專利名稱：一種抗糖尿病的單克隆抗體的制作方法
一種抗糖尿病的單克隆抗體本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種具有與T淋巴細(xì)胞表面抗原蛋白高特異性，高親合力結(jié)合并具有生物活性能阻斷T細(xì)胞對胰腺中β細(xì)胞損害的單克隆抗體。近年來，全球糖尿病發(fā)病率增長迅速。世界衛(wèi)生組織最新公布的權(quán)威數(shù)據(jù)顯示， 全球糖尿病患者高達(dá)1. 77億人是目前世界上除心腦血管疾病，惡性腫瘤外的第三大疾病。 在我國，隨著近年來人們生活水平的不斷提高，糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，發(fā)病率高達(dá) 10. 5%，患者逾6000萬人。糖尿病是遺傳和環(huán)境兩大因素相互密切影響而引起的一種復(fù)雜 性疾病，是胰島素絕對或相對分泌不足以及靶細(xì)胞對胰島素敏感性降低所致。臨床上以持 續(xù)性高血糖不下為主要標(biāo)志，如不能有效控制血糖，勢必引起糖尿病的急，慢性并發(fā)癥，其 危害是可怕的，如糖尿病性視網(wǎng)膜病變，腎臟及神經(jīng)病變，心血管病變等。據(jù)權(quán)威數(shù)據(jù)顯示， 由糖尿病所致失明者，較常人高10到23倍；由此引起壞疽或截肢者，較常人高20倍；由此 導(dǎo)致腎功能衰竭者較其他腎病所致者高17倍。而80%的糖尿病患者死因，則是由心血管病 變直接導(dǎo)致的。糖尿病在臨床上有四種類型，I型糖尿病，II型糖尿病，繼發(fā)性糖尿病和妊娠糖尿 病。雖然這四種類型的糖尿病的臨床癥狀均表現(xiàn)相似或相同，但是導(dǎo)致糖尿病發(fā)生的機(jī)理 卻不同。這四種類型的糖尿病均會導(dǎo)致胰腺中的β細(xì)胞不能合成足量的胰島素來降低血 糖的濃度從而使高血糖癥發(fā)生。I型糖尿病通常是由于遺傳因素引起自身免疫系統(tǒng)阻礙其 β細(xì)胞無法合成和分泌胰島素，屬胰島素依賴型。II型糖尿病是由于胰島素不能通過靶細(xì) 胞發(fā)揮正常功能，為胰島素非依賴型。繼發(fā)性糖尿病是β細(xì)胞功能衰退或其他種種原因所 致。妊娠糖尿病與I型糖尿病相似。自80年前發(fā)現(xiàn)糖尿病以來經(jīng)過許多生物科學(xué)家和醫(yī)學(xué)家的努力，糖尿病逐漸得 到了較好的治療和控制，主要以飲食控制和長期配合降血糖藥的治療，但是糖尿病仍不能 完全治愈。近幾年來，生物學(xué)家注意到人體自身免疫系統(tǒng)攻擊β細(xì)胞和脂肪細(xì)胞可能是導(dǎo) 致糖尿病發(fā)生的主要因素，為進(jìn)一步闡明糖尿病的真正發(fā)病機(jī)理及靶向治療提出了新的希望。本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有與T細(xì)胞表面抗原蛋白高 特異性，高親合力結(jié)合并具有生物活性能阻斷T淋巴細(xì)胞對胰腺中β細(xì)胞損害的單克隆抗 體。為實現(xiàn)上述目的，設(shè)計一種抗糖尿病的單克隆抗體，其特征在于具體的生產(chǎn)工藝 是(1) T淋巴細(xì)胞尼龍毛分離法，取小鼠BaLb/C外周血，用尼龍毛柱L型來分離T淋巴細(xì) 胞，將粘附于尼龍毛上的T淋巴細(xì)胞洗到培養(yǎng)基中，離心，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，然后再 離心收集分離后的T淋巴細(xì)胞；(2)動物免疫，第一次免疫，T淋巴細(xì)胞懸液1X1070. 3ml，大鼠腹腔內(nèi)直接注射，第二次免疫，兩周后，T淋巴細(xì)胞懸液1X1070. 3ml，腹腔內(nèi)再注射。二 周后采血測其效價，檢測免疫效果。取脾臟收集B細(xì)胞，(3)細(xì)胞融合，將免疫后的B細(xì)胞與 骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，在HAT培養(yǎng)液中培養(yǎng)，篩選，(4)克隆雜交瘤細(xì)胞，用有限稀釋法 來分離第一次篩選后的雜交瘤細(xì)胞，然后將細(xì)胞放置96孔板培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一周，中間換一 次培養(yǎng)液。二周后，再用有限稀釋法來分離96孔板培養(yǎng)皿中的雜交瘤細(xì)胞；(5)克隆單雜 交瘤細(xì)胞，將上述第四步分離得到的雜交瘤細(xì)胞分別放置0. 3%瓊脂RPMI-1640 (含有10% 胎牛血清)培養(yǎng)四周，然后分別挑出細(xì)胞集落進(jìn)一步培養(yǎng)，幾周后能得到大量的雜交瘤細(xì) 胞；(6)抗體的測定，將大量的雜交瘤細(xì)胞放置無血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每三天收集一次培 養(yǎng)液，離心后保留上清液(含有單克隆抗體)，雜交瘤細(xì)胞再進(jìn)一步培養(yǎng)。用5升的上清液 純化抗體；(7)抗體的應(yīng)用，兩種單克隆抗體各100微克混合在一起，NOD小鼠腹腔內(nèi)注射， 一周后再腹腔內(nèi)注射一次，然后觀察血糖和胰島素的變化。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，工藝流程簡單，具有與T淋巴細(xì)胞表面抗原蛋白高特異 性，高親合力結(jié)合并具有生物活性能阻斷T細(xì)胞對胰腺中0細(xì)胞損害的單克隆抗體。

圖1為本發(fā)明的小鼠糖濃度升高對比2為本發(fā)明的小鼠血糖濃度對比3為本發(fā)明的小鼠胰島素濃度對比圖指定圖1為摘要附圖下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明圖1 比較測定組20只小鼠(注射單克隆抗體)與對照組20只小鼠(未注射單 克隆抗體)，血糖濃度升高的小鼠只數(shù)。對照組小鼠血糖濃度升高為12只(誘導(dǎo)血糖升高 率達(dá)60% )，測定組小鼠血糖濃度升高為1只(誘導(dǎo)血糖升高率達(dá)5% )。圖2 比較對照組與測定組小鼠血糖濃度，與未注射單克隆抗體的測定組小鼠相 比，試驗結(jié)果顯示單克隆抗體能有效控制對照組小鼠血糖的升高達(dá)約92%。圖3 比較對照組與測定組小鼠血液中的胰島素濃度，注射單克隆抗體后的小鼠 胰島素濃度保持正常范圍達(dá)八月之久(還在觀察中)。對照組與測定組小鼠動物試驗均在持續(xù)不間斷地喂養(yǎng)高脂肪營養(yǎng)飼料下進(jìn)行，除 了饑餓8小時外。八周后開始注射單克隆抗體。實施例1一、T淋巴細(xì)胞尼龍毛分離法取小鼠BaLb/C外周血，用尼龍毛柱L型來分離T淋巴細(xì)胞，將粘附于尼龍毛上的T 淋巴細(xì)胞洗到培養(yǎng)基中，離心，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，然后再離心收集分離后的T淋巴 細(xì)胞二、動物免疫(1)第一次免疫，T淋巴細(xì)胞懸液1X1070. 3ml，大鼠腹腔內(nèi)直接注射。(2)第二次免疫，兩周后，T淋巴細(xì)胞懸液1X1070. 3ml，腹腔內(nèi)再注射。二周后采血測其效價，檢測免疫效果。取脾臟收集B細(xì)胞。(3)細(xì)胞融合，將免疫后的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，在HAT培養(yǎng)液中培
養(yǎng) 蹄選 (4)克隆雜交瘤細(xì)胞，用有限稀釋法來分離第一次篩選后的雜交瘤細(xì)胞，然后將細(xì) 胞放置96孔板培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一周，中間換一次培養(yǎng)液。二周后，再用有限稀釋法來分離96 孔板培養(yǎng)皿中的雜交瘤細(xì)胞。(5)克隆單雜交瘤細(xì)胞，將上述第四步分離得到的雜交瘤細(xì)胞分別放置0.3%瓊 脂RPMI-1640(含有10%胎牛血清)培養(yǎng)四周，然后分別挑出細(xì)胞集落進(jìn)一步培養(yǎng)，幾周后 能得到大量的雜交瘤細(xì)胞。(6)抗體的測定，將大量的雜交瘤細(xì)胞放置無血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每三天收集一 次培養(yǎng)液，離心后保留上清液(含有單克隆抗體)，雜交瘤細(xì)胞再進(jìn)一步培養(yǎng)。用5升的上 清液純化抗體。(7)抗體的應(yīng)用，兩種單克隆抗體各100微克混合在一起，NOD小鼠腹腔內(nèi)注射，一 周后再腹腔內(nèi)注射一次，然后觀察血糖和胰島素的變化。
權(quán)利要求
一種抗糖尿病的單克隆抗體，其特征在于具體的生產(chǎn)工藝是(1)T淋巴細(xì)胞尼龍毛分離法，取小鼠BaLb/C外周血，用尼龍毛柱L型來分離T淋巴細(xì)胞，將粘附于尼龍毛上的T淋巴細(xì)胞洗到培養(yǎng)基中，離心，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，然后再離心收集分離后的T淋巴細(xì)胞；(2)動物免疫，第一次免疫，T淋巴細(xì)胞懸液1X107/0.3ml，大鼠腹腔內(nèi)直接注射，第二次免疫，兩周后，T淋巴細(xì)胞懸液1X107/0.3ml，腹腔內(nèi)再注射。二周后采血測其效價，檢測免疫效果。取脾臟收集B細(xì)胞，(3)細(xì)胞融合，將免疫后的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，在HAT培養(yǎng)液中培養(yǎng)，篩選，(4)克隆雜交瘤細(xì)胞，用有限稀釋法來分離第一次篩選后的雜交瘤細(xì)胞，然后將細(xì)胞放置96孔板培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一周，中間換一次培養(yǎng)液。二周后，再用有限稀釋法來分離96孔板培養(yǎng)皿中的雜交瘤細(xì)胞；(5)克隆單雜交瘤細(xì)胞，將上述第四步分離得到的雜交瘤細(xì)胞分別放置0.3％瓊脂RPMI-1640(含有10％胎牛血清)培養(yǎng)四周，然后分別挑出細(xì)胞集落進(jìn)一步培養(yǎng)，幾周后能得到大量的雜交瘤細(xì)胞；(6)抗體的測定，將大量的雜交瘤細(xì)胞放置無血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每三天收集一次培養(yǎng)液，離心后保留上清液(含有單克隆抗體)，雜交瘤細(xì)胞再進(jìn)一步培養(yǎng)。用5升的上清液純化抗體；(7)抗體的應(yīng)用，兩種單克隆抗體各100微克混合在一起，NOD小鼠腹腔內(nèi)注射，一周后再腹腔內(nèi)注射一次，然后觀察血糖和胰島素的變化。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種抗糖尿病的單克隆抗體，其特征在于具體的生產(chǎn)工藝是(1)T淋巴細(xì)胞尼龍毛分離法，取小鼠BaLb/C外周血，用尼龍毛柱L型來分離T淋巴細(xì)胞，將粘附于尼龍毛上的T淋巴細(xì)胞洗到培養(yǎng)基中，離心，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，然后再離心收集分離后的T淋巴細(xì)胞；本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，工藝流程簡單，具有與T淋巴細(xì)胞表面抗原蛋白高特異性，高親合力結(jié)合并具有生物活性能阻斷T細(xì)胞對胰腺中β細(xì)胞損害的單克隆抗體。
文檔編號C12N5/20GK101824089SQ201010142499
公開日2010年9月8日 申請日期2010年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:上海新號源生物科技有限公司