專利名稱：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)。
背景技術(shù)：
盾葉薯蕷(Dioscorea Zingiberensis C. H Wright)是單子葉植物薯蕷科薯蕷屬 的一種重要的藥用植物，為我國的特有種，其根狀莖中的薯蕷皂甙元(簡稱皂素)是制造甾 體激素類藥物的重要原料，在薯蕷屬中含量最高。薯蕷皂甙元的結(jié)構(gòu)經(jīng)改造后可得到數(shù)千 種甾體激素類藥物和水溶性皂甙制劑，被醫(yī)藥界稱為"藥用黃金"。因此，盾葉薯蕷作為重要 的藥源植物具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來，隨著盾葉薯蕷需求量的增加和采挖過程中缺乏 科學(xué)的指導(dǎo)，使野生的盾葉薯蕷資源日漸枯竭，品質(zhì)嚴(yán)重退化。另外，盾葉薯蕷主要通過根 狀莖進(jìn)行繁殖，且需種量大，成本高，嚴(yán)重阻礙了盾葉薯蕷種植產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。因此，培育穩(wěn)定 的根狀莖高產(chǎn)或皂甙元高含量的盾葉薯蕷新品系，是緩解當(dāng)前市場供需矛盾和解決栽培后 品質(zhì)退化的主要途徑。 盾葉薯蕷主要進(jìn)行無性繁殖，通過傳統(tǒng)的雜交育種方法改良性狀難度較大，而體 細(xì)胞無性系變異，誘變育種又具有盲目性。目前國內(nèi)提高薯蕷皂甙元產(chǎn)量的方法主要是優(yōu) 化栽培技術(shù)、組織培養(yǎng)和改善種植環(huán)境等方面。王志安、王日照用組織培養(yǎng)的方法篩選高產(chǎn) 皂素植株系，田間成苗6830株，皂甙元平均含量2. 48%，與野生盾葉薯蕷相比，皂素含量有 一定程度的下降。畢世榮、謝碧霞分別利用盾葉薯蕷無性系變異進(jìn)行高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選研 究，但存在植株再生困難的問題，難以獲得可以大面積推廣的植物新品種。周媛等通過離體 誘導(dǎo)的方法獲得的盾葉薯蕷四倍體植株，雖在試管苗階段表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞體積大、數(shù)量 多的特征，但移栽至大田后，其器官并不表現(xiàn)巨大的特征，與二倍體植株無明顯差異，且藥 用有效成分并未檢測。目前市場上的這些技術(shù)手段并沒有實(shí)現(xiàn)盾葉薯蕷在遺傳品種上的改 良，通過這些篩選篩選獲得的皂素高產(chǎn)植株存在著含量不穩(wěn)定等問題。 轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一種有效的定向改良性狀的技術(shù)手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種植物的 性狀改良。 本發(fā)明的目的在于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，開展盾葉薯蕷基因工程改良，緩解當(dāng)前盾葉 薯蕷產(chǎn)業(yè)中存在的問題，為促進(jìn)盾葉薯蕷產(chǎn)業(yè)和特色農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因方法，為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù) 深入研究盾葉薯蕷的藥用價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。 本發(fā)明一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因方法所采用的技術(shù)方案是通過如下方
式完成的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因方法包括以下步驟 (1)通過高頻再生體系獲得胚性愈傷受體材料； (2)挑取農(nóng)桿菌單菌落，加入到Y(jié)EP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)； (3)將誘導(dǎo)出的愈傷組織加入到農(nóng)桿菌菌液中，經(jīng)侵染、取出外植體轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)、過渡培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選；
(4)挑選抗性愈傷組織進(jìn)行分化和生根。
本發(fā)明一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因方法的具體操作步驟是 (1)將盾葉薯蕷塊莖種植在土壤中，待盾葉薯蕷塊莖萌發(fā)后并地上部分長到60cm
左右時(shí)，取其莖段，切成含單個(gè)芽的單節(jié)莖，接種于腋芽誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基MS+BA 1. 0
2. 0mg/L+NAA 0 0. 5mg/L，pH 5. 8，溫度25± 1°C ， 16h光照/8h黑暗光周期，1500 2000Lx 光強(qiáng)度的培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)無菌苗(培養(yǎng)室條件下同)； (2)無菌苗長出后，取盾葉薯蕷無菌苗葉片或莖段，接種于固體的愈傷組織誘導(dǎo)培 養(yǎng)基MS+BA 2. 0 4. Omg/L+NAA 0 0. 5mg/L，pH 5. 8，黑暗培養(yǎng)1個(gè)月后可獲得愈傷組織；
(3)制備工程菌、培養(yǎng)和活化，調(diào)整菌液濃度0D6。。值為0. 3 0. 7，取活性高的愈 傷組織放入菌液中，侵染15 45分鐘，吸干菌液，置于共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基MS+BA 2. 0
3. Omg/L+NAA 0 0. 5mg/L+AS 200 ii mol/L， pH 5. 3，培養(yǎng)2 3天； (4)脫菌后先置于固體過渡培養(yǎng)基MS+BA 2. 0 3. Omg/L+NAA 0 0. 5mg/L+cef 400 500mg/L上過渡培養(yǎng)一周，后在培養(yǎng)基中添加40 50mg/L Hyg進(jìn)行篩選培養(yǎng)；
(5)取抗性愈傷組織放在分化培養(yǎng)基MS+BA 2. 0 3. Omg/L+NAA 0. 2 0. 5mg/ L+cef 400 500mg/L+HyglO 50mg/L上，光照條件下進(jìn)行分化，將生長至3cm的無根再 生苗置于大量元素減半的生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0. 1 0. 2mg/L+Hyg40 50mg/L誘導(dǎo)生 根； (6)待再生苗長出IO根以上的須根時(shí)，打開封口膜，煉苗一周，用蒸餾水洗去根部 培養(yǎng)基，移栽到盛有營養(yǎng)土的花盆中，用稀釋50倍的MS大量元素母液噴灑植株，覆蓋塑料 膜，一周后去掉塑料膜，獲得抗性再生植株； (7)GUS基因檢測材料取自經(jīng)過1 4步驟后獲得的抗性愈傷組織，將經(jīng)過1 6 步驟后獲得的抗性再生植株的葉片，用SDS法提取基因組DNA，以質(zhì)粒DNA做陽性對照，未轉(zhuǎn) 化植株的DNA及ddH20做陰性對照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測抗性再生植株。
在上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因方法中，所用的盾葉薯蕷塊莖采自浙江仙居 薯蕷種植基地，種于浙江師范大學(xué)苗圃內(nèi)。


圖1為愈傷組織GUS染色結(jié)果照片。其中，照片中左側(cè)為未轉(zhuǎn)化的愈傷組織，照片 中右側(cè)為轉(zhuǎn)化的愈傷組織。 圖2為含目的片段的載體質(zhì)粒Dl-6中的T-DNA區(qū)段的結(jié)構(gòu)圖。
圖3為對盾葉薯蕷抗性愈傷組織用HPT引物PCR擴(kuò)增結(jié)果掃描圖。
圖4為對盾葉薯蕷抗性愈傷組織RRM1弓|物PCR擴(kuò)增結(jié)果掃描圖。
圖5為盾葉薯蕷抗性愈傷組織篩選培養(yǎng)1個(gè)月后的照片。
圖6為盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因再生植株無菌苗照片。
圖7為盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因再生植株照片。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明做出進(jìn)一步的具體說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1 —、誘導(dǎo)盾葉薯蕷愈傷組織 1、取經(jīng)表面消毒的盾葉薯蕷實(shí)生莖段，切成含單個(gè)芽的單節(jié)莖，接種于腋芽誘導(dǎo) 固體培養(yǎng)基MS+BA1. 0 2. 0mg/L+NAA 0. 5mg/L， pH 5. 8， 25± 1°C ，光照培養(yǎng)出無菌苗；
2、取無菌苗葉片和莖段各120個(gè)，葉片切成約0.5cn^大小，莖段切成約lcm大小 接種于固體的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA 3. Omg/L， 25± 1°C ，黑暗培養(yǎng)， 一個(gè)月以后獲得愈 傷組織139個(gè)。
二、農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化 1、制備帶GUS基因的工程菌、培養(yǎng)和活化，挑取農(nóng)桿菌單菌落，加入到Y(jié)EP液體培 養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至0D6。。值0. 4 0. 6 ; 2、將胚性愈傷組織加入到農(nóng)桿菌菌液中，侵染20 30分鐘，取出外植體，轉(zhuǎn)入共 培養(yǎng)固體基MS+BA3. Omg/L+AS 200 ii mol/L， pH 5. 3 ; 3、共培養(yǎng)2 3天后進(jìn)行脫菌，轉(zhuǎn)入固體過渡培養(yǎng)基MS+BA 3. Omg/L+cef 400 500mg/L ; 4、過渡培養(yǎng)一到兩周后轉(zhuǎn)入固體篩選培養(yǎng)基MS+BA 3. Omg/L+cef 400 500mg/ L+Hyg 40 50mg/L上篩選出抗性愈傷組織6個(gè)。
三、抗性愈傷組織的檢驗(yàn) 1 、將篩選出的抗性愈傷組織投入到已配置好的GUS染色液中，37t:浸泡24個(gè)小時(shí) 后觀察抗性愈傷組織的顏色； 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GUS基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到愈傷組織中，見圖1。
實(shí)施例2 —、誘導(dǎo)盾葉薯蕷愈傷組織 1、取經(jīng)表面消毒的盾葉薯蕷實(shí)生莖段，切成含單個(gè)芽的單節(jié)莖，接種于腋芽誘導(dǎo)
固體培養(yǎng)基MS+BA2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L， pH 5. 8， 25± 1°C ，光照培養(yǎng)出無菌苗； 2、取無菌苗莖段，接種于固體的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA 2. 0 3. Omg/L+NAA
0 0. 5mg/L， 25± 1°C ，黑暗培養(yǎng)，接種360個(gè)， 一個(gè)月以后獲得愈傷組織294個(gè)； 二、農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化 1、制備根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105的工程菌，表達(dá)載體為D2_8，培養(yǎng)和活化，挑取農(nóng) 桿菌單菌落，加入到Y(jié)EP液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至0D值0. 3 0. 7 ; 2、將胚性愈傷組織加入到農(nóng)桿菌菌液中，侵染20 30分鐘，取出外植體，轉(zhuǎn)入共 培養(yǎng)固體基MS+BA2. Omg/L 3. Omg/L+NAA 0 0. 5mg/L+AS 200 ii mol/L， pH 5. 3 ;
3、共培養(yǎng)2 3天后進(jìn)行脫菌，轉(zhuǎn)入固體過渡培養(yǎng)基MS+BA 2. 0 3. Omg/L+NAA 0 0. 5mg/L+cef500mg/L ; 4、過渡培養(yǎng)一到兩周后轉(zhuǎn)入固體篩選培養(yǎng)基MS+BA 2. 0 3. Omg/L+NAA 0 0. 5mg/L+cef 500mg/L+Hyg40 50mg/L上篩選出抗性愈傷組織。
三、抗性愈傷組織的檢驗(yàn) 取抗性愈傷組織，用SDS法提取基因組DNA，根據(jù)潮霉素基因rFCA-RRM2基因片段 設(shè)計(jì)PCR檢測引物。以質(zhì)粒D2-8作陽性對照，非轉(zhuǎn)化植株及ddH20作為陰性對照，進(jìn)行PCR 檢測。結(jié)果顯示，選取的抗性愈傷組織均分別擴(kuò)增出了 845bp和330bp的目的片段，與質(zhì)粒
5DNA擴(kuò)增的片段大小相同，而以未轉(zhuǎn)化植株葉片DNA為陰性對照的擴(kuò)增產(chǎn)物中無目的片段，
初步說明外源基因已整合到抗性愈傷組織的基因組中。
實(shí)施例3 —、誘導(dǎo)盾葉薯蕷愈傷組織 1、取經(jīng)表面消毒的盾葉薯蕷實(shí)生莖段，切成含單個(gè)芽的單節(jié)莖，接種于腋芽誘導(dǎo)
固體培養(yǎng)基MS+BA2. 0mg/L+NAA 0. 5mg/L， pH 5. 8， 25± 1°C ，光照培養(yǎng)出無菌苗； 2、取無菌苗莖段，接種于固體的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA 2. 0 3. 0mg/L+NAA
0 0. 5mg/L，25士rC，黑暗培養(yǎng)，一個(gè)月以后可獲得愈傷組織。 二、農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化 1、制備根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105的工程菌，表達(dá)載體為Dl_6，培養(yǎng)和活化，挑取農(nóng) 桿菌單菌落，加入到Y(jié)EP液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至0D值0. 3 0. 7 ; 2、將胚性愈傷組織加入到農(nóng)桿菌菌液中，侵染15 45分鐘，取出外植體，轉(zhuǎn)入共 培養(yǎng)固體基MS+BA2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L+AS 200 ii mol/L， pH 5. 3 ; 3、共培養(yǎng)2 3天后進(jìn)行脫菌，轉(zhuǎn)入固體過渡培養(yǎng)基MS+BA 2. 0 3. Omg/L+NAA 0 0. 5mg/L+cef 400 500mg/L ;4、過渡培養(yǎng)一到兩周后轉(zhuǎn)入固體篩選培養(yǎng)基MS+BA 2. 0 3. Omg/L+NAA 0 0. 5mg/L+cef 400 500mg/L+Hyg 40 50mg/L上篩選出抗性愈傷組織。
三、抗性轉(zhuǎn)基因植株的獲得 1、將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入到含有40mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基中；
2、2個(gè)月后，只產(chǎn)生綠色芽點(diǎn)并沒有分化成苗；
3、將選擇壓去掉1個(gè)月后抗性愈傷組織開始分化； 4、當(dāng)小苗較壯實(shí)，伸展出許多葉片后，轉(zhuǎn)入有選擇壓生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0. 1 0.2mg/L+Hyg 40mg/L中； 5、待抗性再生苗生長出許多粗壯、有白色絨毛的根，植株生長狀況良好，煉苗后進(jìn)
行移栽，90%植株長出新生枝葉。 四、抗性植株的檢驗(yàn) 取抗性植株的葉片，用SDS法提取基因組DNA，根據(jù)潮霉素基因rFCA-RRMl基因片 段設(shè)計(jì)PCR檢測引物。以質(zhì)粒Dl-6作陽性對照，非轉(zhuǎn)化植株及ddH20作為陰性對照，進(jìn)行 PCR檢測。結(jié)果顯示，選取的抗性愈傷組織均分別擴(kuò)增出了 845bp和154bp的目的片段，與 質(zhì)粒DNA擴(kuò)增的片段大小相同，而以未轉(zhuǎn)化植株葉片DNA為陰性對照的擴(kuò)增產(chǎn)物中無目的 片段，初步說明外源基因已整合到抗性愈傷組織的基因組中。
利用本發(fā)明的方法已成功地獲得轉(zhuǎn)基因盾葉薯蕷陽性植株10株。
權(quán)利要求
一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因方法包括以下步驟(1)通過高頻再生體系獲得胚性愈傷受體材料；(2)挑取農(nóng)桿菌單菌落，加入到Y(jié)EP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(3)將誘導(dǎo)出的愈傷組織加入到農(nóng)桿菌菌液中，經(jīng)侵染、取出外植體轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)、過渡培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選；(4)挑選抗性愈傷組織進(jìn)行分化和生根。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因方法的具體操作步驟是(1) 將盾葉薯蕷塊莖種植在土壤中，待盾葉薯蕷塊莖萌發(fā)后并地上部分長到60cm左右時(shí)，取其莖段，切成含單個(gè)芽的單節(jié)莖，接種于腋芽誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基MS+BA 1. 0 2. 0mg/L+NAA 0 0. 5mg/L，pH 5. 8，溫度25±1°C， 16h光照/8h黑暗光周期，1500 2000Lx光強(qiáng)度的培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)無菌苗(培養(yǎng)室條件下同)；(2) 無菌苗長出后，取盾葉薯蕷無菌苗葉片或莖段，接種于固體的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA 2. 0 4. Omg/L+NAA 0 0. 5mg/L， pH 5. 8，黑暗培養(yǎng)1個(gè)月后可獲得愈傷組織；(3) 制備工程菌、培養(yǎng)和活化，調(diào)整菌液濃度0D6。。值為0. 3 0. 7，取活性高的愈傷組織放入菌液中，侵染15 45分鐘，吸干菌液，置于共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基MS+BA 2. 0 3. Omg/L+NAA 0 0. 5mg/L+AS 200 ii mol/L， pH 5. 3，培養(yǎng)2 3天；(4) 脫菌后先置于固體過渡培養(yǎng)基MS+BA 2. 0 3. Omg/L+NAA 0 0. 5mg/L+cef400 500mg/L上過渡培養(yǎng)一周，后在培養(yǎng)基中添加40 50mg/L Hyg進(jìn)行篩選培養(yǎng)；(5) 取抗性愈傷組織放在分化培養(yǎng)基MS+BA 2. 0 3. Omg/L+NAA 0. 2 0. 5mg/L+cef400 500mg/L+HyglO 50mg/L上，光照條件下進(jìn)行分化，將生長至3cm的無根再生苗置于大量元素減半的生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0. 1 0. 2mg/L+Hyg40 50mg/L誘導(dǎo)生根；(6) 待再生苗長出IO根以上的須根時(shí)，打開封口膜，煉苗一周，用蒸餾水洗去根部培養(yǎng)基，移栽到盛有營養(yǎng)土的花盆中，用稀釋50倍的MS大量元素母液噴灑植株，覆蓋塑料膜，一周后去掉塑料膜，獲得抗性再生植株；(7) GUS基因檢測材料取自經(jīng)過1 4步驟后獲得的抗性愈傷組織，將經(jīng)過1 6步驟后獲得的抗性再生植株的葉片，用SDS法提取基因組DNA，以質(zhì)粒DNA做陽性對照，未轉(zhuǎn)化植株的DNA及ddH20做陰性對照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測抗性再生植株。
全文摘要
本發(fā)明一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因方法，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)深入研究盾葉薯蕷的藥用價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)基因方法包括以下步驟(1)通過高頻再生體系獲得胚性愈傷受體材料；(2)挑取農(nóng)桿菌單菌落，加入到Y(jié)EP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(3)將誘導(dǎo)出的愈傷組織加入到農(nóng)桿菌菌液中，經(jīng)侵染、取出外植體轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)、過渡培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選；(4)挑選抗性愈傷組織進(jìn)行分化和生根。
文檔編號C12N15/82GK101792774SQ20101014376
公開日2010年8月4日 申請日期2010年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月12日
發(fā)明者劉帥, 顧志敏, 馬伯軍 申請人:浙江師范大學(xué)