡萄糖、麥 芽糖、淀粉為底物的三種方法。1、以葡萄糖為底物人們?cè)谘芯拷湍傅纳锖铣赏緩綍r(shí)，發(fā)現(xiàn)酵母利用體內(nèi)的6-P-海藻糖合成酶和 6-P-海藻糖磷酸酯酶，經(jīng)兩步作用將兩個(gè)葡萄糖分子轉(zhuǎn)化為海藻糖。據(jù)此，Hidcki Kizawa 等人在小球菌變異株菌體內(nèi)提取出合成酶，轉(zhuǎn)化葡萄糖為海藻糖。但這一過(guò)程需要消耗高 能物質(zhì)UDP或GDP，且酶活很不穩(wěn)定，因此用該方法很難實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。2、以麥芽糖為底物以麥芽糖為底物的酶轉(zhuǎn)化法目前發(fā)現(xiàn)有兩種。(1)利用某些磷酸化酶由麥芽糖二步轉(zhuǎn)化為海藻糖Sawao Murao等詳細(xì)研究了由麥芽糖生物合成海藻糖的途徑
麥芽糖磷酸化酶
麥芽糖+ Pi;‘葡萄糖+ β 一葡萄糖一 1_磷酸
葡萄糖+β —葡萄糖一ι_磷酸海藻糖+Η 第一步反應(yīng)麥芽糖在海藻糖磷酸化酶的作用下生成葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷 酸。第二步反應(yīng)是葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷酸在海藻糖磷酸化酶作用下生成海藻糖和磷 酸。日本專利曾介紹用麥芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶處理麥芽糖就可以生產(chǎn)海藻糖。 酶反應(yīng)完成后，從反應(yīng)液中除去沉淀物，含有海藻糖的液體進(jìn)一步用陰離子交換樹(shù)脂純化， 然后，再用一種硼酸型陰離子交換樹(shù)脂吸附海藻糖，采用硼酸鉀分級(jí)洗脫和收集。含有海藻 糖部分經(jīng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂處理和濃縮，然后加入少量乙醇蒸餾除去硼酸，最后的濃縮液用 乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，可得到二水海藻糖晶體。研究表明，此法反應(yīng)生產(chǎn)海藻糖轉(zhuǎn)化率較低且酶制備及產(chǎn)物提取困難，不適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。(2)利用海藻糖合酶將麥芽糖_步轉(zhuǎn)化為海藻糖許多細(xì)菌中都有海藻糖合酶，如脂肪桿菌(Pimelobacter sp.)、惡臭假單孢菌 (Pseudomonas putida)、水生嗜熱菌(Thermus aquaticus)等。這種酶是分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基 酶，能將麥芽糖的α_1，4糖苷鍵轉(zhuǎn)化成α _1，1糖苷鍵，但不作用于葡萄糖，麥芽三、四、五 糖，麥芽寡糖、曲二糖、黑曲霉二糖、異麥芽糖、海藻寡糖、蔗糖、松二糖、異麥芽寡糖和乳糖。 這種酶在催化麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖的過(guò)程中不消耗高能物質(zhì)，不需要磷酸，且轉(zhuǎn)化率高達(dá) 70-80%，海藻糖產(chǎn)率和麥芽糖的濃度(2. 5% -40% )無(wú)關(guān)。這為海藻糖的大 規(guī)模生產(chǎn)提共 了有利條件。該酶催化麥芽糖生成海藻糖的反應(yīng)是
i + tcfe海藻糖合酶 、、#T^r i 麥牙糖-W每藻糖(3)以淀粉或淀粉水解物為底物低聚麥芽糖苷基海藻糖生成酶(MTSase)和低聚麥芽糖苷基海藻糖水解酶 (MTHase)是首先在節(jié)桿菌Q36中發(fā)現(xiàn)的，這兩種酶能作用于麥芽寡糖或淀粉生成海藻糖。 其中以直鏈淀粉為底物生產(chǎn)海藻糖的機(jī)理如下(C6H10O6)m MTSase > (C6H10O6)n-2trehalose MTHase > (C6H10O6)+Trehalose該反應(yīng)分兩步完成，第一步，MTSase由麥芽低聚糖(淀粉液化液)的還原性末端開(kāi) 始，通過(guò)分子內(nèi)轉(zhuǎn)苷作用，將α-1，4鍵轉(zhuǎn)變成α _1，1鍵，使原麥芽低聚糖轉(zhuǎn)變?yōu)閹в幸粋€(gè) 海藻糖結(jié)構(gòu)的麥芽低聚糖，是一種分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基酶，稱為麥芽寡糖基海藻糖合酶；第二步， MTHase專一地作用于α-1，1鍵相鄰的α _1，4鍵，從而使原麥芽低聚糖變?yōu)樯賰蓚€(gè)葡萄糖 苷的低聚糖和游離的海藻糖，稱為麥芽寡糖海藻糖基水解酶。如果n-2 ^ 3，則上述反應(yīng)繼 續(xù)進(jìn)行，所以如果反應(yīng)完全，其最終產(chǎn)物主要為海藻糖及一部分葡萄糖和麥芽糖。目前商品化的海藻糖主要從酵母細(xì)胞中提取，收率低且成本高，限制了海藻糖的 廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種利用惡臭假單胞菌生產(chǎn)海藻糖的方法。該 方法通過(guò)使用試劑β “巰基乙醇，處理惡臭假單胞菌，使其改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性， 制得透性細(xì)胞，生產(chǎn)出海藻糖。本發(fā)明過(guò)程中涉及的技術(shù)方案詳述如下一種利用惡臭假單胞菌生產(chǎn)海藻糖的方法，包括惡臭假單胞菌培養(yǎng)步驟、β “巰基 乙醇處理步驟和發(fā)酵步驟，其特征在于，β-巰基乙醇處理步驟如下將經(jīng)過(guò)惡臭假單胞菌培養(yǎng)步驟獲得的菌液進(jìn)行濃縮，使惡臭假單胞菌菌體占菌液 的質(zhì)量體積比為8% -12%的濃縮菌液，然后向濃縮菌液中加入β-巰基乙醇，使菌液中 β-巰基乙醇的終濃度達(dá)到0. 1% _1%，反應(yīng)2小時(shí)，制得惡臭假單胞菌透性細(xì)胞溶液。上述質(zhì)量體積比單位為g/ml或kg/1。優(yōu)選的，所述惡臭假單胞菌菌體占菌液的質(zhì)量百分比為10%。所述的惡臭假單胞菌培養(yǎng)步驟，具體如下
將惡臭假單胞菌于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)72h后即得菌液。上述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比麥芽糖2%，蛋白胨 0. 5%，牛肉膏 0. 2%，K2HPO4 0.1%, NaH2PO4 0.1%, MgSO4 0. 05%，水余量。所述的發(fā)酵步驟，具體如下向經(jīng)過(guò)β-巰基乙醇處理步驟制得的惡臭假單胞菌透性細(xì)胞溶液中，加入麥芽 糖，使麥芽糖的終濃度為10wt%，培養(yǎng)10-14小時(shí)，離心或過(guò)濾，得到海藻糖溶液。經(jīng)檢測(cè)， 海藻糖溶液的海藻糖含量為3% -5%。優(yōu)選的，所述的惡臭假單胞菌購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，名稱惡臭假單胞菌 (PseudOmonasputida),代號(hào)Asl. 1003。本發(fā)明有益效果如下本發(fā)明以麥芽糖為底物，通過(guò)制備惡臭假單胞菌的透性細(xì)胞，利用其細(xì)胞內(nèi)海藻 糖合酶將麥芽糖一步轉(zhuǎn)化為海藻糖。經(jīng)過(guò)β-巰基乙醇處理的惡臭假單胞菌細(xì)胞，細(xì)胞膜 的選擇透過(guò)性被破壞，海藻糖可以自由排到細(xì)胞外，而海藻糖合酶屬于大分子蛋白質(zhì)，可以 留在細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞膜具有選擇性時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的海藻糖不會(huì)排到細(xì)胞外，因此細(xì)胞 內(nèi)海藻糖的濃度不斷升高，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)海藻糖的濃度達(dá)到一定濃度后，海藻糖合酶停止轉(zhuǎn)化， 因此，細(xì)胞膜具有選擇性的惡臭假單胞菌細(xì)胞培養(yǎng)液中并沒(méi)有海藻糖生成，并且海藻糖產(chǎn) 量有限；當(dāng)細(xì)胞膜不具有選擇性時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的海藻糖會(huì)隨時(shí)擴(kuò)散到培養(yǎng)液中，因此，只 有當(dāng)培養(yǎng)液中海藻糖的濃度達(dá)到特定濃度后，海藻糖合酶才會(huì)停止轉(zhuǎn)化，因此，培養(yǎng)液中可 以獲得大量海藻糖。經(jīng)測(cè)定，同樣的酶解條件下，沒(méi)有用巰基乙醇處理的惡臭假單胞菌 透性細(xì)胞溶液沒(méi)有任何海藻糖生成，而用β _巰基乙醇處理的惡臭假單胞菌透性細(xì)胞溶液 有3% -5%的海藻糖生成。


圖1是未經(jīng)處理的惡臭假單胞菌細(xì)胞溶液和經(jīng)過(guò)β _巰基乙醇處理后的惡臭假單 胞菌透性細(xì)胞溶液加入等量麥芽糖在相同條件下酶解后，通過(guò)薄層層析后的層析圖譜；其中圖上部黑色處為麥芽糖，下部黑色處為海藻糖，第一泳道為未經(jīng)處理的惡臭 假單胞菌細(xì)胞溶液，第二泳道為經(jīng)過(guò)β “巰基乙醇處理后的惡臭假單胞菌透性細(xì)胞溶液。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不僅限 于此。實(shí)施例中所用培養(yǎng)基成分麥芽糖、蛋白胨、牛肉膏、K2HP04、NaH2P04、MgS04均為市售
產(chǎn)品 ο惡臭假單胞菌購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，名稱惡臭假單胞菌(Pseud Omonasputida),代號(hào)Asl. 1003。實(shí)施例1取惡臭假單胞菌，經(jīng)30°C、180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)72h。發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽糖 2wt %，蛋白胨 0. 5wt %，牛肉膏 0. 2wt %，K2HPO4 0. Iwt %，NaH2PO4 0. Iwt %，MgSO4 0. 05wt%，余量水。發(fā)酵培養(yǎng)后4800r/min離心20min，制得濃縮菌液IOOmL,其中含有菌體 IOgo向上述濃縮菌液中加入0.5mL的β-巰基乙醇，反應(yīng)2h，制得惡臭假單胞菌透性細(xì)胞 溶液，然后，向制得惡臭假單胞菌透性細(xì)胞溶液中加入IOg麥芽糖，反應(yīng)12h，離心后，取上 清液，即得到含有4g海藻糖的海藻糖溶液。實(shí)施例2取惡臭假單胞菌，經(jīng)30°C、180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)72h。發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽 糖 2wt %，蛋白胨 0. 5wt %，牛肉膏 0. 2wt %，K2HPO4 0. Iwt %，NaH2PO4 0. Iwt %，MgSO4 0. 05wt%，余量水。發(fā)酵培養(yǎng)后lOOOOr/min離心5min，制得濃縮菌液50mL，其中含有菌體 5g。向上述濃縮菌液中加入0. 5mL的β -巰基乙醇，反應(yīng)2h，制得惡臭假單胞菌透性細(xì)胞 溶液，然后，向制得惡臭假單胞菌透性細(xì)胞溶液中加入5g麥芽糖，反應(yīng)12h，離心后，取上清 液，即得到含有2g海藻糖的海藻糖溶液。實(shí)施例3取惡臭假單胞菌，經(jīng)30°C、180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)72h。發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽 糖 2wt %，蛋白胨 0. 5wt %，牛肉膏 0. 2wt %，K2HPO4 0. Iwt %，NaH2PO4 0. Iwt %，MgSO4 0. 05wt%，余量水。發(fā)酵培養(yǎng)后8000r/min離心lOmin，制得濃縮菌液IOOOmL,其中含有菌 體80g。向上述濃縮菌液中加入8!^的β-巰基乙醇，反應(yīng)2h，制得惡臭假單胞菌透性細(xì)胞 溶液，然后，向制得惡臭假單胞菌透性細(xì)胞溶液中加入IOOg麥芽糖，反應(yīng)12h，離心后，取上 清液，即得到含有31g海藻糖的海藻糖溶液。將該海藻糖溶液與在相同條件下培養(yǎng)的未經(jīng) 處理的惡臭假單胞菌細(xì)胞溶液通過(guò)薄層層析后，發(fā)現(xiàn)約有30%的麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖。層 析圖譜見(jiàn)圖1。實(shí)施例4取惡臭假單胞菌，經(jīng)30°C、180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)72h。發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽 糖 2wt %，蛋白胨 0. 5wt %，牛肉膏 0. 2wt %，K2HPO4 0. Iwt %，NaH2PO4 0. Iwt %，MgSO4 0. 05wt%，余量水。發(fā)酵培養(yǎng)后5000r/min離心20min，制得濃縮菌液15mL，其中含有菌體 1.6g。向上述濃縮菌液中加入0. ImL的β-巰基乙醇，反應(yīng)2h，制得惡臭假單胞菌透性細(xì)胞 溶液，然后，向制得惡臭假單胞菌透性細(xì)胞溶液中加入1. 5g麥芽糖，反應(yīng)12h，離心后，取上 清液，即得到含有0. 6g海藻糖的海藻糖溶液。
權(quán)利要求
一種利用惡臭假單胞菌生產(chǎn)海藻糖的方法，包括惡臭假單胞菌培養(yǎng)步驟、β-巰基乙醇處理步驟和發(fā)酵步驟，其特征在于，β-巰基乙醇處理步驟如下將經(jīng)過(guò)惡臭假單胞菌培養(yǎng)步驟獲得的菌液進(jìn)行濃縮，使惡臭假單胞菌菌體占菌液的質(zhì)量體積比為8％-12％的濃縮菌液，然后向濃縮菌液中加入β-巰基乙醇，使菌液中β-巰基乙醇的終濃度達(dá)到0.1％-1％，反應(yīng)2小時(shí)，制得惡臭假單胞菌透性細(xì)胞溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)海藻糖的方法，其特征在于，所述惡臭假單胞菌菌體占菌 液的質(zhì)量百分比為10%。
3.如權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)海藻糖的方法，其特征在于，所述的惡臭假單胞菌培養(yǎng) 步驟，具體如下將惡臭假單胞菌于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)72h后即得 菌液。
4.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)海藻糖的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均 為重量百分比麥芽糖 2%，蛋白胨 0. 5%，牛肉膏 0. 2%,K2HP04 0. 1 %,NaH2P04 0. 1 %,MgS04 0 . 05%, 水余量。
5.如權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)海藻糖的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵步驟，具體如下向經(jīng)過(guò)3 -巰基乙醇處理步驟制得的惡臭假單胞菌透性細(xì)胞溶液中，加入麥芽糖，使 麥芽糖的終濃度為10wt %，培養(yǎng)10-14小時(shí)，離心或過(guò)濾，得到海藻糖溶液。
6.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)海藻糖的方法，其特征在于，所述的惡臭假單胞菌購(gòu)自中 國(guó)科學(xué)院微生物研究所，名稱惡臭假單胞菌(Pseud Omonasputida)，代號(hào)Asl. 1003。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海藻糖的生產(chǎn)方法，特別是一種利用惡臭假單胞菌生產(chǎn)海藻糖的方法，屬于發(fā)酵工程及微生物技術(shù)領(lǐng)域。一種利用惡臭假單胞菌生產(chǎn)海藻糖的方法，包括惡臭假單胞菌培養(yǎng)步驟、β-巰基乙醇處理步驟和發(fā)酵步驟。本發(fā)明以麥芽糖為底物，通過(guò)制備惡臭假單胞菌的透性細(xì)胞，利用其細(xì)胞內(nèi)海藻糖合酶將麥芽糖一步轉(zhuǎn)化為海藻糖。經(jīng)測(cè)定，用β-巰基乙醇處理的惡臭假單胞菌透性細(xì)胞溶液中約有3％-5％的海藻糖生成。
文檔編號(hào)C12P19/12GK101831474SQ20101013796
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月2日
發(fā)明者徐汝意, 李丕武, 王瑞明, 王騰飛, 馬春玲 申請(qǐng)人:山東輕工業(yè)學(xué)院