專利名稱：一種烏魚活性肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種烏魚活性肽的制備方法。

背景技術(shù)：
烏魚，又名鱧魚(Ophiolephalus argus Cantor)是一種廣泛分布于我國(guó)各地的江河、湖泊、溝塘、池沼中的肉食性淡水魚類。其含肉率高，蛋白質(zhì)含量高，骨刺少，味道鮮美，素有“魚中珍品”之稱，一向被視為病后康復(fù)和老幼體虛者的滋補(bǔ)珍品。尤其是我國(guó)民間有食用烏魚湯促進(jìn)各種傷口愈合的應(yīng)用傳統(tǒng)，也有烏鱧和月鱧湯能促進(jìn)小鼠傷口愈合和抗疲勞的作用的文獻(xiàn)報(bào)道(2005，右江醫(yī)學(xué))。
烏魚湯的主要營(yíng)養(yǎng)和功效成分為蛋白質(zhì)，烏魚蛋白質(zhì)在被人體攝入后，經(jīng)體內(nèi)各種蛋白酶水解成游離氨基酸和小分子肽后被人體吸收，發(fā)揮各種營(yíng)養(yǎng)和活性作用，由于人的個(gè)體差異，烏魚的蛋白質(zhì)的消化率和吸收利用率各不相同，且烏魚湯中的蛋白質(zhì)僅占烏魚總蛋白的35％左右，煮湯后的烏魚肉多不為人喜食，以致烏魚蛋白質(zhì)的利用率低。現(xiàn)代科學(xué)研究證實(shí)小分子的肽比氨基酸具有更高的生物活性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且小分子肽可以通過腸道全部吸收和利用，直接經(jīng)血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)至全身各器官和組織而發(fā)揮生物活性功能。以烏魚為原料制備得到的烏魚活性肽不僅具有上述優(yōu)點(diǎn)，還可能將烏魚蛋白質(zhì)充分利用并轉(zhuǎn)化為活性肽，同時(shí)產(chǎn)物還具有良好的酸、熱穩(wěn)定性、溶解性和低黏度性等，不但可以作為食品原料或輔料應(yīng)用于嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)配方食品、方便食品、速溶飲品和調(diào)味品等，還可用于營(yíng)養(yǎng)食品、功能食品和運(yùn)動(dòng)食品等領(lǐng)域。
目前尚未見到利用蛋白酶酶解制備烏魚活性肽的文獻(xiàn)和公開專利技術(shù)，現(xiàn)有的公開專利技術(shù)也未涉及采用膜分離技術(shù)專門制備小分子烏魚活性肽的方法?，F(xiàn)有的公開專利技術(shù)雖有關(guān)于蛋白酶酶解制備帶魚多肽、鮑魚多肽、魚肽營(yíng)養(yǎng)液的方法，如申請(qǐng)?zhí)枮?00710164544.1的《帶魚多肽的制備方法》，申請(qǐng)?zhí)枮?00510068010.X的《鮑魚多肽的制備方法和用途》，申請(qǐng)?zhí)枮?00810160160.7的《一種鮑魚活性肽的制備方法》，申請(qǐng)?zhí)枮?3132519.X的《魚肽營(yíng)養(yǎng)液及由淡水魚副產(chǎn)物生產(chǎn)魚肽營(yíng)養(yǎng)液的方法》，但上述方法獲得的產(chǎn)物存有大量游離氨基酸和分子量范圍不明的蛋白質(zhì)和肽。而本發(fā)明則是一種以烏魚為底物，采用蛋白酶酶解和膜分離技術(shù)專門制備烏魚活性肽的方法。本發(fā)明涉及的蛋白酶酶解是一些經(jīng)優(yōu)化的酶解方案。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種烏魚活性肽的制備方法，制備的烏魚活性肽肽含量高、分子量小于10000Da、易于被人體吸收。
本發(fā)明的技術(shù)方案為以烏魚原料經(jīng)蛋白酶解、膜分離技術(shù)制備一種烏魚活性肽，主要成分為肽，含量在60％以上，平均分子量小于10000Da。其特征在于工藝步驟為(A)烏魚經(jīng)剖殺、去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜。(B)將上述肉糜，加入質(zhì)量比為肉糜1.5至10倍的水?dāng)嚢杈鶆蚝螅{(diào)pH至6-9，升溫至75-95℃保溫20-30分鐘，再調(diào)整溫度至45℃-70℃，加入蛋白酶酶解，蛋白酶用量為肉糜濕重的0.25‰-8‰，酶解時(shí)間為2-12小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為85-100℃，滅酶時(shí)間10-30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至20℃-50℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)初濾或精濾或超濾或納濾后，再濃縮、干燥即得。
作為一種優(yōu)選方案，步驟B中蛋白酶為木瓜蛋白酶，或風(fēng)味蛋白酶，或復(fù)合蛋白酶，或中性蛋白酶，或按質(zhì)量份數(shù)比為10％-90％的風(fēng)味蛋白酶和90％-10％的復(fù)合蛋白酶復(fù)配而成的酶，或按質(zhì)量份數(shù)比為10％-90％的木瓜蛋白酶和90％-10％的復(fù)合蛋白酶復(fù)配而成的酶，或按質(zhì)量份數(shù)比為10％-90％的木瓜蛋白酶和90％-10％的風(fēng)味蛋白酶復(fù)配而成的酶，或按質(zhì)量份數(shù)比為10％-90％的中性蛋白酶和90％-10％的復(fù)合蛋白酶復(fù)配而成的酶，或按質(zhì)量份數(shù)比為10％-90％的中性蛋白酶和90％-10％的木瓜蛋白酶復(fù)配而成的酶，或按質(zhì)量份數(shù)比為10％-90％的中性蛋白酶和90％-10％的風(fēng)味蛋白酶復(fù)配而成的酶； 作為一種優(yōu)選方案，步驟B中酶解液初濾為過濾或板框壓濾機(jī)過濾，濾材為純綿帆布或尼龍濾布。
作為一種優(yōu)選方案，步驟B中酶解液精濾為過濾或板框壓濾機(jī)初濾后的濾液，用無(wú)機(jī)陶瓷膜或有機(jī)膜微濾除去雜蛋白、筋膜碎片，其特征在于無(wú)機(jī)陶瓷膜材質(zhì)為氧化鋁、氧化鋯或氧化銻，截留粒子范圍為0.05-1μm。有機(jī)膜材質(zhì)為聚砜、醋酸纖維、聚四氟乙烯或聚丙烯類等有機(jī)高分子材料，截留粒子范圍為0.05-1μm。
作為一種優(yōu)選方案，步驟B中酶解液超濾為酶解液精濾后的濾液用有機(jī)復(fù)合膜超濾截留收獲分子量小于10000Da的肽。其特征在于有機(jī)復(fù)合膜材質(zhì)為芳香聚酰胺、聚哌嗪酰胺類或聚醚砜類，截留分子量范圍為小于10000Da。
作為一種優(yōu)選方案，步驟B中酶解液納濾為酶解液用有機(jī)復(fù)合膜超濾截留收獲分子量小于10000Da的肽后，再經(jīng)納濾除去大部分水分、游離氨基酸，其特征在于納濾的有機(jī)復(fù)合膜材質(zhì)為芳香聚酰胺、聚哌嗪酰胺類或聚醚砜類，截留分子量范圍為150-1000Da。
作為一種優(yōu)選方案，步驟B中的干燥為真空干燥或噴霧干燥或冷凍干燥；噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為85℃-130℃。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是烏魚活性肽的肽含量高、分子量小于10000Da、易于被人體吸收，并具有抗疲勞、促進(jìn)傷口愈合、提高免疫力等生物活性，制備工藝科學(xué)合理，環(huán)保無(wú)污染，分離過程為常溫操作，節(jié)省能源，操作簡(jiǎn)便易行，效率高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入10倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝螅郎?5℃保溫20分鐘，再調(diào)整并維持溫度至69±1℃，調(diào)pH至9，加入木瓜蛋白酶16g進(jìn)行酶解；酶解時(shí)間為12小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為90℃，滅酶時(shí)間10分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至30℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)離心和板框壓濾機(jī)初濾，濾材為純綿帆布，然后濃縮、真空干燥即得。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.311公斤，分子量小于10000Da的肽含量為69％。
實(shí)施例2 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入1.5倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝?，升?5℃保溫30分鐘，再調(diào)整并維持溫度至55±1℃，調(diào)pH至9，加入諾維信產(chǎn)復(fù)合蛋白酶0.5g進(jìn)行酶解；酶解時(shí)間為2小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為85℃，滅酶時(shí)間30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至20℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)離心和板框壓濾機(jī)初濾，再經(jīng)截留粒徑1μm的氧化鋯陶瓷膜精濾，濾過壓0.15Mpa，然后濃縮、真空干燥即得。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.115公斤，分子量小于10000Da的肽含量為64％。
實(shí)施例3 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入3倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝?，升?0℃保溫20分鐘，再調(diào)整并維持溫度至45±1℃，調(diào)pH至6，加入諾維信產(chǎn)風(fēng)味蛋白酶6g進(jìn)行酶解；酶解時(shí)間為8小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為90℃，滅酶時(shí)間30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至30℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)離心和板框壓濾機(jī)初濾，再經(jīng)截留粒徑0.05μm的氧化銻陶瓷膜精濾，濾過壓0.25Mpa，濾液再經(jīng)截留分子量小于10000Da的聚醚砜類有機(jī)復(fù)合膜超濾，濾過壓0.2Mpa，截留收獲分子量為小于10000Da的肽液，然后濃縮、真空干燥即得。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.145公斤，肽含量為89％，分子量小于10000Da。
實(shí)施例4 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入10倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝?，升?5℃保溫28分鐘，再調(diào)整并維持溫度至50±1℃，調(diào)pH至7.0，加入中性蛋白酶8g進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為6小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為100℃，滅酶時(shí)間10分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至80℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)離心過濾，再經(jīng)截留粒徑0.1μm的氧化鋁陶瓷膜精濾，濾過壓0.15Mpa，濾液再經(jīng)截留分子量小于10000Da的聚哌嗪酰胺類有機(jī)復(fù)合膜超濾，濾過壓0.18Mpa，截留收獲分子量為小于10000Da的肽液，超濾后的酶解液再經(jīng)截留分子量范圍300-1000Da的聚酰胺類有機(jī)復(fù)合膜納濾，濾過壓0.15-0.45Mpa，截留收獲分子量為小于1000Da的肽液，然后濃縮、噴霧干燥噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為130℃，即得。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.131公斤，肽含量為91.5％，分子量小于1000Da。
實(shí)施例5 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入10倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝?，升?0℃保溫20分鐘，再調(diào)整并維持溫度至50±1℃，調(diào)pH至7.5，加入諾維信風(fēng)味蛋白酶與復(fù)合蛋白酶(質(zhì)量份數(shù)比為諾維信風(fēng)味蛋白酶10％，復(fù)合蛋白酶90％)共8g進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為12小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為90℃，滅酶時(shí)間30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至30℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)初濾，濾材為尼龍濾布，再經(jīng)截留粒徑0.1μm的聚砜有機(jī)膜精濾，濾過壓0.18Mpa，濾液再經(jīng)截留分子量小于6000Da的芳香聚酰胺類有機(jī)復(fù)合膜超濾，濾過壓0.2Mpa，截留收獲分子量為小于6000Da的肽液，然后濃縮、噴霧干燥，即得。噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為100℃。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.167公斤，肽含量為88.4％，分子量小于6000Da。
實(shí)施例6 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入5倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝螅{(diào)pH至7.5，升溫90℃保溫20分鐘，再調(diào)整并維持溫度至50±1℃，加入諾維信風(fēng)味蛋白酶與復(fù)合蛋白酶(質(zhì)量份數(shù)比為諾維信風(fēng)味蛋白酶90％，復(fù)合蛋白酶10％)共6g進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為6小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為90℃，滅酶時(shí)間30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至30℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)初濾，濾材為純棉帆布，再經(jīng)截留粒徑0.1μm的聚四氟乙烯有機(jī)膜精濾，濾過壓0.1Mpa，濾液再經(jīng)截留分子量小于10000Da的聚醚砜類有機(jī)復(fù)合膜超濾，濾過壓0.2Mpa，截留收獲分子量為小于10000Da的肽液，超濾后的酶解液再經(jīng)截留分子量范圍300-1000Da的芳香聚酰胺類有機(jī)復(fù)合膜納濾，濾過壓0.15-0.45Mpa，截留收獲分子量為小于1000Da的肽液，然后濃縮、噴霧干燥，即得。噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為85℃。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.128公斤，肽含量為92.4％，蛋白質(zhì)分子量小于1000Da。
實(shí)施例7 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入10倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝?，升?5℃保溫30分鐘，再調(diào)整并維持溫度至55±1℃，調(diào)pH至7，加入諾維信中性蛋白酶與諾維信復(fù)合蛋白酶共8g(質(zhì)量份數(shù)比為諾維信風(fēng)味蛋白酶90％，復(fù)合蛋白酶10％)，酶解時(shí)間為12小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為90℃，滅酶時(shí)間30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至30℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)初濾，濾材為尼龍濾布，再經(jīng)截留粒徑0.1μm的醋酸纖維有機(jī)膜精濾，濾過壓0.15Mpa，濾液再經(jīng)截留分子量小于10000Da的芳香聚酰胺類有機(jī)復(fù)合膜超濾，濾過壓0.2Mpa，截留收獲分子量為小于10000Da的肽液，然后濃縮、噴霧干燥，即得。噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為100℃。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.218公斤，肽含量為70.8％，分子量小于10000Da。
實(shí)施例8 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入5倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝?，升?0℃保溫25分鐘，再調(diào)整并維持溫度至45±1℃，調(diào)pH至9，加入諾維信產(chǎn)中性蛋白酶與諾維信復(fù)合蛋白酶(質(zhì)量份數(shù)比為諾維信風(fēng)味蛋白酶10％，復(fù)合蛋白酶90％)共5g，進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為5小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為85℃，滅酶時(shí)間30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至30℃，分離除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)離心和過濾，再經(jīng)截留粒徑0.1μm的氧化鋯陶瓷膜精濾，濾過壓0.15Mpa，濾液再經(jīng)截留分子量小于10000Da的聚醚砜類有機(jī)復(fù)合膜超濾，濾過壓0.15Mpa，截留收獲分子量為小于10000Da的肽液，然后濃縮、噴霧干燥，即得。噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為90℃。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.208公斤，肽含量為77.8％，分子量小于10000Da。
實(shí)施例9 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚肉2公斤。
將上述肉糜，加入10倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝?，升?0℃保溫25分鐘，再調(diào)整并維持溫度至50±1℃，調(diào)pH至8，加入諾維信木瓜蛋白酶與諾維信復(fù)合蛋白酶(質(zhì)量份數(shù)比為諾維信木瓜蛋白酶90％，諾維信復(fù)合蛋白酶10％)共8g，進(jìn)行酶解，酶解6小時(shí)后再調(diào)整并維持溫度至60±1℃，繼續(xù)酶解6小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為88℃，滅酶時(shí)間30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至20℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)初濾，濾材為純綿帆布，再經(jīng)截留粒徑0.1μm的氧化鋯陶瓷膜精濾，濾過壓0.15Mpa，濾液再經(jīng)截留分子量小于10000Da的聚醚砜類有機(jī)復(fù)合膜超濾，濾過壓0.18Mpa，截留收獲分子量為小于10000Da的肽液，然后濃縮、噴霧干燥，即得。噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為130℃。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.259公斤，肽含量為75.9％，蛋白質(zhì)分子量小于10000Da。
實(shí)施例10 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入5倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝?，升?0℃保溫25分鐘，再調(diào)整并維持溫度至60±1℃，調(diào)pH至8，加入諾維信木瓜蛋白酶與諾維信復(fù)合蛋白酶(質(zhì)量份數(shù)比為諾維信木瓜蛋白酶10％，諾維信復(fù)合蛋白酶90％)共8g，進(jìn)行酶解，酶解6小時(shí)后再調(diào)整并維持溫度至60±1℃，繼續(xù)酶解6小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為100℃，滅酶時(shí)間30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至20℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)初濾，濾材為純綿帆布，再經(jīng)截留粒徑0.1μm的氧化鋯陶瓷膜精濾，濾過壓0.15Mpa，濾液再經(jīng)截留分子量小于10000Da的聚醚砜類有機(jī)復(fù)合膜超濾，濾過壓0.18Mpa，截留收獲分子量為小于10000Da的肽液，超濾后的酶解液再經(jīng)截留分子量范圍300-1000Da的芳香聚酰胺類有機(jī)復(fù)合膜納濾，濾過壓0.15-0.45Mpa，截留收獲分子量為小于1000Da的肽液，然后濃縮、噴霧干燥，即得。噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為120℃。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.184公斤，肽含量為93.1％，蛋白質(zhì)分子量小于1000Da。
實(shí)施例11 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入8倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝螅{(diào)pH值至9，升溫80℃保溫30分鐘，再調(diào)整并維持溫度至48±1℃，加入諾維信中性蛋白酶與諾維信木瓜蛋白酶(質(zhì)量份數(shù)比為諾維信中性蛋白酶90％，諾維信木瓜蛋白酶10％)共8g，進(jìn)行酶解，酶解4小時(shí)后再調(diào)整并維持溫度至70±1℃，繼續(xù)酶解8小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為90℃，滅酶時(shí)間30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至20℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)離心和過濾，再經(jīng)截留粒徑0.1μm的氧化鋯陶瓷膜精濾，濾過壓0.15Mpa，濾液再經(jīng)截留分子量小于10000Da的聚醚砜類有機(jī)復(fù)合膜超濾，濾過壓0.18Mpa，截留收獲分子量小于10000Da的肽液，然后濃縮、冷凍干燥，即得。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.226公斤，肽含量為88.8％，分子量小于10000Da。
實(shí)施例12 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入10倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝螅郎?5℃保溫30分鐘，再調(diào)整并維持溫度至48±1℃，調(diào)pH至8，加入諾維信中性蛋白酶與諾維信木瓜蛋白酶(質(zhì)量份數(shù)比為諾維信中性蛋白酶10％，諾維信木瓜蛋白酶90％)共8g，進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為12小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為88℃，滅酶時(shí)間30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至20℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)離心和過濾，再經(jīng)截留粒徑0.1μm的氧化鋯陶瓷膜精濾，濾過壓0.15Mpa，濾液再經(jīng)截留分子量小于10000Da的聚醚砜類有機(jī)復(fù)合膜超濾，濾過壓0.18Mpa，截留收獲分子量為小于10000Da的肽液，超濾后的酶解液再經(jīng)截留分子量范圍300-1000Da的聚酰胺類有機(jī)復(fù)合膜納濾，濾過壓0.15-0.45Mpa，截留收獲分子量為小于1000Da的肽液，然后濃縮、噴霧干燥，即得。噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為85℃。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.181公斤，肽含量為86.1％，蛋白質(zhì)分子量小于1000Da。
實(shí)施例13 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入10倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝?，升?5℃保溫20分鐘，再調(diào)整并維持溫度至55±1℃，調(diào)pH至7，加入諾維信中性蛋白酶與諾維信風(fēng)味蛋白酶(質(zhì)量份數(shù)比為諾維信中性蛋白酶90％，諾維信風(fēng)味蛋白酶10％)共0.6g進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為12小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為90℃，滅酶時(shí)間25分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至20℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)初濾，濾材為純綿帆布，再經(jīng)截留粒徑0.1μm的氧化鋯陶瓷膜精濾，濾過壓0.15Mpa，濾液濃縮、噴霧干燥，即得。噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為95℃。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.221公斤，分子量小于10000Da的肽含量為73.5％。
實(shí)施例14 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入5倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝?，升?0℃保溫20分鐘，再調(diào)整并維持溫度至55±1℃，調(diào)pH至8，加入諾維信中性蛋白酶與諾維信風(fēng)味蛋白酶(質(zhì)量份數(shù)比為諾維信中性蛋白酶10％，諾維信風(fēng)味蛋白酶90％)共8g，進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為6小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為90℃，滅酶時(shí)間25分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至20℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)初濾，濾材為純綿帆布，再經(jīng)截留粒徑0.1μm的氧化鋯陶瓷膜精濾，濾過壓0.15Mpa，濾液再經(jīng)截留分子量小于10000Da的聚醚砜類有機(jī)復(fù)合膜超濾，濾過壓0.18Mpa，截留收獲分子量為小于10000Da的肽液，超濾后的酶解液再經(jīng)截留分子量范圍300-1000Da的聚酰胺類有機(jī)復(fù)合膜納濾，濾過壓0.15-0.45Mpa，截留收獲分子量為小于1000Da的肽液，然后濃縮、噴霧干燥，即得。噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為90℃。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.139公斤，肽含量為89.7％，分子量小于1000Da。
實(shí)施例15 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入10倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝?，升?0℃保溫28分鐘，再調(diào)整并維持溫度至55±1℃，調(diào)pH至8，加入諾維信木瓜蛋白酶與諾維信風(fēng)味蛋白酶(質(zhì)量份數(shù)比為諾維信木瓜蛋白酶90％，諾維信復(fù)合蛋白酶10％)共8g，進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為12小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為88℃，滅酶時(shí)間30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至30℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)初濾，濾材為純綿帆布，然后濃縮、噴霧干燥，即得。噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為95℃。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽成品0.278公斤，分子量小于10000Da肽含量為64.8％。
實(shí)施例16 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入5倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝?，升?0℃保溫28分鐘，再調(diào)整并維持溫度至55±1℃，調(diào)pH至8，加入諾維信木瓜蛋白酶與諾維信風(fēng)味蛋白酶(質(zhì)量份數(shù)比為諾維信木瓜蛋白酶90％，諾維信復(fù)合蛋白酶10％)共8g，進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為6小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為88℃，滅酶時(shí)間30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至30℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)初濾，濾材為純綿帆布，再經(jīng)截留粒徑0.1μm的氧化鋯陶瓷膜精濾，濾過壓0.15Mpa，濾液再經(jīng)截留分子量小于10000Da的聚醚砜類有機(jī)復(fù)合膜超濾，濾過壓0.18Mpa，截留收獲分子量為小于10000Da的肽液，超濾后的酶解液再經(jīng)截留分子量范圍300-1000Da的聚酰胺類有機(jī)復(fù)合膜納濾，濾過壓0.15-0.45Mpa，截留收獲分子量為小于1000Da的肽液，然后濃縮、噴霧干燥，即得。噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為85℃。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽成品0.194公斤，肽含量為85.3％，蛋白質(zhì)分子量小于1000Da。
實(shí)施例17 取經(jīng)剖殺，去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜的烏魚2公斤。
將上述肉糜，加入1.5倍量的水?dāng)嚢杈鶆蚝?，升?5℃保溫22分鐘，再調(diào)整并維持溫度至50±1℃，調(diào)pH至7，加入諾維信風(fēng)味蛋白酶和諾維信復(fù)合蛋白酶(質(zhì)量份數(shù)比為諾維信風(fēng)味蛋白酶30％，諾維信復(fù)合蛋白酶70％)共6g，進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為3小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為100℃，滅酶時(shí)間30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至30℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)初濾，濾材為尼龍濾布，再經(jīng)截留粒徑0.1μm的氧化鋯陶瓷膜精濾，濾過壓0.15Mpa，濾液再經(jīng)截留分子量小于6000Da的聚醚砜類有機(jī)復(fù)合膜超濾，濾過壓0.18Mpa，截留收獲分子量為小于6000Da的肽液，然后濃縮、噴霧干燥，即得。噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為120℃。
上述干燥步驟完成后制得烏魚活性肽0.187公斤，肽含量為84.5％，分子量小于6000Da。
采用本發(fā)明實(shí)施例17方法制備所得烏魚活性肽和烏魚湯進(jìn)行活性實(shí)驗(yàn)對(duì)比，活性對(duì)比實(shí)驗(yàn)如下 1.烏魚活性肽促進(jìn)傷口愈合功能實(shí)驗(yàn) 取小鼠40只，體重18-22g，雌雄各半，均分為4組，分別為空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥物組、烏魚活性肽給藥組、烏魚湯給藥組。分別在小鼠頸背部作1.5×1.5cm大創(chuàng)面為模型，建立模型后，用生理鹽水沖洗傷口，碘酒、酒精消毒，均用凡士林油紗敷蓋，再用無(wú)菌干紗布包扎。陽(yáng)性藥物組給予云南白藥膠囊，劑量為60mg/kg體重，烏魚活性肽給藥組給予烏魚活性肽，劑量為1.5g/kg體重，烏魚湯給藥組為劑量相同的烏魚湯，正常對(duì)照組小鼠給予同等容量生理鹽水，每天灌胃一次，連續(xù)9天，每只小鼠每天用生理鹽水沖洗傷口后各用原法處理。第3、6、9天觀察、測(cè)量傷口面積，計(jì)算傷口愈合率。傷口愈合率＝(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積。結(jié)果見表1。結(jié)果表明與烏魚湯給藥組相比，本發(fā)明方法制備的烏魚活性肽給藥組能更好的起到促進(jìn)傷口愈合的作用。
表1 各處理組傷口模型小鼠第3、6、9天傷口愈合率

與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01 2.烏魚活性肽增強(qiáng)免疫功能實(shí)驗(yàn) 取昆明種小鼠30只，體重14-18g，雌雄各半，隨機(jī)分為3組，分別為生理鹽水組，烏魚活性肽給藥組、烏魚湯給藥組，灌胃給藥7天，劑量為1.5g/kg體重，烏魚活性肽給藥組給予烏魚活性肽(經(jīng)實(shí)施例17制得)，烏魚湯給藥組給予劑量相同的烏魚湯，生理鹽水對(duì)照組灌胃以給藥組同等體積的生理鹽水，每天一次，于末次給藥后24小時(shí)，頸椎脫位處死，稱體重，摘出胸腺及脾臟稱重，以胸腺或脾臟重量與體重之比作胸腺或脾指數(shù)。結(jié)果見表2。結(jié)果表明烏魚活性肽能顯著增加小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，有增強(qiáng)小鼠免疫功能作用。同時(shí)也可以看出比較之下本發(fā)明方法制備的烏魚活性肽具有更好的增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用。
表2 烏魚活性肽對(duì)小鼠免疫器官重量的影響

與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01 3.烏魚活性肽抗疲勞功能實(shí)驗(yàn) 取昆明種小鼠30只，體重18-22g，雌雄各半，隨機(jī)分為3組，給藥組給予烏魚活性肽(經(jīng)實(shí)施例17制得)，劑量為1.5g/kg體重，烏魚湯給藥組給予劑量相同的烏魚湯，生理鹽水對(duì)照組灌胃以給藥組同等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥7天，每天一次，于末次給藥30min后將小鼠尾根部負(fù)荷7％體重的鉛絲，放入水溫20±0.5℃、水深20cm的玻璃缸內(nèi)游泳，并開始計(jì)時(shí)。當(dāng)小鼠頭部沉入水中10s不能浮出水面者即為體力耗竭，計(jì)為小鼠游泳時(shí)間。結(jié)果見表3。結(jié)果表明本發(fā)明所制備的烏魚活性肽能更顯著地延長(zhǎng)小鼠游泳時(shí)間，說(shuō)明本發(fā)明所制備的烏魚活性肽有更為顯著的抗疲勞作用。
表3 烏魚活性肽對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響

與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.0權(quán)利要求
1.一種烏魚活性肽的制備方法，其特征在于工藝步驟為(A)烏魚經(jīng)剖殺、去內(nèi)臟后剁碎、打漿成肉糜；(B)將上述肉糜，加入質(zhì)量比為肉糜1.5至10倍的水?dāng)嚢杈鶆蚝?，調(diào)pH至6-9，升溫至75-95℃保溫20-30分鐘，再調(diào)整溫度至45℃-70℃，加入蛋白酶酶解，蛋白酶用量為肉糜濕重的0.25‰-8‰，酶解時(shí)間為2-12小時(shí)；酶解后酶解液升溫滅酶，滅酶溫度為85-100℃，滅酶時(shí)間10-30分鐘；滅酶后酶解液冷卻降溫至20℃-50℃，除去上層脂肪，取酶解液經(jīng)初濾，或初濾和精濾，或初濾和精濾和超濾，或初濾和精濾和超濾和納濾后，再濃縮、干燥即得。
2.如權(quán)利要求1所述的烏魚活性肽的制備方法，其特征在于原材料為烏魚，也稱鱧魚。
3.如權(quán)利要求1所述的烏魚活性肽的制備方法，其特征在于酶解所用蛋白酶為木瓜蛋白酶，或風(fēng)味蛋白酶，或復(fù)合蛋白酶，或中性蛋白酶，或按質(zhì)量份數(shù)比為10％-90％的風(fēng)味蛋白酶和90％-10％的復(fù)合蛋白酶復(fù)配而成的酶，或按質(zhì)量份數(shù)比為10％-90％的木瓜蛋白酶和90％-10％的復(fù)合蛋白酶復(fù)配而成的酶，或按質(zhì)量份數(shù)比為10％-90％的木瓜蛋白酶和90％-10％的風(fēng)味蛋白酶復(fù)配而成的酶，或按質(zhì)量份數(shù)比為10％-90％的中性蛋白酶和90％-10％的復(fù)合蛋白酶復(fù)配而成的酶，或按質(zhì)量份數(shù)比為10％-90％的中性蛋白酶和90％-10％的木瓜蛋白酶復(fù)配而成的酶，或按質(zhì)量份數(shù)比為10％-90％的中性蛋白酶和90％-10％的風(fēng)味蛋白酶復(fù)配而成的酶。
4.如權(quán)利要求1所述的烏魚活性肽的制備方法，步驟B中酶解液初濾為滅酶除脂后的酶解液經(jīng)過普通過濾或離心過濾或板框壓濾機(jī)過濾為初濾，其特征在于濾材為純綿帆布或尼龍濾布。
5.如權(quán)利要求1所述的烏魚活性肽的制備方法，步驟B中酶解液精濾為經(jīng)普通過濾或離心過濾或板框壓濾機(jī)初濾后的濾液，用無(wú)機(jī)陶瓷膜或有機(jī)微濾膜進(jìn)行精濾，其特征在于無(wú)機(jī)陶瓷膜材質(zhì)為氧化鋁、氧化鋯或氧化銻，截留粒子范圍為0.05-1μm。有機(jī)微濾膜材質(zhì)為聚砜、醋酸纖維、聚四氟乙烯或聚丙烯類等有機(jī)高分子材料，截留粒子范圍為0.05-1μm。
6.如權(quán)利要求1所述的烏魚活性肽的制備方法，步驟B中酶解液超濾為精濾后的酶解液采用有機(jī)超濾膜進(jìn)行超濾，其特征在于超濾所用的有機(jī)復(fù)合膜材質(zhì)為芳香聚酰胺、聚哌嗪酰胺類或聚醚砜類，截留分子量范圍為小于10000Da，超濾后收獲分子量小于10000Da的烏魚活性肽。
7.如權(quán)利要求1所述的烏魚活性肽的制備方法，步驟B中酶解液納濾為超濾后的酶解液采用有機(jī)納濾膜進(jìn)行納濾，其特征在于納濾所用有機(jī)復(fù)合膜材質(zhì)為芳香聚酰胺、聚哌嗪酰胺類或聚醚砜類，截留分子量范圍為150-1000Da，納濾后收獲分子量小于1000Da的烏魚活性肽。
8.如權(quán)利要求1所述的烏魚活性肽的制備方法，其特征在于干燥的方法為真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥；在噴霧干燥時(shí)，設(shè)備進(jìn)口熱風(fēng)溫度為85℃-130℃。
全文摘要
一種烏魚活性肽的制備方法，它是以烏魚為原料，通過先進(jìn)的酶解和膜分離技術(shù)，制得肽含量高、分子量小于10000Da、易于被人體吸收的活性肽，它具有促進(jìn)傷口愈合、抗疲勞、提高免疫等生物活性，特別適合于手術(shù)后病人的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充和促進(jìn)傷口愈合，以及各類人群的滋補(bǔ)和治療，同時(shí)制備工藝科學(xué)合理，環(huán)保無(wú)污染，分離過程為常溫操作，節(jié)省能源，操作簡(jiǎn)便易行，效率高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A23J1/04GK101816367SQ20101014470
公開日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月12日
發(fā)明者田穎剛 申請(qǐng)人:田穎剛