專利名稱：：菲律賓實(shí)蠅的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法及檢測(cè)用引物和探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及林業(yè)和植物檢疫
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種菲律賓實(shí)蠅的檢測(cè)方法；尤其涉及一種菲律賓實(shí)蠅的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法；此外，本發(fā)明還涉及檢測(cè)菲律賓實(shí)蠅的引物和探針。
背景技術(shù)：
：菲律賓實(shí)蠅Bactroceraphilippinensis屬雙翅目(Diptera)、實(shí)蠅科(T印hritidae)、離腹寡毛實(shí)蠅屬(Bactrocera)。主要分布在菲律賓等東南亞國(guó)家，寄主主要有木菠蘿，木瓜，蒲桃，芒果，桃欖等水果類經(jīng)濟(jì)作物。在其分布區(qū)給水果生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失，被列入《中國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名單》。由于我國(guó)與東南亞各國(guó)新鮮水果貿(mào)易量的日益增加，菲律賓實(shí)蠅隨貿(mào)易水果傳入我國(guó)、造成危害的風(fēng)險(xiǎn)逐漸增大，成為我國(guó)植物檢疫部門(mén)關(guān)注的重點(diǎn)有害生物之一。在口岸入境新鮮水果檢疫中截獲菲律賓實(shí)蠅的蟲(chóng)態(tài)多為卵、幼蟲(chóng)或蛹，菲律賓實(shí)蠅與其同屬的桔小實(shí)蠅B.dorsalis、楊桃實(shí)蠅B.carambolae和木瓜實(shí)蠅B.papayae形態(tài)特征非常相近，卵、幼蟲(chóng)和蛹更是無(wú)法用形態(tài)分類方法加以區(qū)分。在實(shí)際檢疫中，是將截獲的幼蟲(chóng)等飼養(yǎng)到成蟲(chóng)才能進(jìn)行種類鑒定，飼養(yǎng)時(shí)間一般需要10-20天，給入境新鮮水果貿(mào)易帶來(lái)嚴(yán)重影響。因此，尋求快速、準(zhǔn)確的鑒定方法是現(xiàn)階段檢疫技術(shù)亟待解決的問(wèn)題和發(fā)展的方向。余道堅(jiān)等(2004)報(bào)道了用PCR法檢疫鑒定番石榴實(shí)蠅B.correcta,目前還未見(jiàn)有利用分子生物學(xué)方法對(duì)菲律賓實(shí)蠅進(jìn)行種類鑒定的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種菲律賓實(shí)蠅的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法；為此，本發(fā)明還提供用于上述方法的檢測(cè)引物和探針。利用菲律賓實(shí)蠅檢測(cè)引物及探針可以快速、準(zhǔn)確地對(duì)菲律賓實(shí)蠅進(jìn)行檢測(cè)鑒定。本發(fā)明根據(jù)桔小實(shí)蠅、木瓜實(shí)蠅、楊桃實(shí)蠅和菲律賓實(shí)蠅(GenBank編號(hào)分別為DQ917577,DQ917578,EF014414,DQ995281)這幾個(gè)近似種的mtDNA中部分cob-nadhl基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了菲律賓實(shí)蠅的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，以達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測(cè)鑒定菲律賓實(shí)蠅的目的。在本發(fā)明的一方面，提供一種菲律賓實(shí)蠅的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)設(shè)計(jì)引物和探針；該引物的序列為上游引物G-FP:5，-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3，(SEQIDNO.1)或其互補(bǔ)鏈；下游引物G-RP:5，-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3，(SEQIDN0.2)或其互補(bǔ)鏈；該探針的序列為菲律賓實(shí)蠅探針G-MGB:FCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP(SEQIDΝ0·3)或其互補(bǔ)鏈；(2)提取菲律賓實(shí)蠅DNA；(3)采用步驟⑴設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。步驟(2)具體為取菲律賓實(shí)蠅單頭蟲(chóng)樣放入研缽，加液氮磨成粉末狀，用試劑盒提取樣品DNA。步驟(3)中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為25μL，包括5XrealtimePCRBuffer5uL,Mg2+solution0.5uL,dNTPmixture0.75uL,TaKaRaEx-TaqHS0.25uL,/^驟(1)設(shè)計(jì)的上下游引物G-FP/RP各0.5uL，TaqMan-MGB探針0.6uL，DNA模板0.5uL，超純水補(bǔ)至25uL。步驟(3)中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)?0°C2min，預(yù)變性95°CIOmin；然后95°C15sec，60°CImin循環(huán)40次。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測(cè)菲律賓實(shí)蠅的引物，其序列為上游引物G-FP:5，-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3，(SEQIDNO.1)或其互補(bǔ)鏈；下游引物G-RP:5，-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3，(SEQIDNO.2)或其互補(bǔ)鏈。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測(cè)菲律賓實(shí)蠅的探針，其序列為G-MGB=FCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP(SEQIDNO.3)或其互補(bǔ)鏈。上述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法采用MGB(全稱為MinorGrooveBinder)探針。MGB探針一是在探針的3’端標(biāo)記了自身不發(fā)光的淬滅熒光分子，以取代常規(guī)可發(fā)光的TAMRA熒光標(biāo)記；二是探針的3’端另結(jié)合了Minorgroovebinder結(jié)合物，使探針的Tm值提高，大大增加了探針的雜交穩(wěn)定性。該方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1、更容易設(shè)計(jì)；2、探針更短3、提高配對(duì)與司E配對(duì)模板間的Tm值差異；4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果更精確、分辯率更高；5、雜交的穩(wěn)定性提高；6、低背景；7、重復(fù)性更強(qiáng)。該方法適合病原體的檢測(cè)、SNP和突變體檢測(cè)，既可以進(jìn)行基因定量分析，又可以進(jìn)行基因突變分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于1、檢測(cè)時(shí)間大大縮短，可以在八個(gè)小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，傳統(tǒng)的常規(guī)方法需10-20天；2、對(duì)菲律賓實(shí)蠅的鑒定準(zhǔn)確率增大，傳統(tǒng)的常規(guī)方法還需要其他詳細(xì)產(chǎn)地等信息支持才能鑒定。圖1是本發(fā)明的引物G-FP/G-RP和探針G-MGB在菲律賓實(shí)蠅(DQ995281)上的位置示意圖；圖2是四種實(shí)蠅(菲律賓實(shí)蠅DQ995281，桔小實(shí)蠅DQ917577，楊桃實(shí)蠅EF014414，木瓜實(shí)蠅DQ917578)序列在探針位置的比對(duì)示意圖；圖3是不同來(lái)源的6個(gè)菲律賓實(shí)蠅樣品實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的結(jié)果示意圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork=ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述條件，或按制造廠商所建議的條件。實(shí)施例11.設(shè)計(jì)引物和探針根據(jù)桔小實(shí)蠅、木瓜實(shí)蠅、楊桃實(shí)蠅和菲律賓實(shí)蠅(GenBank編號(hào)分別為DQ917577,DQ917578,EF014414,DQ995281)這幾個(gè)近似種的mtDNA(線粒體DNA)中部分cob-nadhl基因的序列設(shè)計(jì)如下特異性引物G-FP/RP和探針G-MGB(引物和探針由上?；倒竞铣?上游引物G-FP:5，-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3，；下游引物G-RP:5，-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3，；菲律賓實(shí)蠅探針G-MGBFCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP上述引物及探針的檢測(cè)原理如圖1所示，四種實(shí)蠅(菲律賓實(shí)蠅DQ995281，桔小實(shí)蠅DQ917577，楊桃實(shí)蠅EF014414，木瓜實(shí)蠅DQ917578)序列在探針位置的比對(duì)見(jiàn)圖2。2、提取菲律賓實(shí)蠅DNA取菲律賓實(shí)蠅單頭蟲(chóng)樣(樣品來(lái)源見(jiàn)表1)放入研缽，加液氮磨成粉末狀，用DNeasyTissueKit(Qiagen公司)提取樣品DNA。表1菲律賓實(shí)蠅樣品信息<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>SH65由廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局梁帆研究員贈(zèng)送。3、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系25uL(大連寶生物公司TaKaRareal-timePCRcorekit):5XrealtimePCRBuffer(Mg2+free)5uL,Mg2+solution(250mmol/L)0.5uL,dNTPmixture(各lOmmol/L)0.75uL,TaKaRaEx-TaqHS(5U/uL)0.25uL,上下游引物G-FP/RP(10umol/L)各0.5uL，TaciMan-MGB探針(5umol/L)0.6uL，DNA(1020ng/uL)模板0.5uL,超純水補(bǔ)至25uL，實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增在ABIPRISM7700定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。打開(kāi)SequenceDetection1.71，設(shè)置PCR反應(yīng)條件，兩步法擴(kuò)增反應(yīng)程序:50°C2min，預(yù)變性95°CIOmin；然后95°C15sec，60°CImin循環(huán)40次。點(diǎn)擊運(yùn)行，進(jìn)行PCR反應(yīng)，Ih56min反應(yīng)結(jié)束，保存文件，打開(kāi)分析軟件，儀器自動(dòng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給出△Rn(第η個(gè)循環(huán)時(shí)的熒光增加值)與循環(huán)數(shù)圖像。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，在圖3中，有6條上升的曲線(數(shù)字1-6曲線)，數(shù)字1_6曲線表示的樣品詳細(xì)信息如表1所示。在圖3中，1表示樣品編號(hào)為SH102的菲律賓實(shí)蠅樣品，2表示樣品編號(hào)為SH104的菲律賓實(shí)蠅樣品，3表示樣品編號(hào)為SH126的菲律賓實(shí)蠅樣品，4表示樣品編號(hào)為SH103的菲律賓實(shí)蠅樣品，5表示樣品編號(hào)為SH114的菲律賓實(shí)蠅樣品，6表示樣品編號(hào)為SH65的菲律賓實(shí)蠅樣品，7表示沒(méi)有模板DNA的陰性對(duì)照。由圖3表明此次實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)到的是菲律賓實(shí)蠅，表明引物G-FP/RP和探針G-MGB可以特異性檢測(cè)菲律賓實(shí)蠅。權(quán)利要求一種菲律賓實(shí)蠅的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)設(shè)計(jì)引物和探針；該引物的序列為上游引物G-FP5’-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3’(SEQIDNO.1)或其互補(bǔ)鏈；下游引物G-RP5’-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3’(SEQIDNO.2)或其互補(bǔ)鏈；該探針的序列為菲律賓實(shí)蠅探針G-MGBFCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP(SEQIDNO.3)或其互補(bǔ)鏈；(2)提取菲律賓實(shí)蠅DNA；(3)采用步驟(1)設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。2.如權(quán)利要求1所述的菲律賓實(shí)蠅的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)具體為取菲律賓實(shí)蠅單頭蟲(chóng)樣放入研缽，加液氮磨成粉末狀，用試劑盒提取樣品DNA。3.如權(quán)利要求1所述的菲律賓實(shí)蠅的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為25μL，包括5XrealtimePCRBuffer5uL，Mg2+solution0.5uL，dNTPmixtureO.75uL,TaKaRaEx-TaqHSO.25uL，步驟(1)設(shè)計(jì)的上下游引物G-FP/RP各0.5uL,TaqMan-MGB探針0.6uL,DNA模板0.5uL,超純水補(bǔ)至25uL。4.如權(quán)利要求1或3所述的菲律賓實(shí)蠅的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟⑶中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)?0°C2min，預(yù)變性95°ClOmin;然后95°C15sec，60°CImin循環(huán)40次。5.一種用于檢測(cè)菲律賓實(shí)蠅的引物，其特征在于，其序列為上游引物G-FP:5，-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3，(SEQIDNO.1)或其互補(bǔ)鏈；下游引物G-RP:5，-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3，(SEQIDNO.2)或其互補(bǔ)鏈。6.一種用于檢測(cè)菲律賓實(shí)蠅的探針，其特征在于，其序列為G-MGB:FCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP(SEQIDNO.3)或其互補(bǔ)鏈。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種菲律賓實(shí)蠅的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法及檢測(cè)用引物和探針，根據(jù)桔小實(shí)蠅、木瓜實(shí)蠅、楊桃實(shí)蠅和菲律賓實(shí)蠅(GenBank編號(hào)分別為DQ917577，DQ917578，EF014414，DQ995281)這幾個(gè)近似種的mtDNA中部分cob-nadh1基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物G-FP/RP(上游引物SEQIDNO.1所示序列，下游引物SEQIDNO.2所示序列)和探針G-MGB(SEQIDNO.3所示序列)，建立了菲律賓實(shí)蠅的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，以達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測(cè)鑒定菲律賓實(shí)蠅的目的。文檔編號(hào)C12N15/11GK101805792SQ20101014242公開(kāi)日2010年8月18日申請(qǐng)日期2010年4月8日優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日發(fā)明者葉軍,房蕊,易建平申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局