專利名稱：編碼豬α、β或γ干擾素的基因片段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼豬α、β或Y干擾素的基因片段及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來豬病毒性傳染病日益泛濫，已嚴重地威脅著我國畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展。免疫抑制病及病毒抗原快迅變異，常導(dǎo)致疫苗免疫失??；加之不斷出現(xiàn)新的病毒病，目前還尚無 成功的疫苗接種預(yù)防。另一方面，疫苗對疾病只有預(yù)防作用，治療還有賴于抗生素的使用。 而一些抗藥性菌株的出現(xiàn)，給人類食品和健康帶來極大的威脅，一些國家已明令禁止在養(yǎng) 殖生產(chǎn)中應(yīng)用某些抗生素和抗菌劑。因此，生產(chǎn)中迫切需要一種既有效又有利于環(huán)保的新 方法來防控畜禽疾病。實踐證明，干擾素作為一種廣譜的抗病毒劑，在病毒性傳染病的防控 方面具有廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法由中草藥等誘生劑誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，因純化工藝復(fù)雜，產(chǎn)量少、 作用緩和等諸多因素影響而極大限制了在臨床和科研的應(yīng)用。隨著豬干擾素基因的克隆成功，對其重組產(chǎn)物的臨床應(yīng)用及作用機理的研究也隨 之展開。1990年，Lefevre和LaBonnar等人在大腸桿菌中表達了 PoIFN-α 1基因，得到了 一個含189個氨基酸的前體蛋白，去除其N端的含23個氨基酸的信號肽后，得到了具有完 全天然PoIFN-α 1生物學(xué)活性的產(chǎn)物，并且其在豬源性細胞上的抗病毒活性至少是病毒刺 激豬白細胞產(chǎn)生的干擾素的6倍。Pol JM等(1991)研究發(fā)現(xiàn)rPoIFN-α 能夠抑制偽狂 犬病毒(PRV)強毒和中等毒力病毒在豬鼻腔黏膜組織stroma細胞層的增殖，PRV接種干擾 素處理的豬成纖維細胞和豬腎細胞，病毒滴度明顯下降。Horisberger MA(1992)比較了重 組PoIFN-α (rPoIFN-α)和重組PoIFN-γ (rPoIFN-y)在豬的細胞中抗病毒活性的區(qū)別， 發(fā)現(xiàn)rPoIFN-a可大大降低豬水泡性口炎病毒(VSV)在豬PK-15上引起的病變，并能削弱 豬水泡性口炎病毒(VSV)和流感病毒在豬腎細胞中的復(fù)制，但rPoIFN-a和rPoIFN-γ對 門戈病毒(一種腦心肌炎病毒)都有抗病毒作用。Jordan LT等(1994)發(fā)現(xiàn)rPoIFN-α對 傳染性胃腸炎病毒(TGEV)有很好的預(yù)防作用。Tonomura N等(1996)研究發(fā)現(xiàn)HuIFN-α 處理Vero后PRV的增殖受到抑制，PRV的立即早期基因的mRNA在干擾素處理的Vero中降 低，瞬時表達試驗表明PRV IE啟動子的轉(zhuǎn)錄被選擇性抑制。BuddaertW(1998)對rPoIFN- α 在體內(nèi)、外對豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒(PRRSV)的抗病毒活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)PRRSV 在體內(nèi)、外對rPoIFN-α都很敏感，rPoIFN-α可明顯抑制PRRSV的產(chǎn)量和感染細胞的數(shù)量。 chinsangaram J.等(2001)人用大腸桿菌表達rPoIFN-α或rPolFN-β并分別進行了抗 口蹄疫病毒(FMDV)實驗，發(fā)現(xiàn)rPoIFN-α和rPoIFN-β抑制FMDV復(fù)制是在蛋白質(zhì)翻譯水 平上的，主要是激活雙鏈RNA依賴性蛋白激酶(PKR)作用的結(jié)果在細胞中加入PKR抑制劑 2_氨基嘌呤后，病毒的產(chǎn)量就會上升；而RNase L和PKR基因缺失的細胞在干擾素的作用 下仍能感染FMDV，這充分說明了 PKR在抑制病毒復(fù)制中起作用。我國學(xué)者也對豬α干擾素進行了多項研究。曹瑞兵等(2004)克隆了一種新的豬 IFN-α基因并在大腸桿菌中進行了其成熟蛋白的單純表達，表達產(chǎn)物具有較高的抗病毒活性。杜以軍等利用豬IFN-α的成熟蛋白基因構(gòu)建了重組腺病毒質(zhì)粒pAd-PoIFN-α轉(zhuǎn)染HEK-293A細胞，滴度為107TCID5(1/mL。RT-PCR證明目的基因在mRNA水平上可有效表達；在 PK-15細胞上可以檢測到較強的抗豬口蹄疫病毒活性，從而為研究豬口蹄疫免疫防治新技 術(shù)奠定了重要基礎(chǔ)。謝海燕等(2004)克隆了豬IFN-α基因，構(gòu)建了原核表達載體，初步對 其進行了原核表達研究；我國學(xué)者夏春等(2005)報道了用PQE30表達載體在大腸桿菌原核 表達的rPoIFN- α在豬源細胞和非豬源細胞系上可顯著抑制CSFV、PRRSV和VSV的增殖，證 明了原核表達PoIFN-α的可行性及將基因工程原核表達的PoIFN-α真正用于生產(chǎn)實踐中 作為抗病毒制劑可行性。曹瑞兵等對豬IFN-α 1基因進行了改造，在保留編碼蛋白序列的 同時，使用了大腸埃希菌的偏愛密碼子，將合成的豬IFN-α 1成熟蛋白編碼基因插入原核 單純表達載體PRLC中，實現(xiàn)了豬IFN-α 1在大腸埃希菌中的高效表達，且重組豬IFN-α 1 具有較高的抗病毒活性，約為6.4X106U/mg。此外，葛麗等(2005)克隆了豬IFN-α基因，構(gòu) 建了真核表達載體，初步對其做了畢赤酵母分泌表達研究。劉占通等對丹系長白和法系長 白、英系大白和法系大白豬IFN-α基因進行克隆，得到了上述4個品系的豬IFN-α基因， 證明核苷酸同源性均在97. 2%以上，氨基酸同源性均在92. 8%以上。在豬β干擾素基因研究方面，2000年夏春等首次對豬干擾素β基因進行分子克 隆與測序，克隆片段長668個核苷酸，編碼186個氨基酸。其中，76 636位含有1個0RF， 蛋白分子量為21.8KU。除此之外，溫納相(2005)和彭貴青(2005)也對豬干擾素β的基因 進行了分子克隆與測序，并檢測其生物活性。在表達方面，曹瑞兵(2004)和吳陽(2006)分別對豬β干擾素的基因進行了原核 表達，表達量分別為17. 3%和18%，表達產(chǎn)物均為融合蛋白。其中曹瑞兵用重組豬β干擾 素處理豬腎傳代細胞ΡΚ-15后，細胞病變抑制法(CPE5tl)測定結(jié)果表明，重組豬β干擾素可 顯著抑制豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)的感染。而后， 為了研制高活性的重組豬β干擾素，曹瑞兵(2006)對豬干擾素β進行畢赤酵母偏嗜性 改造并構(gòu)建了酵母表達質(zhì)粒pPICZaA-PIB，pPICZ a A-PIB電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母菌株X_33 后經(jīng)甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵高產(chǎn)量分泌表達豬IFN-β，其中Bl株酵母的IFN-β產(chǎn)量最高，約為 2. 5X 105U/mL，其表達量約為60 μ g/mL,比活為4. 17X 106U/mg。將發(fā)酵上清液用PEG20000 濃縮后進行SDS-PAGE和Western-blot檢測，結(jié)果表明表達產(chǎn)物是分子量約為28Ku和25Ku 蛋白的混合物，兩者均可與豬IFN-β陽性抗血清發(fā)生特異反應(yīng)。表達產(chǎn)物比豬IFN-β理 論推導(dǎo)分子量(約20.8KU)大，推測可能是表達產(chǎn)物發(fā)生了不同程度的糖基化。重組豬 IFN-β對偽狂犬病毒在細胞中增殖可呈現(xiàn)抑制作用，并且豬IFN-β對偽狂犬病毒在牛腎 細胞(MadenDarby Bovine Kidney cells, MDBK)上早期增殖的抑制效果最為明顯。在豬Y干擾素基因研究方面，IFN-Y雖然只有一種基因，但其結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，如 編碼人和鼠IFN-Y的基因長約6Kb，各包含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。IFN-Y與I型 干擾素(IFN-α與IFN-β)田在基因和蛋白質(zhì)水平上沒有明顯的相關(guān)性(DeGrad0，et al, 1991)。雖然IFN-γ具有其它干擾素大多數(shù)的生物學(xué)活性，但在特異性抗病毒活性方面比 IFN-α和IFN-β要低10-100倍，而在免疫調(diào)節(jié)活性方面要高100-10000倍(Pace，et al, 1985)。豬IFN-Y全基因編碼166個氨基酸殘基，其中包括20aa的信號肽(Dijkmans，et al，1990)。信號肽切除后，產(chǎn)生146個氨基酸的IFN-Y單體，分子量為17. 3ku，天然活性狀 態(tài)的IFN-γ是由兩個IFN-γ單體經(jīng)非共價交聯(lián)形成的同源二聚體糖蛋白((Boehnuetal，1997)。豬IFN- γ與人、小鼠、貓和犬的IFN- γ分別具有60 %，41 %，72 %和72 %的同源性， 而與IFN-β及IFN-α家族沒有明顯的同源性(Farrar and Schreiber，1993)。國外最早于1990年由Roger等從基因水平開展了對豬Y干擾素的研究，他們以 人Y干擾素的cDNA為探針，克隆了豬γ干擾素基因，發(fā)現(xiàn)與人Y干擾素在DNA和氨基酸 的水平上分別有75%和59%的同源性(Dijkmans et al.，1990)。隨后，Vandenbroeck等 利用原核表達系統(tǒng)表達了豬Y干擾素(Vandenbroeck et al.，1991)。
在我國，郭鐮軍等于2001年首次克隆報道了豬γ干擾素基因序列(郭稼軍等， 2001)。迄今為止，夏春，曹瑞兵(吳文學(xué)等，2002 ；曹瑞兵等，2003 ；曹瑞兵等，2004)等人以 原核系統(tǒng)表達的干擾素具有較好的生物學(xué)活性。曹瑞兵等從經(jīng)刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)誘導(dǎo)培養(yǎng)的豬外周血白細胞中擴增出豬IFN-γ基因，經(jīng)改造后插入原核表達載體 pRLC，并實現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達。表達產(chǎn)物以包涵體形式存在，經(jīng)變性、復(fù)性、脫 鹽、凝膠層析純化處理，重組豬IFN-Y具有較高的干擾素活性。趙英杰等成功構(gòu)建了表達 重組豬IFN-γ的大腸埃希氏菌基因工程菌株，亞細胞定位分析表明，目的蛋白經(jīng)原核表達 后主要以不溶性包涵體形式存在，其他少量可溶性目的蛋白存在于細胞漿中。其對長白豬 Y-干擾素基因的原核表達與分析，說明幾種我國地方豬IFN-Y在基因的核苷酸以及蛋白 的氨基酸水平上不存在差異和突變，同時也證實了長白豬干擾素-Y基因的正確、完整克 隆。為了研究和應(yīng)用豬重組干擾素-Y預(yù)防和治療病毒性疫病，夏春將大白豬IFN-Y基因 插入到酵母整合載體PHIL-S1，構(gòu)建了重組GS115工程菌。經(jīng)過SDS-PAGE、Western-blot分 析和抗水泡性口炎病毒(VSV)活性測定，證實豬IFN-Y分子量為18Ku，在GS115中的表達 量為18%，具有抗VSV的活性。用豬IFN-Y處理豬肺巨噬細胞系Marc-145后，經(jīng)細胞病變 抑制法測定，豬IFN-γ可以抵抗豬藍耳病病毒(Porcinelteproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)感染。但以上技術(shù)均具有原基因密碼子的表達量低、抗病毒活性低的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是依據(jù)畢赤酵母表達系統(tǒng)密碼子的偏嗜性，選擇高表達密碼子對豬 α、β和Y干擾素成熟肽核苷酸序列進行基因修飾和改造，并構(gòu)建出重組酵母表達質(zhì)粒 pPICZa C-IFN-α、pPICZa C-IFN-β 和 pPICZ a C-IFN-γ，其可以在畢赤酵母中對豬 α、β 和Y干擾素正確且高效表達。密碼子改造后所分泌的蛋白干擾素具有更好的抗病毒活性。干擾素具有很高的生物活性，Img即具有1億個活性單位?；蛑亟M豬α、β干 擾素都屬于I型干擾素，具有廣譜抗病毒活性；基因重組豬Y干擾素屬于II型干擾素，具 有很好的免疫調(diào)節(jié)作用。通過基因工程方法，根據(jù)密碼子的偏嗜性，重新合成豬α、β、Υ 三種干擾素基因核苷酸序列，在優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件的基礎(chǔ)上，提高干擾素蛋白在畢赤酵母 菌中的表達量，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。因此，在本發(fā)明基礎(chǔ)上，豬α、β、Υ三種干 擾素推廣應(yīng)用前景廣闊。本發(fā)明提供了一種編碼豬α干擾素的基因片段，其具有如SEQ IDN0. 1所示的核 苷酸序列。用于擴增其序列的上游引物Pa1具有如SEQID NO. 2所示的核苷酸序列；下游 引物Pa2具有如SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于構(gòu)建可表達豬 α干擾素的重組畢赤酵母。
本發(fā)明還提供了一種編碼豬β干擾素的基因片段，其具有如SEQID NO. 4所示的 核苷酸序列。用于擴增其序列的上游引物P、具有如SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列；下 游引物Ρβ2具有如SEQ ID Ν0.6所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于構(gòu)建可表達 豬β干擾素的重組畢赤酵母。本發(fā)明還提供一種編碼豬Y干擾素的基因片段，其具有如SEQ IDN0.7所示的核苷酸序列。用于擴增其序列的上游引物P Y1具有如SEQID NO. 8所示的核苷酸序列；下游 引物PY2具有如SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于構(gòu)建可表達豬 Y干擾素的重組畢赤酵母。構(gòu)建重組酵母時，采用的表達載體優(yōu)選是pPICZ α C，重組質(zhì)粒優(yōu)選是 pMD-IFN- α、pMD-IFN- β 禾口 pMD—IFN— γ。與傳統(tǒng)方法的表達的干擾素相比，本發(fā)明通過研究，達到了表達量高，成本較低， 效價較高，質(zhì)量穩(wěn)定，因此為產(chǎn)品轉(zhuǎn)化創(chuàng)造了先決條件，具有很好的市場潛力和較強的市場 競爭力，更易在規(guī)?；i場中廣泛推廣應(yīng)用?；蛑亟M的豬α干擾素具有很好的抗病毒作 用，可以單獨使用治療多種豬病毒性疾??；將表達的豬Y干擾素作為疫苗佐劑，與不同的 疫苗聯(lián)合，可以研制出免疫效果更好的新型疫苗，將對豬病毒性疾病防治產(chǎn)生積極的影響。 因此，本發(fā)明在市場上具有良好的應(yīng)用前景。在預(yù)防和治療豬病毒性疾病方面具有潛在的 應(yīng)用價值。本發(fā)明通過精心設(shè)計，對豬三種干擾素進行了基因修飾和改造，經(jīng)顯示系統(tǒng)表 明，密碼子改造后所分泌蛋白豬三種干擾素具有更好的抗病毒活性。


圖1是本發(fā)明實施例的PoIFN- α改造前后的氨基酸序列關(guān)聯(lián)性；圖2是本發(fā)明實施例的PoIFN- α改造前后的堿基序列關(guān)聯(lián)性；圖3是本發(fā)明實施例的PoIFN-β改造前后的氨基酸序列關(guān)聯(lián)性；圖4是本發(fā)明實施例的PoIFN- β改造前后的堿基序列關(guān)聯(lián)性；圖5是本發(fā)明實施例的PoIFN- γ改造前后的氨基酸序列關(guān)聯(lián)性；圖6是本發(fā)明實施例的PoIFN- γ改造前后的堿基序列關(guān)聯(lián)性。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施 例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。(一)基因改造應(yīng)用DNASTAR (Version 5. 0)基因分析軟件，參照NCBI GenBank上登載的豬干擾 素α基因成熟肽核苷酸序列(ΑΥ331298)、豬干擾素β基因成熟肽核苷酸序列(S41178)和 豬干擾素Y基因成熟肽序列(EU249804)，參照趙翔等畢赤酵母菌的密碼子用法分析以及 TaKaRa公司的Pichia酵母密碼子表等，按照該序列氨基酸順序不變，因此表達的蛋白質(zhì)不 發(fā)生變化，同時根據(jù)畢赤酵母表達系統(tǒng)密碼子的偏嗜性，選擇高表達密碼子重新設(shè)計新序 列，送由大連寶生物工程有限公司重新合成序列。1、豬α干擾素新序列，如SEQ ID NO. 1所示，共501bp ；編碼166個氨基酸，如SEQ ID NO. 10 所示。
引物Pa1(SEG) ID NO. 2) :CG GAATTC CTGTGACTTGCCACAAACCCACT(標有下劃線處為EcoRI限制性內(nèi)切酶)P a 2(SEQ ID NO. 3) :GG GGTACC TTACTCCTTCTTTCTCAATCTG(標有下劃線處為KpnI限制性內(nèi)切酶)上、下游引物的理論跨幅為518bp，退火溫度58°C
2、豬β干擾素新序列，如SEQ ID NO. 4所示，共498bp ；編碼165個氨基酸，如SEQ ID NO.11 所示。P β ！ (SEQ ID NO. 5) :CG GAATTC CATGTCCTACGACGTCT(標有下劃線處為EcoRI限制性內(nèi)切酶)P β 2(SEQ ID Ν0. 6) :GG GGTACC TTAGTTTCTCAAGTAGTCG(標有下劃線處為KpnI限制性內(nèi)切酶)上、下游引物的理論跨幅為513bp，退火溫度52°C3、豬γ干擾素新序列，如SEQ ID N0. 7所示，共432bp ；編碼143個氨基酸，如SEQ ID N0.12 所示。P y ！ (SEQ ID N0. 8) :CG GAATTC CCAG GCT CCA TTT TTC AA(標有下劃線處為EcoRI限制性內(nèi)切酶)P y 2 (SEQ ID N0. 9) :GG GGTACC TTA CTT GGA GGC TCT CTG AC(標有下劃線處為KpnI限制性內(nèi)切酶)上、下游引物的理論跨幅為449bp，退火溫度50. 7V(二)重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建(以 pPICZ a C-IFN- α 為例，pPICZ a C-IFN- β、 pPICZ a C-IFN- y 與此相同)1、重組質(zhì)粒與表達載體的雙酶切對重組質(zhì)粒pMD-IFN- α進行EcoR I和Kpn I雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系如下_IOXM Buffer10 μ LEcoR I7 μ LKpn I7 μ LpMD-IFN- a40 μ LddH2036 μ L_Total 100 μ L_將上述成分加入0. 5mL的Eppendorf管中，混勻，37°C酶切過夜。_20°C保存?zhèn)溆谩?同時對表達載體pPICZ α C進行EcoR I和Kpn I雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系同上。2、酶切產(chǎn)物的回收和純化參照OMEGA公司的DNA凝膠回收試劑盒(Ε. Ζ. N. A GelExtraction KitI)使用說 明書進行。具體步驟如下將IOOyL酶切產(chǎn)物于1.0%的低熔點的瓊脂糖凝膠中電泳。電泳結(jié)束后，在紫外燈下用干凈的刀片迅速將目的片段從瓊脂糖凝膠中切下，置于一個新的1. 5mL 的Eppendorf管中。加入等倍于凝膠體積的Binding Buffer,在55 65 °C水浴溫 育約7min，每隔1 2min混合一次，直至瓊脂糖凝膠完全溶解。將液體移至黃色的 HiBincTDNAMinicolumn 管中，下套 2mL Collection Tubes, 12，000r/min 離心 lmin，棄 去 Collection Tubes 中的廢液。往 HiBind DNA Minicolumn 管中加入 300 μ L Binding Buffer, 12，000r/min 離心 lmin，棄去 Collection Tubes 中的廢液。往 HiBincTDNA Minicolumn 管中加入 700 μ L 的 DNA Wash Buffer,靜置 2 3min，12，000r/min 離心 lmin 洗柱，棄濾液。重復(fù)步驟(5) —次，空管離心lmin。將HiBincTDNAMinicolumn管移至新的 1. 5mLEppendorf 管中。加入 30 μ L 的 ElutionBuffer, 12，000r/min 離心 lmin,離心所得溶 液于-20°C保存。 3、目的基因片段與載體質(zhì)粒的連接_T4Buffer1 μ LT4DNA 連接酶1 μ L目的基因片段7yL載體質(zhì)粒酶切回收片段IyL_總體積IOyL_將上述各組分加入0. 5mLEppendorf管中，離心混勻，置溫箱中16°C過夜連接。4、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取上面的連接產(chǎn)物10 μ L加到50 μ L大腸桿菌DH5 α的感受態(tài)細胞懸液中，輕輕 吹勻，冰浴30min，另取50 μ L的感受態(tài)細胞懸液不加質(zhì)粒作空白對照。42°C熱應(yīng)激90s，迅 速冰浴5min。加入ImL LB T培養(yǎng)液，37°C搖床上120 130r/min培養(yǎng)45min。5，000r/ min離心5min，棄去上清800 μ L，剩余的重懸菌泥并涂布于LB Zeocin+培養(yǎng)基平皿上，置 37°C溫箱中放置約30min至表面液體吸收完全后，倒置培養(yǎng)16 18h。設(shè)置對照組A組為 ZeocirT對照組，培養(yǎng)基中不含Zeocin ，接種DH5 α，觀察細菌生長情況；B組為Zeocin+對 照組，培養(yǎng)基中含有Zeocin (25 μ g/mL)，接種DH5 α，觀察細菌對Zeocin 的藥敏性。5、重組表達質(zhì)粒的PCR鑒定對LB Zeocin+培養(yǎng)基平皿上長出的可疑菌落，接種于2mL含ZeocinTM (25 μ g/mL) 低鹽LB液體培養(yǎng)基中，37°C 250r/min振搖培養(yǎng)過夜，從菌液中抽提質(zhì)粒。以重組質(zhì)粒DNA 為模板，加入目的片段的特異性引物進行PCR鑒定。以重組質(zhì)粒DNA為模板，在0. 5mL的 Eppendorf管中依次加入以下成分_IOXPCR Buffer2. 5 μ LdNTPs0· 5 μ LP α 1 (P y 1)0. 3 μ LP α 2 (P γ 2)0. 3 μ LpPICZ α C-IFN-αLOyL
EX Taq 酶0. 3 μ LddH2020. 1 μ L_Total 25 μ L_上述混合液瞬時離心混勻，陽性質(zhì)粒命名為pPICZ α C-IFN- α。6、重組質(zhì)粒pPICZ α C-IFN-α的單酶切鑒定用限制性內(nèi)切酶Sac I對經(jīng)PCR檢測為陽性的重組質(zhì)粒進行單酶切鑒定，反應(yīng)體系如下_IOXL Buffer2. 0 μ LSac Il.OyLpPICZ α C-IFN- α5. 0 μ LddH2012. 0μ L_Total 20 μ L_酶切反應(yīng)體系置于37°C恒溫水浴過夜后，于0. 8%瓊脂糖凝膠中低壓電泳檢測結(jié)^ ο7、重組質(zhì)粒pPICZ α C-IFN-α的雙酶切鑒定用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Kpn I對經(jīng)PCR檢測為陽性的重組表達質(zhì)粒進行雙酶 切鑒定，反應(yīng)體系如下_IOXM Buffer2. 0 μ LEcoRI0. 5μ LKpn I0. 5μ LpPICZ α C-IFN- α5. 0 μ LddH2012. 0μ L_Total 20. 0μ L_將上述各組分加入0. 5mL的EP管中，混勻，放置水浴鍋中37 °C酶切4h，經(jīng)0. 8 %瓊 脂糖凝膠電泳檢測。8、重組表達質(zhì)粒pPICZ α C-IFN-α目的基因的序列測定(三)攜帶目的基因的重組酵母的構(gòu)建1、畢赤酵母Χ-33感受態(tài)細胞的制備根據(jù)Invitrogen公司實驗手冊進行，用無菌牙簽挑取單菌落PichiaPastoris X-33接種于5mL的YPD培養(yǎng)液中，28 30°C振蕩培養(yǎng)過夜。取部分過夜培養(yǎng)物(按0. 的比例)重新接種于50mL的YPD培養(yǎng)液中，28 30°C振蕩培養(yǎng)直至菌液OD6tltl = 1. 2 1. 5。4°C,8, 500r/min離心5min收集菌體，用50mL預(yù)冷的滅菌水重懸菌體。同樣離心收 集菌體，用25mL預(yù)冷的滅菌水重懸菌體。離心后用2mL預(yù)冷的lmol/L的山梨醇重懸菌體， 4°C,8, 500r/min離心5min收集菌體。最后用50 80 μ L預(yù)冷的lmol/L的山梨醇重懸菌 體，即得到感受態(tài)酵母細胞，用于當天電轉(zhuǎn)化，不要凍存細胞。2、重組質(zhì)粒pPICZaC-IFN-a的線性化及回收根據(jù)Invitrogen公司實驗手冊進行，用Sac I單酶切pPICZ a C_IFN_ a，使之線性化，酶切反應(yīng)體系如下_IOXL Buffer5. 0 μ LSac I2. 5μ LpPICZ α C-IFN-α15. 0μ LddH2027. 5μ L_Total 50 μ L_同時對空載體pPICZ α C也進行線性化，體系同上。將上述各組分加入Eppendorf管中，混勻，放置水浴鍋中37°C酶切8h。電泳檢測 線性化完全后，進行目的基因的回收純化。3、重組質(zhì)粒pPICZ α C-IFN-α的電擊轉(zhuǎn)化取80 μ L新鮮制備的感受態(tài)酵母細胞與20 μ L線性化的重組質(zhì)粒輕輕混勻。轉(zhuǎn)入 預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯(Eppendorf公司，IOOyL)中冰浴5min。設(shè)定電轉(zhuǎn)化參數(shù)為1500V。電轉(zhuǎn)化 后立即加入ImL預(yù)冷的lmol/L的山梨醇，輕輕混勻后將轉(zhuǎn)化物移入5mL的培養(yǎng)管。30°C 靜置培養(yǎng)1. Oh,然后加入ImL YPD液體，30°C，200r/min振蕩培養(yǎng)1. Oh。離心收集菌體，用 50 200 μ L YPD重懸并鋪于新鮮制備的YPDS平板(含100 μ g/mL Zeocin )上，將平板 倒置，于30°C溫箱中培養(yǎng)3 5d。4、重組酵母菌菌液PCR鑒定用滅菌牙簽細挑YPDS平板上生長的具有Zeocin 抗性的單菌落，接種于ImL的 YPDS液體培養(yǎng)基中(含200 μ g/mL Zeocin )，30°C，200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。將pPICZ α C-IFN-α轉(zhuǎn)化的重組酵母、pPICZ α C轉(zhuǎn)化的重組酵母以及未轉(zhuǎn)化酵 母Χ-33在YPD液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 20h后，冰浴5min, 5，000r/min離心5min后棄去上 清；菌泥用破菌緩沖液重懸，同樣離心棄去上清后，加入200 μ L酵母裂解液重懸菌泥，并加 入等體積的0. 5mm酸洗玻璃珠和等體積的Tris飽和酚，旋渦器上振蕩3min ；12, 000r/min 離心IOmin后取上清，上清中加入等體積的異丙醇，4°C作用至少lOmin，沉淀DNA ；12, OOOr/ min離心棄上清，75%的乙醇和無水乙醇洗滌后晾干，加入40μ L雙蒸水(含RNase)溶解備 用。重組酵母DNA的快速提取本實驗也用到這種方法將篩選得到的重組高拷貝菌 株，取單菌落中少量菌放入Eppendorf管中，加100 μ L的滅菌水，100°C煮lOmin，消解酵母 菌細胞壁，然后放入液氮凍30min，100°C煮lOmin，12，000r/min離心取上清液，以其中少量 基因組DNA作模板，進行PCR鑒定。
_10XPCR Buffer2. 5 μ LdNTPs0. 5μ LΡ30. 3μ LΡ40. 3μ LpPICZ α C-IFN-αLOyLEXTaq 酶0· 3 μ LddH2020. 1 μ L_Total 25 μ L_PoIFN-α反應(yīng)程序94°C預(yù)變性4min，然后再開始以下循環(huán)94°C 30s，50°C30s， 72°C 30s，運行30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。PCR結(jié)束后，各取5 μ LPCR產(chǎn)物用0.8%的 瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀中觀察結(jié)果。(四)高抗性整合子的初步誘導(dǎo)表達用滅菌牙簽細挑YPDS平板上生長的具有Zeocin 抗性的單菌落，挑于ImL的YPDS 液體培養(yǎng)基中(含200 μ g/mLZeocin )，30°C，200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。用滅菌牙簽細挑YPDS平板上生長的具有Zeocin 抗性的單菌落，挑于20mL的 BMGY液體培養(yǎng)基中進行激活培養(yǎng)，300C，200r/min振蕩過夜，至0D_ = 2 6，此時細胞處 于對數(shù)生長期。1500 3000r/min室溫離心5min收集沉淀，重懸于ImL的BMMY中，繼續(xù) 振蕩培養(yǎng)，用四層干凈的紗布外加兩層報紙包扎，在15mL的試管中振蕩培養(yǎng)。每間隔24h 加入100%甲醇至終濃度為1%，進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)至96h收集樣品，離心，取上清立即作 SDS-PAGE分析或置于-70°C保存。(五)表達產(chǎn)物的檢驗1、表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析培養(yǎng)至96h收集樣品，離心，取上清立即作SDS-PAGE分析。2、表達產(chǎn)物的Western-blot分析(β干擾素市場上無商品化的單抗)取上清進行Western-blot分析，分別以小鼠抗豬α、Y干擾素單克隆抗體為一 抗，山羊抗小鼠-IgG-HRP為二抗，對轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上的表達蛋白進行處理，DAB顯色。(六)豬α、β和Υ干擾素蛋白質(zhì)含量的檢測對誘導(dǎo)表達產(chǎn)物上清進行SDS-PAGE蛋白電泳，然后進行染色脫色，置于薄層掃描 儀進行灰度掃描，通過Labwork軟件系統(tǒng)來分析，利用牛血清蛋白做定量對照，來計算樣品 總蛋白含量及其總蛋白中豬干擾素的有效含量，不同樣品的灰度掃描相對值的測定結(jié)果。結(jié)果如下PoIFN-α泳道總蛋白總蛋白濃度為77. 654mg/LPoIFN-α 有效蛋白濃度為 54. 105mg/L樣品中豬IFN-α的有效含量占樣品總蛋白含量的百分比PoIFN-α 54. 105/77. 654X100%^ 69. 67%PoIFN-β泳道總蛋白濃度為84. 75mg/L
PoIFN-β 有效蛋白濃度為 66. 98mg/L樣品中豬IFN-β的有效含量占樣品總蛋白含量的百分比PoIFN-β 66. 98/84. 75X100%^ 79. 03%PoIFN-Y泳道總蛋白濃度為100. 44mg/LPoIFN- γ 有效蛋白濃度為 79. 976mg/L樣品中豬IFN-Y的有效含量占樣品總蛋白含量的百分比PoIFN-Y 79. 976/100. 44X100%^ 79. 63%VSV 滴度的測定 105_5TCID5Q/mL表達的豬α干擾素效價未經(jīng)改造是1. 817x106U/L,經(jīng)改造的效價為5. 87 X IO7U/ L0表達的豬β干擾素效價未經(jīng)改造是3. 52x106U/L,經(jīng)改造的效價為1. 02 X IO8U/ L表達的豬、干擾素效價未經(jīng)改造是1. 01xl06U/L,經(jīng)改造的效價為1. 60 X IO7U/ L0(七)全部的序列關(guān)聯(lián)性PoIFN- α改造前后表達的氨基酸序列不發(fā)生變化，變化的只是核苷酸的堿基排列 順序(密碼子改造)，由圖1和圖2可知，改造前后，表達的蛋白沒有發(fā)生變化，堿基序列相 似性只有78.6%,變化有25.8%。PoIFN- β改造前后表達的氨基酸序列不發(fā)生變化，變化的只是核苷酸的堿基排列 順序(密碼子改造)，由圖3和圖4可知，改造前后，表達的蛋白沒有發(fā)生變化，堿基序列相 似性只有78.5%,變化有25.8%。PoIFN-Y改造前后表達的氨基酸序列不發(fā)生變化，變化的只是核苷酸的堿基排列 順序(密碼子改造)，由圖5和圖6可知，改造前后，表達的蛋白沒有發(fā)生變化，堿基序列相 似性只有75.5%,變化有30. 7%0以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種編碼豬α干擾素的基因片段，其特征在于，具有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的基因片段，其特征在于，用于擴增其序列的上游引物Pa工具有 如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；下游引物P Ci2具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的基因片段在構(gòu)建可表達豬α干擾素的重組畢赤酵母中的應(yīng)用。
4.一種編碼豬β干擾素的基因片段，其特征在于，具有如SEQ IDN0.4所示的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的基因片段，其特征在于，用于擴增其序列的上游引物Pii1具有 如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；下游引物P β 2具有如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求4或5所述的基因片段在構(gòu)建可表達豬β干擾素的重組畢赤酵母中的應(yīng)用。
7.一種編碼豬Y干擾素的基因片段，其特征在于，具有如SEQ IDN0.7所示的核苷酸序列。
8.如權(quán)利要求7所述的基因片段，其特征在于，用于擴增其序列的上游引物PY工具有 如SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列；下游引物P Y2具有如SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求7或8所述的基因片段在構(gòu)建可表達豬γ干擾素的重組畢赤酵母中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求3或6或9所述的應(yīng)用，其特征在于，采用的表達載體是pPICZa C，重 組質(zhì)粒是 pMD-IFN- a、pMD-IFN- β、或 pMD-IFN- γ。
全文摘要
本發(fā)明依據(jù)畢赤酵母表達系統(tǒng)密碼子的偏嗜性，選擇高表達密碼子重新設(shè)計合成新的豬α、β和γ干擾素成熟肽核苷酸序列。成功地構(gòu)建了重組酵母表達質(zhì)粒pPICZαC-IFN-α、pPICZαC-IFN-β和pPICZαC-IFN-γ，不僅在畢赤酵母中對豬α、β和γ干擾素實現(xiàn)了正確表達，而且使豬α、β、γ三種干擾素在畢赤酵母菌中表達更容易，表達量更高，為基因工程大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12R1/84GK101818154SQ20101013948
公開日2010年9月1日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者劉健, 唐明森, 張欣, 羅滿林, 陳瑞愛 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué);廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司