專利名稱：一種小鼠精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞分離培養(yǎng)領(lǐng)域，具體是一種小鼠精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells, SSCs)是生長(zhǎng)于生精小管上皮近基 底膜區(qū)域的雄性生殖干細(xì)胞，它主要參與精子發(fā)生，通過自我更新維持生殖干細(xì)胞庫穩(wěn)定 或是自我分化成一定數(shù)量的精母細(xì)胞并最終發(fā)育成精子，保證雄性動(dòng)物正常的生殖能力。 SSCs是雄性動(dòng)物中唯一能將遺傳信息傳遞給后代的干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的可塑性，因此它是 生殖醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞工程和發(fā)育生物學(xué)、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因等方面的重要研究材料，具有極大的科研 價(jià)值。SSCs的成功分離培養(yǎng)是對(duì)其進(jìn)行深入研究的基礎(chǔ)，但由于其在動(dòng)物睪丸中含量極少， 不易分離純化，給體外培養(yǎng)SSCs造成很大的困難。目前國內(nèi)外常用的分離純化SSCs方法主要有差速貼壁法、兩步酶消化法、 Percoll密度梯度分選法、免疫磁珠分選法、免疫熒光激活細(xì)胞分選或是上述幾種方法的結(jié) 合，然而這些方法各自存在著如操作流程繁瑣、酶消化作用時(shí)間長(zhǎng)、富集后細(xì)胞活力不高或 成本較高等缺點(diǎn)。方法一兩步酶消化與差速貼壁結(jié)合分離富集SSCs (1)、離體睪丸去除白膜后，將睪丸組織轉(zhuǎn)移到離心管中，DPBS洗滌2-3次；(2)、加10倍體積的消化液I (含0. 2%膠原酶IV的DPBS)，吸管輕輕吸打，室溫下 作用 3-5min ；(3)、DPBS洗滌，離心，棄上清，重復(fù)2-3次；(4)、加5倍體積的消化液II (分別含0. 2%膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶和200 μ g/ml DNase的無血清DMEM)，吸管輕輕吸打，室溫下消化2-5min ；(5)、加10倍體積的DPBS，離心，棄上清，反復(fù)2_3次；(6)、DPBS重懸細(xì)胞，用60 μ m孔徑的篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，濾出液于1200r/5min離 心，棄上清，DPBS重懸，1200r離心洗滌2次；(7)、最后用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到0. 2% (w/v)明膠包被的培養(yǎng)瓶或者6孔板， 置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。上述接種的細(xì)胞中主要有精原干細(xì)胞和支持細(xì)胞等其他雜細(xì)胞，根據(jù)支 持細(xì)胞等雜細(xì)胞貼壁快的特性，再采用差速貼壁法除去雜細(xì)胞a.在培養(yǎng)基中培養(yǎng)40min 至Ih ；b.用吸管輕輕吹打，懸起生精細(xì)胞和部分雜細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到新的明膠包被的培養(yǎng)瓶/皿 中，繼續(xù)培養(yǎng)3-4h;c.用同樣的方法，再次懸起尚未緊密貼壁的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到第三個(gè)新的明 膠包被的培養(yǎng)瓶/皿中培養(yǎng)過夜至1天，直到雜細(xì)胞完全貼壁并開始鋪展生長(zhǎng)；d.吹打懸 起精原干細(xì)胞細(xì)胞，收集并離心，棄上清，以培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種至飼養(yǎng)層上培養(yǎng)。采用兩步酶消化與差速貼壁結(jié)合分離富集SSCs，其分離使用了膠原酶、透明質(zhì)酸 酶以及DNase或胰蛋白酶消化睪丸細(xì)胞，富集步驟持續(xù)5_6h甚至24h ；此方便操作步驟繁 瑣，分離富集所需時(shí)間較長(zhǎng)；且多種消化酶對(duì)細(xì)胞的刺激和長(zhǎng)時(shí)間懸浮可導(dǎo)致SSCs活力持 續(xù)下降，使后期培養(yǎng)的SSCs生長(zhǎng)狀態(tài)較差；且分離液中殘留紅細(xì)胞等不易貼壁雜細(xì)胞可與SSCs 一起被富集培養(yǎng)，這會(huì)影響富集效果。方法二 兩步酶消化與Percoll密度梯度離心結(jié)合分離富集SSCs 兩步酶消化步驟與方法一操作步驟(1)_(6)相同，但第7步在離心管中按密度由 大到小依次疊加Percoll密度梯度液，將待分離的睪丸細(xì)胞懸液置于梯度分離液最上層， HOOrAOmin離心；收集27%-35%梯度之間界面上的細(xì)胞(主要為SSCs)至離心管中。加 入適量DPBS，混勻離心，棄上清再加入培養(yǎng)液，吹打混勻后接種培養(yǎng)。
將用兩步酶消化法分離得到的睪丸細(xì)胞經(jīng)Percoll密度梯度離心富集SSCs，這樣 雖縮短了富集時(shí)間，但Percoll密度梯度離心時(shí)間就長(zhǎng)達(dá)20min，較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)使用較大的離 心力作用會(huì)對(duì)細(xì)胞的生物結(jié)構(gòu)造成破壞，從而對(duì)細(xì)胞活力造成一定的影響，同樣使分離富 集后的SSCs存活率不高；方法三采用細(xì)胞分選儀器輔助分離富集SSCs 目前常用的儀器輔助分選方法有免疫磁珠分選法(magnetic activatedcell sorting，MACS)、免疫熒光激活細(xì)胞分選法(fluorescent activated cellsorting,FACS)；SSCs的相對(duì)特異細(xì)胞表面分子標(biāo)志有c-kit，GFRa -1，C-Ret, MHC-I, Thy-I, a v-integrin, a 6-integrin等。MACS原理是通過將已包被一抗的磁珠與SSCs相對(duì)特異標(biāo) 志分子結(jié)合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠與預(yù)先已與SSCs相對(duì)特異標(biāo) 志分子結(jié)合的一抗結(jié)合。磁珠攜帶與之結(jié)合的SSCs吸附于分離柱或試管上，實(shí)現(xiàn)SSCs分 罔。FAGS采用熒光標(biāo)記SSCs相對(duì)特異標(biāo)志分子的單克隆抗體，將細(xì)胞懸液經(jīng)特殊處 理后通過流式細(xì)胞分選儀，從而將SSCs分選出來。MACS和FACS雖分離富集SSCs的純度較高，但昂貴的儀器費(fèi)用使發(fā)明成本過高，這 使得力求深入研究SSCs的常規(guī)發(fā)明室來說望而卻步；而且SSCs在通過儀器前都需經(jīng)過一 定處理使之帶上儀器能識(shí)別的標(biāo)記，這種化學(xué)過程會(huì)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)造成一定的影響，操作不 當(dāng)甚至引起分化或凋亡；儀器分選細(xì)胞的效率不高，所需時(shí)間較長(zhǎng)，可導(dǎo)致細(xì)胞活力下降， 細(xì)胞狀態(tài)改變，這些并不適用于常規(guī)發(fā)明室大批量分選富集SSCs用于科研的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種小鼠精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，大大簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)分離富集步 驟，避免了分離富集持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)、多種消化酶對(duì)細(xì)胞刺激、較長(zhǎng)時(shí)間離心力作用以及各種 化學(xué)方式預(yù)處理導(dǎo)致的細(xì)胞活力不高、狀態(tài)下降等缺陷；同時(shí)未使用大型儀器設(shè)備，降低了 成本。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種小鼠精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)、小鼠精原干細(xì)胞分離小鼠的睪丸去除白膜后，收集生精小管，加入中性蛋白酶，在35-39 °C下消化 20-30分鐘，待消化液中出現(xiàn)白色絮狀漂浮物時(shí)收集消化液進(jìn)行離心，離心液去上清后洗 滌，然后用小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行重懸、篩分，篩分得到的濾液接種至含小鼠胚胎成纖 維細(xì)胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中；(2)、小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)與傳代
將小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)液加入到所述含小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中 培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞，培養(yǎng)2-3天后滴加中性蛋白酶至培養(yǎng)皿中，消化時(shí)間2_3s，輕微震蕩 培養(yǎng)皿使小鼠精原干細(xì)胞集落脫落，然后添加DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基使脫落的集落懸浮得懸液， 懸液進(jìn)行離心、再用小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，將重懸后的細(xì)胞懸液接種至新的小鼠胚 胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)。所述的小鼠的生精小管在消化前經(jīng)DPBS漂洗過2-3遍；所述的中性蛋白酶在35-39°C下消化期間要不時(shí)震蕩離心管或用移液槍反復(fù)吹吸；所述的離心液去上清后經(jīng) DMEM洗滌1-2次；所述的篩分是經(jīng)190-210目的尼龍篩過濾篩分；所述的小鼠精原干細(xì)胞在傳代前，將懸浮生長(zhǎng)的小鼠精原干細(xì)胞集落收集，用 DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌培養(yǎng)皿中細(xì)胞2-3遍，收集含精原干細(xì)胞集落的DMEM懸液至離心管 中，離心后去除上清液，收集精原干細(xì)胞集落，與中性蛋白酶消化2-3s后收集的小鼠精原 干細(xì)胞集落合并；所述的懸液進(jìn)行離心選用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為離心液進(jìn)行離心。現(xiàn)權(quán)利 要求2、3為原權(quán)利要求2的修改所述的小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)液為含占體積百分比8-12% FBS的α -MEM或占體 積百分比8-12% FBS的DMEM，8-12% FBS的α -MEM、8_12% FBS的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)含有占 體積百分比0. 9-1. 非必需氨基酸、0. 9-1. 1% L-谷氨酰胺、0. 9-1. 丙酮酸鈉、20ng/ mlGDNF ；所述的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)液為含占體積百分比8-12% FBS的 DMEM，無其他成分。本發(fā)明由于精原干細(xì)胞部分是懸浮生長(zhǎng)，故在傳代前需將懸浮生長(zhǎng)的集落收集； 用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2-3次是為了將半貼壁集落或貼壁不牢的集落收集。本發(fā)明所述的細(xì)胞傳代是指細(xì)胞正常生長(zhǎng)情況下，由于增殖到一定程度需進(jìn)一步 擴(kuò)充空間使新增殖分裂出來的細(xì)胞有地方生長(zhǎng)，需轉(zhuǎn)移一定量的細(xì)胞至新的培養(yǎng)皿中繼續(xù) 培養(yǎng)，這是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好的表現(xiàn)。本發(fā)明所述的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞來源為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；所 有干細(xì)胞需在飼養(yǎng)層上附著生長(zhǎng)，故在分離后的精原干細(xì)胞是在飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)；飼養(yǎng)層制 作具體包括以下步驟將貼壁匯合至90%的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF，mouse embryonal fibroblast cell)繼續(xù)用10 μ g/ml絲裂霉素c處理2. 5h，DPBS洗滌細(xì)胞5遍，用飼養(yǎng)層 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)并作為飼養(yǎng)層待用；飼養(yǎng)層培養(yǎng)液為含體積百分比為10% FBS的DMEM，無 其他成分。還可在本發(fā)明的基礎(chǔ)上再結(jié)合MACS或FACS輔助分選進(jìn)一步純化SSCs。本發(fā)明帶來的有益效果本發(fā)明采用中性蛋白酶II 一次性消化分離睪丸細(xì)胞，只需37°C水浴短暫消化，因 此簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)分離步驟、縮短了分離時(shí)間，并且減小酶對(duì)細(xì)胞的刺激、有效保證SSCs活力； 本發(fā)明將SSCs富集步驟與傳代有機(jī)結(jié)合，使用中性蛋白酶II短時(shí)間(2-3s)消化原代貼壁 的SSCs集落，并結(jié)合輕微震蕩培養(yǎng)皿可使SSCs集落脫落，雜細(xì)胞和飼養(yǎng)層不被消化下來， 從而達(dá)到較好的分離富集效果，即簡(jiǎn)化了富集步驟也避免了傳統(tǒng)富集方法時(shí)間過長(zhǎng)、細(xì)胞 活力不高的缺陷，降低了發(fā)明成本。本發(fā)明成功建立一種簡(jiǎn)便有效的分離培養(yǎng)小鼠精原干 細(xì)胞(小鼠精原干細(xì)胞)新方法，提高了小鼠精原干細(xì)胞分離效果，降低了分離富集成本， 為今后常規(guī)發(fā)明室深入研究精原干細(xì)胞功能機(jī)理以及在生殖醫(yī)學(xué)、家畜動(dòng)物性別控制和提高動(dòng)物轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)效率的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。


圖1是小鼠精原干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)24小時(shí)后小鼠精原干細(xì)胞的集落形態(tài)圖1。圖2是小鼠精原干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)24小時(shí)后呈葡萄串狀或念珠狀的小鼠精原 干細(xì)胞集落形態(tài)圖2。圖3是小鼠精原干細(xì)胞傳代3次后的小鼠精原干細(xì)胞集落形態(tài)圖。圖4是小鼠精原干細(xì)胞集落形態(tài)圖傳代4次后的小鼠精原干細(xì)胞集落形態(tài)圖。圖5是用α -MEM培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞的倒置相差顯微鏡圖片。圖6是用DMEM培養(yǎng)的小鼠精原干細(xì)胞效果圖。圖7是小鼠精原干細(xì)胞集落經(jīng)AKP染色后呈陽性圖片。圖8是免疫組化處理后小鼠精原干細(xì)胞集落的熒光顯微鏡圖。圖9是小鼠精原干細(xì)胞膜特異性表達(dá)蛋白C-Kit的熒光顯微鏡圖。圖10是小鼠精原干細(xì)胞膜特異性表達(dá)β rlntegrin蛋白的熒光顯微鏡圖。圖11是小鼠精原干細(xì)胞膜特異性表達(dá)Gfra-I蛋白的熒光顯微鏡圖。圖12是小鼠精原干細(xì)胞誘導(dǎo)分化4天后的形態(tài)圖。圖13是小鼠精原干細(xì)胞誘導(dǎo)分化8天后的形態(tài)圖。
具體實(shí)施例方式(1)、材料和試劑精原干細(xì)胞來源7日齡雄性ICR小鼠。飼養(yǎng)層細(xì)胞來源小鼠胚胎成纖維細(xì)胞懷孕12. 5天ICR母鼠胎兒；生精管來源 細(xì)胞7日齡雄性ICR小鼠睪丸組織生精管。試劑DPBS、lmg/ml中性蛋白酶、0. 01g/L明膠、10ug/ml絲裂霉素C、0. 25%胰蛋白 酶、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、20ng/ml⑶NF(膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)、溶液α-MEM(Gibco)、DMEM(Gibco)、胎牛血清(FBS，Hyclone,)、非必需氨基酸 (NEAA, Sigma,)培養(yǎng)基小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)液含體積百分比為10% FBS的α -MEM或含體積百分比為 10% FBS 的 DMEM ；10% FBS的α -MEM, 10% FBS的DMEM中均添加體積百分比為1 %非必需氨基酸、 體積百分比為L(zhǎng)-谷氨酰胺、體積百分比為丙酮酸鈉、20ng/ml⑶NF ；飼養(yǎng)層培養(yǎng)液含體積百分比為10% FBS的DMEM。(2)、具體步驟小鼠精原干細(xì)胞分離小鼠頸椎脫臼處死，酒精消毒后取睪丸，用DPBS將組織漂洗3遍；在DPBS中去除脂肪墊、微血管及附睪；在體視鏡下用眼科鑷剝離睪丸白膜，將游離 出來的生精小管撕成l_2mm3小塊或小段。采用一步酶消化法即離散的生精小管小段用DPBS漂洗2遍后移入離心管中，加入中性蛋白酶，37°C消化20-30min，期間不時(shí)震蕩離心管或用移液槍反復(fù)吹吸；待消化液中出現(xiàn)白色絮狀漂浮物時(shí)收集消化液800r/min離心3min，去上清液后用DMEM洗滌1次，用 小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸；將懸液用200目尼龍篩過濾；收集濾液，將其接種至含小鼠胚 胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中。小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)與傳代分別用α -MEM和DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)液培養(yǎng) 小鼠精原干細(xì)胞，每2-3天傳代1次。收集細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管中，用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌 細(xì)胞兩次，滴加少量中性蛋白酶至培養(yǎng)皿中，消化時(shí)間2-3s，期間輕拍培養(yǎng)皿的邊緣使小鼠 精原干細(xì)胞集落脫落；添加DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基使脫落的集落懸浮并回收至離心管中；SOOr/ min離心3min后用小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，輕輕吹打離散細(xì)胞后，將重懸后的細(xì)胞懸 液接種至新的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)。(3)、分離培養(yǎng)結(jié)果小鼠精原干細(xì)胞生長(zhǎng)特性及形態(tài)特征從睪丸經(jīng)中性酶消化離散的單個(gè)細(xì)胞接種至飼養(yǎng)層上，24h后可見一些由多個(gè)細(xì)胞聚集，形成細(xì)胞集落生長(zhǎng)于飼養(yǎng)層上，集落中的細(xì)胞大小均一、飽滿呈圓形，邊緣光滑有 折光性，DAPI染色表明核質(zhì)比高；細(xì)胞集落一般由三個(gè)至幾十個(gè)細(xì)胞聚集成團(tuán)或呈一字形 排列，細(xì)胞之間連接緊密呈葡萄串狀或念珠狀(見圖1，2)。傳代3次后，細(xì)胞集落體積進(jìn)一 步增大、細(xì)胞數(shù)量增多，集落細(xì)胞飽滿且葡萄串狀明顯，立體感增強(qiáng)(見圖3)。傳代4次后 細(xì)胞增殖較快，細(xì)胞集落狀態(tài)良好(見圖4)。不同培養(yǎng)基對(duì)小鼠精原干細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響分別用α -MEM和DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的全培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞，觀察細(xì)胞 集落生長(zhǎng)狀態(tài)的變化。結(jié)果顯示使用α-MEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的全培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠精原干細(xì) 胞，小鼠精原干細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好，主要表現(xiàn)為單個(gè)集落中所含細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞集落增 殖速度較快，細(xì)胞之間連接致密，形成較為緊湊的小鼠精原干細(xì)胞集落(見圖5)；以DMEM 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的全培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞，在其他條件相同的情況下小鼠精原干細(xì)胞 集落數(shù)量較少，體積較小，主要表現(xiàn)為細(xì)胞集落增殖速度較慢(見圖6)。小鼠精原干細(xì)胞的鑒定小鼠精原干細(xì)胞集落經(jīng)AKP染色后倒置顯微鏡下觀察呈深紫色，強(qiáng)陽性(見圖7)。 熒光顯微鏡觀察免疫組化處理后小鼠精原干細(xì)胞集落，結(jié)果顯示小鼠精原干細(xì)胞的Oct-4 蛋白為核特異性表達(dá)，與特異性核熒光染料DAPI的染色結(jié)果相一致(見圖8) ；c-Kit蛋白 為膜特異性表達(dá)，蛋白均勻分布于細(xì)胞膜上，使球形小鼠精原干細(xì)胞組成的集落立體感明 顯(見圖9)，P1-Integrin蛋白為膜特異性表達(dá)，呈彌散性分布于小鼠精原干細(xì)胞胞膜及 細(xì)胞之間連接區(qū)域(見圖10)，Gfr α -1蛋白為膜特異性表達(dá)，均勻分布于細(xì)胞膜上，使球形 小鼠精原干細(xì)胞集落立體感明顯(見圖11)。小鼠精原干細(xì)胞誘導(dǎo)分化精子樣細(xì)胞經(jīng)RA體外培養(yǎng)誘導(dǎo)24h，用含10% FBS的α-MEM繼續(xù)培養(yǎng)4d后，觀察到小鼠精 原干細(xì)胞集落部分細(xì)胞由圓形變?yōu)閳A錐形，一端出現(xiàn)尾巴樣小突起(見圖12)；再繼續(xù)培養(yǎng) 4d后圓錐形細(xì)胞增多，圓錐狀頭部膨大，尾巴樣小突起進(jìn)一步伸長(zhǎng)變?yōu)榧獯虪?見圖13)。
權(quán)利要求
一種小鼠精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)、小鼠精原干細(xì)胞分離小鼠的睪丸去除白膜后，收集生精小管，加入中性蛋白酶，在35-39℃下消化20-30分鐘，待消化液中出現(xiàn)白色絮狀漂浮物時(shí)收集消化液進(jìn)行離心，離心液去上清后洗滌，然后用小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行重懸、篩分，篩分得到的濾液接種至含小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中；(2)、小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)與傳代將小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)液加入到所述含小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞，培養(yǎng)2-3天后滴加中性蛋白酶至培養(yǎng)皿中，消化時(shí)間2-3s，輕微震蕩培養(yǎng)皿使小鼠精原干細(xì)胞集落脫落，然后添加DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基使脫落的集落懸浮得懸液，懸液進(jìn)行離心、再用小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，將重懸后的細(xì)胞懸液接種至新的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟 所述的小鼠的生精小管在消化前經(jīng)DPBS漂洗過2-3遍；所述的中性蛋白酶在35-39°C下 消化期間要不時(shí)震蕩離心管或用移液槍反復(fù)吹吸；所述的離心液去上清后經(jīng)DMEM洗滌1-2 次；所述的篩分是經(jīng)190-210目的尼龍篩過濾篩分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟 所述的小鼠精原干細(xì)胞在傳代前，將懸浮生長(zhǎng)的小鼠精原干細(xì)胞集落收集，用DMEM基礎(chǔ)培 養(yǎng)基洗滌培養(yǎng)皿中細(xì)胞2-3遍，收集含精原干細(xì)胞集落的DMEM懸液至離心管中，離心后去 除上清液，收集精原干細(xì)胞集落，與中性蛋白酶消化2-3s后收集的小鼠精原干細(xì)胞集落合 并；所述的懸液進(jìn)行離心選用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為離心液進(jìn)行離心。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小鼠精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于所述的小鼠精 原干細(xì)胞培養(yǎng)液為含8-12% FBS的α -MEM或含8-12% FBS的DMEM，8_12% FBS的α -MEM、 8-12% FBS的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)含有占體積百分比0. 9-1. 非必需氨基酸、0. 9-1. 1% L-谷 氨酰胺、0. 9-1. 丙酮酸鈉、20ng/mlGDNF ；所述的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)液為 含占體積百分比8-12% FBS的DMEM，無其他成分。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小鼠精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，利用中性蛋白酶消化性質(zhì)溫和、高效、對(duì)細(xì)胞刺激性小的特點(diǎn)分離小鼠精原干細(xì)胞，將小鼠精原干細(xì)胞的富集步驟與傳代有機(jī)結(jié)合，使用中性蛋白消化貼壁的小鼠精原干細(xì)胞集落，達(dá)到較好的富集效果。本發(fā)明具有分離培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短，效果好，且成本低的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/076GK101818127SQ201010138769
公開日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者丁建平, 任春環(huán), 劉亞, 劉旭光, 宋銳, 張子軍, 張運(yùn)海, 方富貴, 曹鴻國, 李運(yùn)生, 殷慧群, 章孝榮, 陶勇 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)