專利名稱：：鑒定轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米bvla430101的轉(zhuǎn)化體特異性pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種鑒定轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
：自從1996年轉(zhuǎn)基因作物大規(guī)模商業(yè)化種植以來，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積迅猛增加。2009年全球種植轉(zhuǎn)基因作物種植的國家達(dá)到25個，種植面積總計達(dá)1.34億公頃，是1996年種植面積的79倍。其中轉(zhuǎn)基因玉米全球種植面積達(dá)4100萬公頃，占玉米種植面禾只的26%(James，Clive.2009.GlobalStatusofCommercializedBiotech/GMCrops:2009.ISAAABriefNo.41.ISAAA:Ithaca，NY.)。我國于2009年8月批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的生物安全證書(http:〃麗w.stee.agri.gov.cn/biosafety/spxx/P020091127591594596689.pdf，審批編號農(nóng)基安證字(2009)第074號)，同時我國還批準(zhǔn)國外9個轉(zhuǎn)基因玉米品種進(jìn)口用作加工原料(http:〃www.stee.agri.gov.cn/biosafety/spxx/t20091022_819214.htm)。目前我國已經(jīng)研究和制定了多個國外轉(zhuǎn)基因玉米的檢測方法，并頒布為國家標(biāo)準(zhǔn)(如農(nóng)業(yè)部869號公告-3-2007轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲和耐除草劑玉米Btll及其衍生品種定性PCR方法)，但轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的特異性檢測方法尚未見報道。PCR技術(shù)是轉(zhuǎn)基因作物檢測中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。在應(yīng)用這種技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因作物定性檢測時，根據(jù)其擴(kuò)增的靶標(biāo)區(qū)域和特異性將其分為四類一、篩選檢測，以轉(zhuǎn)基因通用的外源啟動子和終止子為靶標(biāo)區(qū)域；二、基因特異性檢測，以特異的外源目的基因?yàn)榘袠?biāo)區(qū)域；三、構(gòu)建特異性檢測，以轉(zhuǎn)基因元件之間的特異構(gòu)建為靶標(biāo)區(qū)域；四、轉(zhuǎn)化體特異性檢測，以轉(zhuǎn)化體特異性片段為靶標(biāo)區(qū)域。這四類檢測方法對轉(zhuǎn)基因作物的品系檢測特異性是逐漸增加的。這四類檢測方法對轉(zhuǎn)基因作物的檢測特異性是逐漸增加的，轉(zhuǎn)化體特異性檢測是目前對轉(zhuǎn)基因品系檢測特異性最高的檢測方法，也是目前轉(zhuǎn)基因檢測中最常用的身份檢測方法，這種檢測方法能夠區(qū)分同一轉(zhuǎn)化載體產(chǎn)生的不同轉(zhuǎn)化植株品系。
發(fā)明內(nèi)容針對上述領(lǐng)域中的空白，提供了轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的轉(zhuǎn)化體特異性序列以及鑒定轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的轉(zhuǎn)化體特異性PCR方法，該P(yáng)CR方法能利用普通的PCR儀器、試劑快速準(zhǔn)確鑒別出轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101，以及以轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101為親本的玉米品系。轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101轉(zhuǎn)化體特異性序列，如SeqIDNo.l所示，其中轉(zhuǎn)化載體序列位于l-509bp，玉米基因組序列位于510-1345bp。鑒定轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測方法，其特征在于PCR反應(yīng)中的正向引物依據(jù)SEQIDN01中1-509位序列設(shè)計，反向引物依據(jù)SEQIDN01的510-1345位序列設(shè)計。所述正向引物為101-F:5'-TTAAGTTGGGTAACGCCAGG-3'，所述反向引物為101-R:5'-AGCTCGAACTCACAAATGAG-3'。，擴(kuò)增的片段為長度為228bp本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的轉(zhuǎn)化體特異性序列以及依賴其建立的轉(zhuǎn)化體特異性PCR方法可作為一種鑒定轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101，以及以這個品種為親本的轉(zhuǎn)基因玉米品系的有效手段，由于轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101是我國目前批準(zhǔn)的第一個允許商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因玉米品系，因此本發(fā)明為特異性鑒定轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101提供了便利，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、靈敏度高、特異性好、所需實(shí)驗(yàn)條件不高，因此有非常高的實(shí)用價值。圖1轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101轉(zhuǎn)化體特異性序列的GenomeWalking擴(kuò)增A:第一次Walking結(jié)果；B:第二次Walking結(jié)果M:DNAMarkerDL2000;1-4:DL1-DL4的Walking產(chǎn)物圖2轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測結(jié)果M:DNAMarkerDL2000;1:轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101,2-11:10個市場玉米樣CI具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中所述的條件，或按照儀器或者試劑制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101轉(zhuǎn)化體特異性序列的克隆l實(shí)驗(yàn)材料1.1植物材料轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101，(審批編號農(nóng)基安證字(2009)第074號，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所研發(fā))，本實(shí)驗(yàn)室有保存，可向公眾發(fā)放用于實(shí)驗(yàn)研究。1.2酶與試劑分子生物學(xué)試劑，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker等購自大連寶生物工程有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。1.3實(shí)驗(yàn)儀器PCR擴(kuò)增儀Mastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA測序儀(A卯liedBiosystem377型全自動熒光序列分析儀)DNA電泳分析系統(tǒng)KodakEDAS290(Kodakco.)其它儀器包括離心機(jī)，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。2實(shí)驗(yàn)方法和過程2.1玉米基因組DNA提取與檢測2.1.1玉米基因組DNA提取取子葉期的幼嫩玉米葉片做為DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout試劑盒(天澤基因公司)的操作手冊，進(jìn)行玉米材料總DNA的提取。2丄4DNA檢測取5iU提取的DNA溶液，以O(shè).8%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)其亮度和帶型來初步判斷提取DNA的質(zhì)量。采用紫外分光光度計測定所提取的DNA的濃度和純度。2.2Genomewalking分離轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的轉(zhuǎn)化體特異性序列Genomewalking也是一種擴(kuò)增已知序列旁側(cè)未知區(qū)域序列的方法，主要步驟為基因組DNA酶切、與接頭連接、兩次巢式PCR擴(kuò)增等。本實(shí)施例采用Genomewalking的方法獲得了轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的轉(zhuǎn)化體特異性序列。具體步驟參照GenomeWalkerTMUniversalKit(Takara大連公司)試劑盒說明，本實(shí)施例進(jìn)行了部分改進(jìn)，主要操作步驟如下。2.2.1基因組DNA酶切分別用NruI、PmacI、ScaI和SmaI酶切轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101基因組DNA，標(biāo)記為DL1DL4。酶切體系為:基因組DNA(O.1yg/yL)，25yL;10X酶切Buffer,lOyL;內(nèi)切酶(10U/iiL)，8iiL;ddH20，57iiL;總體積100yL。37"溫浴2h，取出離心管，低速離心510s，繼續(xù)溫浴1618h。各取5iiL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切是否完全。2.2.2純化酶切產(chǎn)物按回收試劑盒說明書純化酶切產(chǎn)物。2.2.3連接反應(yīng)連接反應(yīng)體系純化的酶切產(chǎn)物，4iiL;接頭(25iiM)，1.9iiL;10X連接Buffer,1.6iiL;T4DNA連接酶(6U/iiL)，0.5iiL;ddH20，8iiL;總體積16iiL?；旌戏磻?yīng)液，16t:溫浴過夜，然后7(TC變性5min。每管加入72yLddH20，混勻，-2(TC保存?zhèn)溆谩?.2.4PCR反應(yīng)GenomeWalking共需要兩輪PCR反應(yīng)，其PCR的反應(yīng)體系見表1。表1反應(yīng)體系(iiL)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>兩輪PCR擴(kuò)增的程序見表2。表2GenomeWalking擴(kuò)增程序<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.2.5序列測定和分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳，采用QIAquickGelExtractionkit回收擴(kuò)增片段，連接到pGEM-Teasy(Promega，Madison，Wis.)，采用ABIPRISM1300GeneticAnalyzer進(jìn)行序列測定。采用軟件vectorNTIlO.0(Invitrogen)對測定的序列進(jìn)行拼接和分析。在NCBI數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN檢索相似的基因組序列。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101轉(zhuǎn)化體特異性序列測定經(jīng)過GenomeWalking獲得轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的轉(zhuǎn)化體特異性序列。GenomeWalking以引物GW1-P1和GW1-P2(表3)分別進(jìn)行第一輪和第二輪PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得1345bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1，4泳道)。表3Ge謹(jǐn)eWalking弓l物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3.2轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101轉(zhuǎn)化體特異性序列分析將獲得的1345bp序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析，其中l(wèi)_509bp為轉(zhuǎn)化載體重組序列，510-1345bp為玉米基因組序列。實(shí)施例2本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體特異性PCR方法應(yīng)用于鑒定轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA4301011實(shí)驗(yàn)材料1.1植物材料轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101，(審批編號農(nóng)基安證字(2009)第074號，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所研發(fā))，本實(shí)驗(yàn)室有保存，可向公眾發(fā)放用于實(shí)驗(yàn)研究。IO個非轉(zhuǎn)基因玉米材料，購自市場。1.2酶與試劑分子生物學(xué)試劑，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、Marker等購自大連寶生物生物工程有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。1.3實(shí)驗(yàn)儀器PCR擴(kuò)增儀Mastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA電泳分析系統(tǒng)KodakEDAS290(Kodakco.)其它儀器包括離心機(jī)，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。2實(shí)驗(yàn)方法和過程2.1玉米基因組DNA提取與檢測見實(shí)施例1中2.1玉米基因組DNA提取與檢測。2.2轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的轉(zhuǎn)化體特異性PCR方法本發(fā)明的PCR方法應(yīng)用于鑒別玉米樣品中是否含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA德Ol。采用引物101-F/101-R組合(序列見表4)，檢測購自市場的IO個玉米樣品，見圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101能特異性擴(kuò)增出228bp的產(chǎn)物，檢測的10個市場樣品中均未擴(kuò)增出相同大小的片段?？寺∞D(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的擴(kuò)增片段，按實(shí)施例1中"2.2.5序列測定和分析"進(jìn)行序列分析。序列分析結(jié)果表明，擴(kuò)增片段序列與SEQIDN01的378-605位完全一致。檢測結(jié)果表明本發(fā)明提供的PCR方法能很好地鑒別出玉米樣品中是否含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101。PCR反應(yīng)體系為0.25iiLrTaq(5U/iiL)，5iiL10XPCRBuffer(Mg2+Plus)，4iiLdNTP(各2.5mM)，引物各2yL(10yM)，模板各2yL(20ng/yL)，加滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積至50iiL。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min;94°C變性30sec，52°C退火30sec，72°C延伸30sec，35個循環(huán)；72。C10min。表4鑒別轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的轉(zhuǎn)化體特異性PCR引物引物序列101-F5'-TTAAGTTGGGTAACGCCAGG-3'101-R5'-AGCTCGAACTCACAAATGAG-3'8權(quán)利要求鑒定轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測方法，其特征在于PCR反應(yīng)中的正向引物依據(jù)SEQIDNO1中1-509位序列設(shè)計，反向引物依據(jù)SEQIDNO1的510-1345位序列設(shè)計。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR檢測方法，所述正向引物為101-F:5'-TTAAGTTGGGTAACGCCAGG-3'，所述反向引物為101-R:5'-AGCTCGAACTCACAAATGAG-3'，擴(kuò)增的片段為長度為228bp。全文摘要本發(fā)明“一種鑒定轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測方法”，屬于轉(zhuǎn)基因植物檢測領(lǐng)域。鑒定轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測方法，其特征在于PCR反應(yīng)中的正向引物依據(jù)SEQIDNO1中1-509位序列設(shè)計，反向引物依據(jù)SEQIDNO1的510-1345位序列設(shè)計。本發(fā)明的PCR方法可作為一種鑒定轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101的有效手段，為區(qū)分和鑒別轉(zhuǎn)基因玉米品系提供了便利，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、靈敏度高、特異性好、所需實(shí)驗(yàn)條件不高，因此有非常高的實(shí)用價值。文檔編號C12Q1/68GK101792812SQ201010143850公開日2010年8月4日申請日期2010年4月7日優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日發(fā)明者孫爻,彭于發(fā),謝家建申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所