專利名稱：一種用于結(jié)核病預(yù)防的新型疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域和新型結(jié)核疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種重組的卡介苗。
背景技術(shù)：
結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種傳染病，近年來隨著流 動人口增加、人類免疫缺陷病毒(HIV)與結(jié)核桿菌伴發(fā)感染以及結(jié)核桿菌多重耐藥性菌株 的出現(xiàn)，使全球結(jié)核病疫情增高，給全球結(jié)核病的防治提出了新的挑戰(zhàn)?？ń槊?Bacille CalmetteGuerin,BCG)是目前唯一用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗，但是其免疫保護(hù)效果極不穩(wěn)定， 不同地區(qū)的人群接種BCG后其免疫保護(hù)作用差異很大(保護(hù)率為0-80%不等)，開發(fā)比BCG 更為有效的抗結(jié)核病疫苗已成為當(dāng)今迫切需要解決的問題。但目前尚沒有任何一種新型疫 苗能完全替代BCG免疫，因此對卡介苗進(jìn)行分子改造，研制更為安全有效的新型抗結(jié)核病 疫苗具有重要意義。BCG作為一種活疫苗，應(yīng)用于免疫力低下的人群(如HIV感染者或艾 滋病患者等)有較大的局限性，而將外源基因?qū)肟ń槊鐦?gòu)建重組卡介苗(rBCG)是TB疫 苗改造的重要方向之一，通過BCG的生長繁殖，在體內(nèi)表達(dá)保護(hù)性抗原，從而更有效地激發(fā) 機(jī)體免疫應(yīng)答，增強(qiáng)BCG的免疫效果。Horwitz在BCG菌株中引入編碼MTB 30kD主要分泌 型和細(xì)胞外蛋白(Ag85B)的質(zhì)粒來觀察rBCG的效力，發(fā)現(xiàn)rBCG均能穩(wěn)定表達(dá)這種蛋白分 子，與親本BCG免疫的豚鼠相比，rBCG免疫的豚鼠盡管體重變化不明顯，但動物存活率和組 織抑制細(xì)菌生長的能力均超過BCG，已計(jì)劃開始進(jìn)行I期人體試驗(yàn)。Bao構(gòu)建了兩株分別表 達(dá)Hsp60-ESAT6融合蛋白和ESAT6分泌蛋白的rBCG，前者比BCG誘導(dǎo)更高滴度的特異性抗 體和更強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，而后者的免疫原性與親本BCG株相似，兩株rBCG的毒力未見 增強(qiáng)，都能明顯抵御MTB感染，但免疫保護(hù)效力方面尚低于BCG。培養(yǎng)濾液蛋白10 (culture filtrate proteinlO, CFP10)是從結(jié)核分枝桿菌短期 培養(yǎng)的濾液中分離的一種低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，與ESAT6均由RD (Regions of deletion, RD) 1 區(qū)的RV3875和RV3874基因編碼，該區(qū)只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和少數(shù)致病性分枝桿 菌基因組中，所有BCG菌株基因組中均缺乏該區(qū)域，是BCG減毒傳代過程中最先缺失的一段 區(qū)域，與結(jié)核分枝桿菌毒力和抗原性相關(guān)，能被宿主免疫系統(tǒng)高度識別。CFP10能有效刺激 機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，可以誘發(fā)PPD皮膚試驗(yàn)陽性者的外周血單個(gè)核細(xì)胞出現(xiàn)增 殖反應(yīng)并產(chǎn)生IFN-y，繼而活化巨噬細(xì)胞，提高巨噬細(xì)胞對胞內(nèi)結(jié)核菌的生長抑制作用和 殺傷能力，可望成為新疫苗研制的主要候選分子。機(jī)體對結(jié)核病的免疫主要通過ra4+T、細(xì)胞等的細(xì)胞免疫來完成，BCG是一 種強(qiáng)的CD4+T細(xì)胞型免疫應(yīng)答誘導(dǎo)劑，但它誘導(dǎo)MHCI類限制性CD8+T細(xì)胞的作用較弱， 這可能是BCG的主要缺陷之一，而細(xì)胞可通過多種機(jī)制在宿主防御結(jié)核桿菌感染 和潛伏感染中發(fā)揮重要作用。粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factorGM-CSF)是一種能夠刺激粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞形成集落的細(xì)胞因 子，可調(diào)控粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞的分化、增殖和存活，激活單核_巨噬細(xì)胞、釋放炎性介 導(dǎo)因子，殺死某些微生物和腫瘤，在造血調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。GM-CSF在體內(nèi)外都能影響巨噬細(xì)胞的活性，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞發(fā)育，作為免疫佐劑已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)領(lǐng) 域。例如用抗原-GM-CSF融合蛋白和轉(zhuǎn)染GM-CSF基因的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫；利用GM-CSF 作為佐劑的動物模型試驗(yàn)均表明，GM-CSF能增強(qiáng)感染的免疫原性。由于GM-CSF能誘導(dǎo)強(qiáng) 的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，可以彌補(bǔ)卡介苗功能上的缺陷，選擇其作為佐劑與結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu) 勢抗原CFP10共同轉(zhuǎn)入卡介苗，構(gòu)建能表達(dá)人GM-CSF和結(jié)核分枝桿菌CFP10蛋白的重組卡 介苗可能具有更好的免疫原性和保護(hù)力，對今后結(jié)核新疫苗的開發(fā)、發(fā)病機(jī)制的研究及結(jié) 核病的防治有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
1、本發(fā)明的目的是提供一種重組卡介苗的制備方法。根據(jù)Genbank中報(bào)道的hGMCSF和CFP10基因CDS序列設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增hGMCSF 和 CFP10 基因，用 S0E 法(重疊延伸，Gene splicing by overlap extension)進(jìn)一步擴(kuò)增 GMCSF-CFP10嵌合基因，將此嵌合基因與大腸桿菌-結(jié)核分支桿菌穿梭質(zhì)粒PMV361同時(shí)雙 酶切插入穿梭質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)處，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒rpMV361GMCSF-CFP10，先用卡那霉 素篩選陽性重組子，再用PCR、酶切及基因序列分析進(jìn)行鑒定。PCR、酶切及測序結(jié)果均顯示， 在穿梭質(zhì)粒PMV361中插入了一個(gè)735bp的特異性片段，與預(yù)期的GMCSF-CFP10嵌合基因大 小一致，重組穿梭表達(dá)載體構(gòu)建成功。將-70°C凍存的BCG菌株快速解凍后，迅速轉(zhuǎn)移至37°C預(yù)熱的Sauton培養(yǎng)基中， 放入37°C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)4-5周，待菌膜長出，直至菌體恢復(fù)正常生長狀態(tài)，菌體呈白色或 略帶黃色，有皺褶并覆蓋整個(gè)培養(yǎng)基液面，將其轉(zhuǎn)種并擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌膜覆蓋滿液面后用于 電轉(zhuǎn)化。將測序正確的重組質(zhì)粒rpMV361GMCSF-CFP10用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入至感受態(tài)BCG 中，構(gòu)建rBCG:GMCSF-CFP10重組卡介苗。通過卡那霉素篩選陽性重組子，一方面提取重組 卡介苗的基因組行PCR鑒定，另一方面，通過熱誘導(dǎo)的方法，用小鼠抗hGM-CSF單克隆抗體 進(jìn)行Western-blot分析，觀察其蛋白表達(dá)水平。以提取具有卡那霉素抗性的重組BCG菌 的基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出735bp的目的片段，證明重組質(zhì)粒pMV GMCSF-CFP10已成功 轉(zhuǎn)化進(jìn)BCG菌；重組BCG經(jīng)熱誘導(dǎo)后，菌體裂解液上清用小鼠抗CFP10單克隆抗體為一抗， HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，經(jīng)ECL顯色后顯示在27kDa左右出現(xiàn)一特異性的條帶，和目 的蛋白的預(yù)期分子量吻合，而PMV361空質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化組(rBCG:361)未出現(xiàn)陽性條帶，表明重 組BCG可以表達(dá)GMCSF-CFP10外源目的蛋白，重組卡介苗rBCG:GMCSF_CFP10構(gòu)建成功。2、本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種效果優(yōu)于目前市售卡介苗的重組卡介苗。取6周齡的BALB/C小鼠32只(雌雄不限)，每組8只，隨機(jī)分為PBST組、BCG組、 rBCG:361組和rBCG:GMCSF_CFP10組，各組適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，于背部皮下多點(diǎn)分別注射 PBST、BCG 及 rBCG(5X106CFU/ 只，用 PBST 稀釋成 0. lmL)，共免疫 1 次。免疫后 6、8、10、12 周四個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組隨機(jī)抽取小鼠2只，摘眼球取血，分離血清，檢測各組小鼠血清特異性抗 體滴度。同時(shí)無菌分離脾臟，收集脾淋巴細(xì)胞，經(jīng)臺盼藍(lán)染色后細(xì)胞計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)在90% 以上，調(diào)整細(xì)胞密度為2X106/L進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)(1)特異性脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)分離培養(yǎng)的脾細(xì)胞加入96孔圓底培養(yǎng)板，每組 小鼠脾細(xì)胞做6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)陰性對照孔和調(diào)零孔，試驗(yàn)孔加入25mg/L TB-PPD,對照孔不 加特異性蛋白，調(diào)零孔不加淋巴細(xì)胞。于37°C 5% C02培養(yǎng)68小時(shí)后加入XTT再培養(yǎng)4h，
4用酶標(biāo)儀測定A450吸光值，結(jié)果用刺激指數(shù)表示，SI =刺激組/非刺激組。
(2)細(xì)胞因子的誘生上述分離培養(yǎng)的脾細(xì)胞加入24孔圓底培養(yǎng)板(0. 5mL/孔)， 每組小鼠脾細(xì)胞做3個(gè)復(fù)孔，25mg/L TB-PPD刺激72h后，收集培養(yǎng)液上清，按ELISA檢測試 劑盒說明書測定IFN- y和IL-4水平。(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞⑶4+及⑶8+細(xì)胞亞群脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)入6孔板， 每組做3個(gè)復(fù)孔(lmL/孔)，同時(shí)加入25mg/L TB-PPD刺激，培養(yǎng)72h后，加入PE熒光素標(biāo) 記的抗小鼠CD4+和FITC標(biāo)記的⑶/抗小鼠一抗，流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞表面⑶/及 ⑶/細(xì)胞亞群所占比例。結(jié)果顯示，免疫后6、8、10、12周rBCG: 361組和卡介苗組各時(shí)間點(diǎn)血清總抗體滴度 相差不明顯，而rBCG:GMCSF-CFP10組免疫小鼠的抗體滴度明顯高于rBCG:361組和卡介苗 組，在第8周達(dá)到高峰，然后逐漸降低，但仍然高于卡介苗組和rBCG:361組；各免疫組脾淋 巴細(xì)胞增殖活性均較PBST組明顯升高，在第10周時(shí)達(dá)到最高，rBCG:361組和卡介苗組比 較，刺激指數(shù)差異不顯著，而rBCG:GMCSF-CFP10組脾淋巴細(xì)胞增殖活性顯著高于卡介苗組 和rBCG:361組；各免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞上清IFN- y水平均較PBST明顯升高，10周達(dá)到高 峰，rBCG:GMCSF-CFP10組IFN- y含量顯著高于卡介苗組和rBCG:361組；各組IL-4濃度均 維持在較低水平，各組間無顯著性差異；卡介苗組、rBCG:361組和重組BCG:GMCSF_CFP10組 小鼠脾淋巴細(xì)胞CD4+T細(xì)胞較PBST組相比均有增高的趨勢，在免疫后10周達(dá)到最高，其中， 卡介苗組和rBCG:361組CD4+T細(xì)胞的比例相當(dāng)，而重組卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10組CD4+T 細(xì)胞比例在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯高于其它各組，重組BCG:GMCSF-CFP10組小鼠脾淋巴細(xì)胞
細(xì)胞比例自免疫8周就明顯增加，至12周達(dá)到最高，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)CD8+T細(xì)胞比例均顯著高 于其它組。體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)均提示重組BCG:GMCSF-CFP10免疫原性強(qiáng)于BCG。本發(fā)明的疫苗具有以下優(yōu)勢1、重組表達(dá)了人GM-CSF和結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢抗原CFP10。2、將人GM-CSF基因與CFP10通過基因工程技術(shù)融合在一起。3、能穩(wěn)定的在卡介苗中表達(dá)外源蛋白GMCSF-CFP10。4、重組疫苗的免疫原性優(yōu)于傳統(tǒng)卡介苗。


圖1為hGMCSF基因、CFP10基因和GMCSF-CFP10嵌合基因的PCR圖。1，DNA分子 量標(biāo)準(zhǔn)；2，hGMCSF 條帶；3，CFP10 條帶；4，GMCSF-CFP10 條帶。圖2為rpMV361 GMCSF-CFP10的PCR及酶切鑒定圖。1，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2，PCR鑒 定；3，pMV361 空質(zhì)粒雙酶切；4，rpMV GMCSF-CFP10 單酶切；5，rpMV361 GMCSF-CFP10 雙酶 切。圖 3 為 rBCG:GMCSF-CFP10 基因組 PCR 鑒定圖。1，DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；2，GMCSF-CFP10條帶。圖4為pMV361的質(zhì)粒圖譜。圖 5 為 Western-blot 檢測 rBCG:GMCSF_CFP10 細(xì)胞裂解液中 GMCSF-CFP10 蛋 白表達(dá)圖。1，rBCG:361菌體蛋白Western-blot檢測。2，rBCG:GMCSF_CFP10菌體蛋白 Western-blot 檢測。
圖6為血清特異性抗體滴度IgG。圖7 為血清 IgG2a/IgGl。圖8為免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。圖9為脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN- Y水平。圖10為免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞⑶4細(xì)胞百分比。圖11為免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞⑶8細(xì)胞百分比。圖12為免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群分析。1，PBST組；2，BCG組；3，rBCG:361組；4， rBCG:GMCSF-CFP10 組。
具體實(shí)施例方式1、以pORF-hGMCSF質(zhì)粒和結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組序列為模板，根據(jù)發(fā)表的人 粒_巨噬細(xì)胞集落刺激因子CDS序列和結(jié)核分枝桿菌H37Rv株CFP10基因序列分別設(shè)計(jì)人 GM-CSF和CFP10基因的引物，克隆人GM-CSF和結(jié)核分枝桿菌CFP10基因。2、通過基因工程手段，將克隆的人GMCSF和CFP10基因末端加上連接肽段，獲得 GMCSF-CFP10嵌合基因。3、將嵌合基因轉(zhuǎn)入pMV361穿梭質(zhì)粒，構(gòu)建rpMV361 GMCSF-CFP10重組質(zhì)粒。4、提取重組質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定。5、運(yùn)用電轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入卡介苗，構(gòu)建重組卡介苗GMCSF-CFP10。6、用卡那霉素進(jìn)行初步篩選。7、提取重組卡介苗的基因組并進(jìn)行PCR鑒定。8、通過熱誘導(dǎo)的方法誘導(dǎo)重組卡介苗表達(dá)蛋白并用Western-blot的方法鑒定。9、分別用重組卡介苗、傳統(tǒng)卡介苗和PBS免疫小鼠，觀察并分析各組小鼠的體液 免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。實(shí)施例實(shí)施例1 hGMCSF-CFPIO嵌合基因重組卡介苗的構(gòu)建、表達(dá)與鑒定1 材料1. 1菌株及質(zhì)粒BCG上海株由成都生物制品研究所提供，質(zhì)粒PMV361由本室保存，pORF_hGMCSF質(zhì) 粒購自Invitrogen公司。1. 2主要試劑prime STAR HS DNA 聚合酶、dNTP、DNA 連接試劑盒是 Takara 公司產(chǎn)品；EcoR I、 HindHI及蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自晶美公司；Omega質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒及 膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒購自寶信生物；CFP10單克隆抗體為Abeam公司產(chǎn) 品；HRP酶標(biāo)羊抗鼠IgG和ECL顯色試劑盒購自北京中杉公司。1. 3主要儀器PCR儀、電轉(zhuǎn)儀購自百樂公司，低溫冰箱購自三洋公司。2 方法2. 1人GM-CSF和結(jié)核分枝桿菌CFP10基因的PCR擴(kuò)增根據(jù)Genbank中報(bào)道的hGMCSF和CFP10基因⑶S序列設(shè)計(jì)2對引物，引物序列為
6hGMCSF 上游5，-CG GAATTC ACATGTGGCTGCAGAGCCTG-3，，hGMCSF 下游5，-GTCTTCATCTCTGCC ATCTCCTGGACTGGCTCCC-3’,上游黑體字是EcoR I的酶切位點(diǎn)，下游刪除終止密碼子TGA，下 劃線部分是含有17個(gè)堿基的linker序列。CFP10上游5’-GGGAGCCAGTCCAGGAGATGGCAGAGA TGAAGAC-3，，CFP10 下游5，_GC AAGCTT TCAGAAGCCCATTTGCG-3，，上游下劃線部分是含有 17 個(gè)堿基互補(bǔ)的linker序列，下游黑體字是Hind III的酶切位點(diǎn)。以pORF_hGMCSF質(zhì)粒和結(jié) 核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板，分別PCR擴(kuò)增hGMCSF基因和CFP10基因。hGMCSF 基因 PCR 擴(kuò)增體系總體積為 50ii L，5Xprime STAR Buffer 10 u L, dNTP 4u L(dATP, dGTP, dCTP, dTTP 各 lOmmoL/L)，pORF-hGMCSF 質(zhì)粒 DNA 1 u L, hGMCSF 基因上下游引物各 1 u L, prime STAR HS DNA Polymerase 1U，去離子水 32. 5 ii L。PCR 反應(yīng)條件如下95°C 預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，60°C復(fù)性45秒，72°C延伸1分鐘，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10 分鐘。CFP10 PCR 擴(kuò)增體系總體積為 50ii L，5Xprime STAR Buffer 10 u L, dNTP 4u L, H37Rv 株基因組DNA 1 ii L，CFP10 基因上下游引物各 1 ii L，prime STAR HS DNAPolymerase 1U，去離子水32. 5ii L，PCR反應(yīng)條件同上，擴(kuò)增得到下游帶linker的hGMCSF基因和上游帶 linker 的 CFP10 基因。2. 2GMCSF-CFP10嵌合基因的擴(kuò)增與純化取設(shè)計(jì)的hGMCSF基因上游引物1 P L，CFP10基因的下游引物1 P L，以上述擴(kuò)增的 hGMCSF 和 CFP10 的 PCR 產(chǎn)物各 1 u L 為模板，dNTP 4 u L, 5 X prime STAR Buffer 10 u L, prime STAR HS DNA Polymerase 1U,去離子水 31. 5 ii L，總體積 50 ii L，用 S0E 法擴(kuò)增 GMCSF-CFP10嵌合基因。PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性45秒，68°C復(fù)性1分 鐘，72°C延伸1分30秒，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘。將GMCSF-CFP10嵌合基因PCR產(chǎn)物 用柱式膠回收試劑盒純化，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照說明書。2. 3 重組質(zhì)粒 rpMV361GMCSF-CFP10 的構(gòu)建用質(zhì)粒提取試劑盒提取PMV361空質(zhì)粒，和上述GMCSF-CFP10嵌合基因純化產(chǎn)物分 別用EcoR I和Hind III進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系為:pMV361空質(zhì)粒5 y L，5 X Tango buffer 4u L, EcoRI 0. 5u L, Hind III0. 5u L,總體積 20 u L ；GMCSF-CFP10 嵌合基因 PCR 純化產(chǎn)物 5u L,5XTangobuffer 4u L, EcoR I 0. 5 u L, Hind III0. 5 ii L，總體積 20 ii L。反應(yīng)條件 37°C水浴5小時(shí)。純化空質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的雙酶切產(chǎn)物，按照PCR 空質(zhì)粒濃度比1 10 的比例混合，再加入等體積的連接試劑，輕輕混勻后，16°C連接3小時(shí)。取5 y L連接液加入 至50 ii L DH5a感受態(tài)菌液中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，42 °C水浴靜置90秒，取出迅速轉(zhuǎn)入 至冰浴中2分鐘，加入不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基250P L，37°C緩慢振搖60分鐘，取轉(zhuǎn)化 后的菌液100 u L鋪于含卡那霉素50 u g/mL的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)。2. 4 重組質(zhì)粒 rpMV361GMCSF-CFP10 的鑒定隨機(jī)挑取3個(gè)生長菌落分別接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素50 u g/ mL)，37°C振搖過夜，提取質(zhì)粒后電泳初步觀察質(zhì)粒DNA大小。取較空質(zhì)粒略大者進(jìn)行PCR 鑒定，其中陰性對照以PMV361為模板，待檢樣本則以含有插入片段的重組質(zhì)粒DNA為模板 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為hGMCSF上游和CFP10下游，PCR反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)同前述，另一方 面用EcoR I和Hindlll雙酶切消化，電泳檢測有無插入片段及其大小。初步鑒定重組質(zhì)粒 插入片段大小與預(yù)期相符后，將重組質(zhì)粒送至Invitrogen公司進(jìn)行DNA序列分析，測序引 物分別為hGMCSF上游和CFP10下游。
2. 5 重組卡介苗 rBCG:GMCSF-CFP10 的構(gòu)建將-70°C凍存的BCG菌株快速解凍后，迅速轉(zhuǎn)移至37°C預(yù)熱的Sauton培養(yǎng)基中， 放入37°C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)4-5周，待菌膜長出，直至菌體恢復(fù)正常生長狀態(tài)，菌體呈白色或 略帶黃色，有皺褶并覆蓋整個(gè)培養(yǎng)基液面，將其轉(zhuǎn)種并擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌膜覆蓋滿液面后用于 電轉(zhuǎn)化。37°C靜置培養(yǎng)于Sauton培養(yǎng)液約20天的卡介苗于轉(zhuǎn)化前加入甘氨酸至終濃度為 4%,繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。用無菌玻璃珠振搖3小時(shí)以打碎菌膜。冰浴1小時(shí)后，4000rpm 4°C 離心10分鐘集菌，菌團(tuán)用預(yù)冷的10%甘油洗滌4次后重懸于10%甘油中。取200 y L菌液 加入10 ii L重組質(zhì)粒，冰浴30分鐘，轉(zhuǎn)入預(yù)冷2mm電穿孔杯中，在2. 5KV/cm, 25 u F，720 Q 條件下電轉(zhuǎn)化。放電完畢后立即冰浴10分鐘，輕柔加至10mL Sauton培養(yǎng)液中，37°C靜置 培養(yǎng)。待長出菌膜后轉(zhuǎn)入含20 u g/mL卡那霉素的Sauton培養(yǎng)液中，于37°C繼續(xù)靜置培養(yǎng) 3 4周。2. 6 重組卡介苗 rBCG:GMCSF-CFP10 的鑒定待菌膜長滿液面后，離心集菌，依據(jù)基因組提取試劑盒提取重組卡介苗總DNA，以 其為模板按前述擴(kuò)增條件，分別以hGMCSF上游和CFP10下游為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。含外源 基因的重組卡介苗在Sauton培養(yǎng)液(含20 y g/mL卡那霉素)中靜置培養(yǎng)兩周，迅速加入 等體積53°C的Sauton培養(yǎng)液，置45°C水浴熱誘導(dǎo)30分鐘。5000rpm離心15分鐘集菌。菌 體用冰預(yù)冷的PBS(pH7.2)洗滌2次，振蕩混勻，超聲波裂解菌體40分鐘，-20°C備用。根據(jù) Laemmli等介紹的方法，依次灌制12%的分離膠5mL和5%的濃縮膠2mL，待膠完全凝固后， 將上述制備的蛋白樣品及蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)各取10 y L上樣于梳齒孔中進(jìn)行電泳，先80V 穩(wěn)壓電泳至分離膠，再120V電泳至結(jié)束。電泳完畢后，剝下凝膠塊，先剪與凝膠塊相同大小 的2張濾紙和1張硝酸纖維素膜。連同凝膠塊一起浸入轉(zhuǎn)移電泳緩沖液(25mmoL/L Tris, 0. 2moL/L氨基乙酸，20%甲醇)中浸泡30分鐘，然后在BR10592型半干轉(zhuǎn)移裝置的陽極 板上依次平鋪濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠、濾紙，蓋上陰極板，接通電源，于10V穩(wěn)壓電泳45 分鐘；取出硝酸纖維素膜，將膜置5%脫脂奶粉中封閉1小時(shí)后用TTBS(10mM/L Tris-HCl, 150mmoL/L NaCl,0. 05% Tween20, pH7. 5)室溫輕搖洗滌3X5分鐘，然后浸入含小鼠抗 CFP10單克隆抗體(1 1000)的一抗中于室溫孵育2小時(shí)，TTBS洗膜3X5分鐘，浸入含辣 根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(l 5000)的二抗稀釋液中，室溫孵育1小時(shí)；TTBS洗 膜3X5分鐘，ECL顯色，觀察嵌合蛋白在卡介苗中的表達(dá)。3 結(jié)果3. 1人GM-CSF基因、結(jié)核分枝桿菌CFP10基因和GMCSF-CFP10嵌合基因的擴(kuò)增以設(shè)計(jì)的GM-CSF基因上下游為引物，通過PCR方法從p0RF_hGMCSF質(zhì)粒獲得 449bp的人GM-CSF基因片段(不含終止密碼子)，以CFP10基因上下游為引物，從結(jié)核分枝 桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組DNA中獲得320bp的結(jié)核分枝桿菌CFP10基因，以GM-CSF基因上 游、CFP10基因下游為引物，GM-CSF和CFP10基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增得到735bp的特異性片段，與 預(yù)期的GMCSF-CFP10嵌合基因大小一致(見圖1)。3. 2 重組質(zhì)粒 rpMV361GMCSF-CFP10 的鑒定以抗生素篩選陽性重組子提取的質(zhì)粒為模板，以GM-CSF基因上游、CFP10基因下 游為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)用EcoR I.Hindi 11雙酶切該重組質(zhì)粒，均證實(shí)有大小為735bp 的目的片段插入PMV361質(zhì)粒(見圖2)，測序結(jié)果和GenBank中人GM-CSF基因、結(jié)核分枝桿
8菌CFP10基因序列比對，均100%匹配，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。3. 3重組BCG的PCR鑒定以提取具有卡那霉素抗性的重組BCG菌的基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出735bp的 目的片段，證明重組質(zhì)粒pMV GMCSF-CFP10已成功轉(zhuǎn)化進(jìn)BCG菌(圖3)。3. 4重組BCG表達(dá)產(chǎn)物的Westrn-blot分析重組BCG經(jīng)熱誘導(dǎo)后，菌體裂解液上清用CFP10單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的 羊抗鼠IgG為二抗，經(jīng)ECL顯色后顯示在27kDa左右出現(xiàn)一特異性的條帶，和目的蛋白的 預(yù)期分子量吻合，而空質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化組(rBCG:361)未出現(xiàn)陽性條帶，表明重組BCG可以表達(dá) GMCSF-CFP10外源目的蛋白(見圖5)，重組卡介苗rBCG:GMCSF_CFP10構(gòu)建成功。4 結(jié)論運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建能表達(dá)hGMCSF-CFPIO外源蛋白的重組卡介苗 BCG:GMCSF-CFP10。實(shí)施例2重組卡介苗rBCG:GMCSF_CFP10免疫原性研究1 材料1. 1實(shí)驗(yàn)動物BALB/C小鼠購自四)I丨大學(xué)華西校區(qū)實(shí)驗(yàn)動物中心。1. 2主要試劑IFN- y、IL-4ELISA檢測試劑盒購自R&D公司，PE標(biāo)記的CD4和FITC標(biāo)記的CD8抗 小鼠一抗購自eBioscience公司，RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司。1. 3主要儀器FACSCalibur 流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad)。2 方法2. 1動物免疫取6周齡的BALB/C小鼠32只(雌雄不限)，每組8只，隨機(jī)分為PBST組、BCG組、 rBCG:361組和rBCG:GMCSF_CFP10組，各組適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，于背部皮下多點(diǎn)分別注射 PBST (含 0. 05 % Tween80)、BCG 及 rBCG (5 X 106CFU/ 只，用 PBST 稀釋成 0. lmL)，共免疫 1 次。 免疫后觀察動物注射部位有無紅腫、潰瘍、化膿等，同時(shí)觀察動物皮毛、精神狀態(tài)、飲食及大 小便。2. 2血清特異性抗體水平檢測免疫后6、8、10、12周四個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組隨機(jī)抽取小鼠2只，摘眼球取血，待血液固體 成分凝結(jié)固縮，離心吸取血清，分裝后-70°C凍存?zhèn)溆谩Ｓ肨B-PPD標(biāo)準(zhǔn)品(lOOyL/孔)包 被酶標(biāo)板，4°C避光過夜。PBST洗滌，5%脫脂奶粉封閉90分鐘，再次洗滌后依次加入2倍 系列稀釋的待檢血清，37°C溫育90分鐘，洗板后分別加入1 1000稀釋的HRP酶標(biāo)記羊抗 鼠IgG、IgGl和IgG2a，再次37°C溫育90分鐘，洗板，加入底物液(含0. 4mg/mL鄰苯二胺的 0. 05M磷酸鹽-檸檬酸緩沖液，pH5. 0，臨用前加5uL 30% H202/10mL) 100 u L/孔，室溫避 光15-30分鐘。加入50 u L/孔H2S04(2M)終止反應(yīng)，于波長490nm測定吸光度。實(shí)驗(yàn)中以 PBST組為空白對照、以rBCG-361及BCG組血清為陰性對照，以結(jié)核病人血清作為陽性對照 (1 100稀釋)，檢測各組小鼠血清特異性抗體滴度。結(jié)果以雙復(fù)孔A值均值表示，當(dāng)A值 > 0. 05，A實(shí)驗(yàn)組/A對照組> 2. 0時(shí)，判為陽性，以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度作為該樣本
9的抗體滴度。2. 3脾淋巴細(xì)胞分離免疫后6、8、10、12周各組隨機(jī)抽取2只小鼠，無菌分離脾臟，同組脾臟混合后，用 玻璃勻漿器研磨，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，PBS洗滌1-2次，加入0. 83%NH4C1溶液(0. 15M NH4C1, 10mMNaHC03, ImM EDTA_Na2)混勻后靜置5分鐘以裂解紅細(xì)胞，1500rpm離心5分鐘，收集細(xì) 胞，加入含10% FBS和雙抗的RPMI1640，經(jīng)臺盼藍(lán)染色后細(xì)胞計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)在90%以上， 調(diào)整細(xì)胞密度為2X106/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2. 4特異性脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)(XTT)將上述分離培養(yǎng)的脾細(xì)胞加入96孔圓底培養(yǎng)板(0. lmL/孔)，每組小鼠脾細(xì)胞做 6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)陰性對照孔和調(diào)零孔，試驗(yàn)孔加入25mg/L TB-PPD,對照孔不加特異性蛋白， 調(diào)零孔不加淋巴細(xì)胞。于37°C 5 % C02培養(yǎng)68小時(shí)后加入XTT (含lmg/mL XTT和0. 125mmoL/ L PMS)再培養(yǎng)4h，用酶標(biāo)儀測定A450吸光值，結(jié)果用刺激指數(shù)表示，SI =刺激組/非刺激組。2. 5細(xì)胞因子的誘生將上述分離培養(yǎng)的脾細(xì)胞加入24孔培養(yǎng)板(0. 5mL/孔)，每組小鼠脾細(xì)胞做3個(gè) 復(fù)孔，25mg/L TB-PPD刺激72h后，3000rpm離心5分鐘收集培養(yǎng)液上清，_70°C凍存?zhèn)溆?，?ELISA檢測試劑盒說明書測定IFN-Y和IL-4水平。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品各孔的0D值及其所對應(yīng)的 標(biāo)準(zhǔn)品含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測樣品孔0D值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出樣本中IFN-Y和 IL-4的含量。采用方差分析對各組的測得值進(jìn)行差異顯著性分析，P < 0. 05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)
眉、o2. 6流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞⑶/及細(xì)胞亞群將上述分離培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)入6孔板，每組做3個(gè)復(fù)孔(lmL/孔)，同時(shí) 加入25mg/L TB-PPD刺激，培養(yǎng)72h后，3000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，細(xì)胞 懸液加入PE熒光素標(biāo)記的抗小鼠CD4+和FITC標(biāo)記的CD8+抗小鼠一抗(eBioscience)，4°C 避光 30min，再用 PBS_BSA_NaN3 (含 2% BSA 和 0. 5% NaN3 的 PBS)洗滌 2 次，再加入 400 u L PBS-BSA-NaN3，流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞表面⑶/及細(xì)胞亞群所占比例。3 結(jié)果3. 1血清特異性抗體滴度測定rBCG:361組和卡介苗組在各時(shí)間點(diǎn)血清抗體滴度相差不明顯(P > 0. 05)，而重組 BCG:GMCSF-CFP10組免疫小鼠的抗體滴度明顯高于rBCG:361組和卡介苗組，在8周時(shí)達(dá)到 高峰，然后逐漸回落，但仍顯著高于卡介苗組和rBCG: 361組(P < 0. 05)(見圖6)。BCG組和 rBCG:361組血清特異性IgG2a/IgGl比值在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)變化趨勢基本一致，6周時(shí)IgG2a/ IgGl在1.5左右，然后逐漸降低，8-10周降至最低，12周比值稍有增高，rBCG:361組高于 BCG 組；rBCG:GC 組血清 IgG2a/IgGl 在 6 周時(shí)較低，8、10、12 周 IgG2a/IgGl 均高于 rBCG: 361 組和BCG組，12w升至增高(見圖7)。3. 2特異性淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)各組經(jīng)皮下免疫小鼠后，脾淋巴細(xì)胞增殖活性均較PBST組明顯升高，且有增高的 趨勢，并在第10周時(shí)達(dá)到最高，隨后逐漸降低；其中，rBCG:361組和卡介苗組比較，刺激指 數(shù)差異不顯著(P > 0. 05)，而重組BCG:GMCSF-CFP10組脾淋巴細(xì)胞增殖活性顯著高于卡介
10苗組和 rBCG:361 組(P < 0. 05)(見圖 8)。3. 3細(xì)胞因子的誘生各免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-Y水平均較PBST明顯升高，且有增高的趨勢，在免疫 后10周達(dá)到高峰，隨后逐漸降低；其中，rBCG:361組和卡介苗組比較，IFN-Y產(chǎn)生差別不 大(P> 0.05)，而重組BCG:GMCSF-CFP10組脾淋巴細(xì)胞IFN-y產(chǎn)生顯著高于卡介苗組和 rBCG:361組(P < 0.05)(見圖9)。而各組細(xì)胞因子IL-4在各時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生均不明顯，未達(dá) 到試劑盒檢測的最低濃度，0D值維持在0. 015左右。3. 4免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群的變化卡介苗組、rBCG:361組和重組BCG:GMCSF_CFP10組小鼠脾淋巴細(xì)胞CD4+T細(xì)胞與 PBST組相比均有增高的趨勢，在免疫后10周達(dá)到最高，其中，卡介苗組和rBCG: 361組
細(xì)胞的比例相當(dāng)(P > 0. 05)，而重組卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10組細(xì)胞比例明顯高于 PBST組、卡介苗組rBCG: 361組(P < 0. 05)(見圖10) ；BCG:GMCSF_CFP10組小鼠脾淋巴細(xì)胞 細(xì)胞比例在各時(shí)間點(diǎn)也顯著高于其它組，至12周細(xì)胞比例達(dá)到最高(P < 0. 05) (見圖 11，12)。4 結(jié)論共表達(dá)人GMCSF和結(jié)核分枝桿菌CFP10外源蛋白的重組卡介苗rBCG GMCSF-CFP10 免疫原性優(yōu)于傳統(tǒng)卡介苗，為研制具有特異性抗結(jié)核桿菌免疫保護(hù)和佐劑增強(qiáng)雙重效應(yīng)的 新型重組BCG疫苗奠定了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
一種重組卡介苗rBCGGMCSF-CFP10，其特征在于，能夠穩(wěn)定的表達(dá)GMCSF-CFP10嵌合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的重組卡介苗，其特征在于，免疫原性強(qiáng)于傳統(tǒng)卡介苗。
3.如權(quán)利要求1所述的重組卡介苗的制備方法，其特征在于，該方法包括以下幾個(gè)步驟(1)hGM-CSF基因的擴(kuò)增、結(jié)核分枝桿菌CFPlO基因的擴(kuò)增；(2)GMCSF-CFP10嵌合基因的擴(kuò)增；(3)將GMCSF-CFP10嵌合基因插入至大腸桿菌-結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pMV361中，構(gòu) 建rpMV361GMCSF-CFP10 ；(4)將(3)中的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入卡介苗。
4.如權(quán)利要求1所述的重組卡介苗，其特征在于，通過抗生素篩選、提取基因組、PCR及 誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行Western-blot鑒定，得到rBCG :GMCSF_CFP10。
5.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，用基因工程技術(shù)將人粒_巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (hGM-CSF)序列和結(jié)核分枝桿菌CFPlO基因序列嵌合后插入大腸桿菌-結(jié)核分枝桿菌穿梭 質(zhì)粒序列中。
6.如權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，大腸桿菌_結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒為 PMV361。
7.如權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，將人GM-CSF基因序列和結(jié)核分枝桿菌 CFPlO基因序列連接后插入大腸桿菌_結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)處。
8.如權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，用PCR、酶切和測序鑒定，得到重組質(zhì)粒 rpMV361GMCSF-CFP10。
9.如權(quán)利要求1所述的重組卡介苗，其特征在于，將如權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn) 化入卡介苗，得到rBCG :GMCSF-CFP 10。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人GM-CSF基因與結(jié)核分枝桿菌CFP10基因嵌合表達(dá)GMCSF-CFP10蛋白重組卡介苗的構(gòu)建及其免疫原性研究，即利用基因工程技術(shù)將人GM-CSF基因和結(jié)核分枝桿菌CFP10基因序列插入到同一大腸桿菌-結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pMV361的序列中，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒rpMV361GMCSF-CFP10。然后采用電穿孔的方法將上述載體導(dǎo)入卡介苗，構(gòu)建重組卡介苗rBCGGMCSF-CFP10。本發(fā)明構(gòu)建的重組卡介苗可以穩(wěn)定的表達(dá)人GM-CSF與結(jié)核分枝桿菌CFP10嵌合蛋白GMCSF-CFP10，其免疫原性優(yōu)于傳統(tǒng)卡介苗。本發(fā)明提供了一種重組卡介苗的制備過程，并研究了其免疫性，屬于基因工程領(lǐng)域和結(jié)核疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明將更有效的預(yù)防結(jié)核病的發(fā)生及傳播。
文檔編號C12N15/63GK101850111SQ201010140350
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日
發(fā)明者楊曉玲, 鄧儀昊, 鮑朗 申請人:四川大學(xué)