專利名稱：產(chǎn)生o-乙酰高絲氨酸的微生物和利用所述微生物產(chǎn)生o-乙酰高絲氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠以高產(chǎn)量產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸(L-蛋氨酸前體)的微生物株。另 外，本發(fā)明還涉及利用所述微生物株高產(chǎn)量地產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的方法。
背景技術(shù)：
可以通過化學(xué)或生物學(xué)方式合成在動(dòng)物飼料、食品和醫(yī)藥中使用的蛋氨酸。在化學(xué)合成中，蛋氨酸基本上是通過水解5_( β-甲基巰基乙基)乙內(nèi)酰脲產(chǎn)生 的。然而，合成的蛋氨酸的不利之處在于以L-型和D-型的混合物的形式存在，這需要困難 的額外方法將它們彼此分開。為了解決該問題，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了用于選擇性地合成 L-蛋氨酸的生物學(xué)方法，L-蛋氨酸是已有專利申請(W0 2008/103432)要求保護(hù)的化學(xué)物 質(zhì)。該方法(簡稱為“兩步法”)包括發(fā)酵產(chǎn)生L-蛋氨酸前體和由L-蛋氨酸前體向L-蛋 氨酸的酶促轉(zhuǎn)化。所述蛋氨酸前體優(yōu)選包括0-乙酰高絲氨酸和0-琥珀酰高絲氨酸。就對 常規(guī)方法存在的問題的克服對所述兩步法進(jìn)行評價(jià)，所述常規(guī)方法存在的問題例如硫化物 的毒性、蛋氨酸和SAMe在蛋氨酸合成中的反饋調(diào)控，以及胱硫醚Y -合酶、0-琥珀酰高絲 氨酸硫化氫解酶和0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶對中間產(chǎn)物的降解。另外，與產(chǎn)生DL-蛋氨 酸的常規(guī)化學(xué)合成法相比，所述兩步法具有以下優(yōu)點(diǎn)僅對L-蛋氨酸具有選擇性，并且伴 隨產(chǎn)生作為有用副產(chǎn)物的有機(jī)酸，例如琥珀酸和乙酸。作為蛋氨酸生物合成途徑中的中間產(chǎn)物，0-乙酰_高絲氨酸被用作產(chǎn)生蛋氨酸前 體(W0 2008/013432)。如下式所示，在0-乙酰轉(zhuǎn)移酶的協(xié)助下由L-高絲氨酸和乙酰-CoA 合成0-乙酰-高絲氨酸L-高絲氨酸+乙酰-CoA — 0-乙酰-高絲氨酸。在本申請的受讓人的美國專利公開第US 2009-0253186 Al號中公開了其中引入 了 thrA和metX基因以分別提高L-高絲氨酸和0-乙酰高絲氨酸的生物合成的微生物株， 以及利用所述微生物株高產(chǎn)量地產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的方法。關(guān)于這一點(diǎn)，本發(fā)明的發(fā)明 人認(rèn)為增加乙酰-CoA(0-乙酰高絲氨酸的生物合成中使用的兩種底物之一)可提高0-乙
酰高絲氨酸的產(chǎn)量。在大腸桿菌中，大部分乙酰-CoA是由丙酮酸合成的。然而，如果存在過量的葡萄 糖，可以由培養(yǎng)基中累積的乙酸產(chǎn)生乙酰-CoA。從乙酸合成乙酰-CoA可以利用兩種不同的 生物合成途徑。在一種乙酰-CoA生物合成途徑中，存在乙酰腺苷酸(AcAMP)中間產(chǎn)物，而乙 酰-CoA合酶(acetyl-CoA synthase,ACS)通過該中間產(chǎn)物將乙酸活化成乙酰_CoA。在另一 種途徑中，作為由乙酸激酶(ACK)和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)催化的連續(xù)反應(yīng)的結(jié)果，通過乙酰 磷酸將乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,May 1995，p. 2878-2886)。在由乙 酰-CoA合酶介導(dǎo)的生物合成途徑中發(fā)揮重要作用的乙酰-CoA合酶對乙酸具有高親和力， 其甚至可以將細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的低水平乙酸活化成為乙酰-CoA。相比而言，ACK-PTA-介導(dǎo) 的乙酰-CoA生物合成途徑僅在可能由混合酸的發(fā)酵形成的高乙酸水平下進(jìn)行，因?yàn)锳CK和PTA酶對乙酸具有低的親和力(J. Gen. Microbiol. 102 :327_336)。對于乙酰-CoA合酶，由于位于啟動(dòng)子上游的CRP-結(jié)合位點(diǎn)，其表達(dá)在指數(shù)生長前 在轉(zhuǎn)錄水平上受到代謝物阻遏控制的抑制，而此后當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入靜止期時(shí)，其表達(dá)增高(Mol Microbiol. 2004 Jan ；51(1) :241_54·)。因此，可以通過ACK-PTA途徑將在發(fā)酵中期累積的乙酸活化成乙酰-CoA。然而，由 于ACK-PTA途徑是可逆的，如果乙酸的水平低，那么乙酰-CoA被轉(zhuǎn)化為乙酸。也就是說，在 ACK-PTA途徑中可能發(fā)生乙酰-CoA的消耗，顯示出對0-乙酰高絲氨酸合成的負(fù)作用。在乙酰-C0A的合成中與乙酸一起作為底物使用的輔酶A(CoA)是細(xì)胞內(nèi)的代表性 ?；鶊F(tuán)載體。輔酶A由泛酸經(jīng)過一系列的步驟合成，每個(gè)步驟的酶促催化如下所示。首 先，泛酸激酶(CoaA)將泛酸(維生素B5)活化成4'-磷酸泛酸，然后向4'-磷酸泛酸上 加入半胱氨酸形成4'-磷酸泛酰-L-半胱氨酸(f-phosphopantothenoyl-L-cysteine)， 然后利用P-PanCys合酶/P-PanCys脫羧酶(coaBC)的組合通過脫羧作用形成4'-磷酸泛 酰巰基乙胺。然后，通過磷酸泛酰巰基乙胺(P-PanSH)腺苷?；D(zhuǎn)移酶(coaD)將4'-磷酸 泛酰巰基乙胺腺苷?；瑥亩纬擅摿姿?CoA。最后，利用ATP通過脫磷酸輔酶A(deP-CoA) 激酶(coaE)將脫磷酸-CoA磷酸化為輔酶A。通常，CoA是細(xì)胞內(nèi)多數(shù)代謝反應(yīng)以及很多合成反應(yīng)的輔助因子。為此，通過調(diào)節(jié) 機(jī)制將CoA庫保持在恒定水平。調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)CoA庫的首要關(guān)鍵因子是泛酸激酶，其催化第 一關(guān)鍵步驟并且是CoA生物合成中的限速酶。通過反饋抑制調(diào)節(jié)泛酸激酶是控制細(xì)胞內(nèi) CoA濃度的主要因素(J Biol Chem. 19940ct 28 ；269 (43) :27051_8)。然而，細(xì)胞內(nèi)保持的 恒定CoA水平可能是通過乙酰-CoA有效產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的障礙。據(jù)報(bào)道，用丙氨酸 A取代第106位的精氨酸R使泛酸激酶由對CoA的反饋抑制敏感轉(zhuǎn)變?yōu)閷Ψ答佉种凭哂锌?性(Journal Of Bacteriology, 185, June 2003，p. 3410-3415)。發(fā)現(xiàn)在存在 40mM CoA 時(shí)， 野生型蛋白僅保留約20%的催化活性，而在相同濃度的CoA下卻沒有檢測到R106A突變蛋 白的催化活性降低。另外，發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，表達(dá)突變蛋白的突變株具有顯著高的細(xì)胞 內(nèi)CoA水平。為完成本發(fā)明，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)引入并增強(qiáng)(a) 對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶基因，和(b)0-乙酰CoA合酶基因中的任一個(gè)或兩 個(gè)都導(dǎo)致O-乙酰高絲氨酸產(chǎn)量顯著提高，如圖1所示。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供能夠以高產(chǎn)量產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的微生物株，所述 微生物株經(jīng)過設(shè)計(jì)通過過表達(dá)acs基因和對CoA的反饋抑制具有抗性的coaA基因而增強(qiáng) 乙酰-CoA的生物合成途徑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用所述微生物株以高產(chǎn)量產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的 方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供能夠產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的埃希氏菌屬的菌株，其 中，向所述菌株中引入并增強(qiáng)了 (a)乙酰-CoA 合酶基因(acs)；(b)編碼對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)；或
(c) (a)的乙酰-CoA合酶基因(acs)和(b)的泛酸激酶基因(coaA)兩者。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供在培養(yǎng)基中產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的方法，所述方法 包括在培養(yǎng)基中發(fā)酵所述株。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供產(chǎn)生L-蛋氨酸和乙酸的方法，所述方法包括(a)發(fā) 酵埃希氏菌屬的菌株從而產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸；(b)分離0-乙酰高絲氨酸；和(c)在選自 由胱硫醚Y -合酶、0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶和0-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶組成的 組的酶存在下，將0-乙酰高絲氨酸和甲基硫醇一起轉(zhuǎn)化為L-蛋氨酸和乙酸(acetate)。因此，根據(jù)本發(fā)明可以通過生物學(xué)方式高產(chǎn)量地產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸，這種方法 的環(huán)境友好度高于化學(xué)方法。此外，可以酶促地，例如通過0-乙酰-高絲氨酸硫化氫解酶 將本發(fā)明的微生物株產(chǎn)生的O-乙酰-L-高絲氨酸酶促地轉(zhuǎn)化為L-蛋氨酸和乙酸。L-蛋氨 酸可以用作食品或動(dòng)物飼料的添加劑。


參考以下詳細(xì)說明并結(jié)合附圖，可以更清楚地理解本發(fā)明的上述和其它目的、特 點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，在附圖中圖1為顯示能夠高產(chǎn)量地產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的0-乙酰高絲氨酸生物合成途徑 的示意圖；圖2為顯示攜帶乙酰-CoA合酶基因(acs)的表達(dá)載體pCL-P (pro) -acs的遺傳圖 和構(gòu)建的示意圖；和圖3為顯示均攜帶編碼對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶(coaA (R106A))的 基因的表達(dá)載體pCL-P(pro)-coaA(R106A)和pACYC-coaA(R106A)的遺傳圖和構(gòu)建的示意圖。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面，本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的埃希氏菌屬的菌 株，其中，向所述菌株中引入并增強(qiáng)了 (a)乙酰-CoA合酶基因(acs) ； (b)編碼對CoA的 反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)；或(c) (a)的乙酰-CoA合酶基因 (acs)和(b)的泛酸激酶基因(coaA)兩者。本文使用的術(shù)語“L-蛋氨酸前體”旨在指在蛋氨酸生物合成途徑中存在的代謝物 或其衍生物，并且尤其指0-乙酰高絲氨酸。本文使用的術(shù)語“產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸株”旨在表示能夠在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外產(chǎn)生 0-乙酰高絲氨酸的原核或真核微生物，并且尤其表示經(jīng)遺傳修飾能夠在其中累積0-乙酰 高絲氨酸的微生物。可用于本發(fā)明的菌株的實(shí)例包括埃希氏菌屬(Escherichia sp.)、歐 文氏菌屬(Erwinia sp.)、沙雷氏菌屬(Serratia sp.)、普羅威登斯菌屬(Providencia sp·)、棒桿菌屬(Corynebacteria sp·)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp·)、鉤端螺旋體 屬(Leptospira sp·)、沙門氏菌屬(Salmonellarsp.)、短桿菌屬(Brevibacteria sp.)、 Hypomononas sp.、色桿菌屬(Chromobacterium sp.)、諾卡氏菌(Norcardia sp.)、真菌禾口 酵母，優(yōu)選埃希氏菌屬、棒桿菌屬和鉤端螺旋體屬以及酵母。更優(yōu)選埃希氏菌屬。更優(yōu)選大 腸桿菌(Escherichia coli.)。更優(yōu)選能夠產(chǎn)生賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸或蛋氨酸的大腸桿菌菌株。最優(yōu)選大腸桿菌菌株(保藏號KCCM 10921P)，其源自US12/062835(即，美國專 利公開第2009-0253186 Al號)中所述的產(chǎn)生蘇氨酸的菌株，并向其中引入了 thrA和metX 基因從而改善0-乙酰-L-高絲氨酸的生物合成途徑。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，提供通過增強(qiáng)乙酰-CoA生物合成途徑而提高0-乙 酰高絲氨酸產(chǎn)量的產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸株，其中所述株中引入并增強(qiáng)了乙酰-CoA生物合成 途徑中涉及的乙酰-CoA合酶基因。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，提供通過增強(qiáng)乙酰-CoA生物合成途徑而提 高0-乙酰高絲氨酸產(chǎn)量的產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸株，其中所述株中引入并增強(qiáng)了對累積CoA 的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶基因。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，提供通過增強(qiáng)乙酰-CoA生物合成途徑而提 高0-乙酰高絲氨酸產(chǎn)量的產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸株，其中所述株中引入并增強(qiáng)了乙酰-C0A生 物合成途徑中涉及的乙酰-CoA合酶和對累積CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶基因。本文使用的術(shù)語“引入并增強(qiáng)”旨在表示提高由相應(yīng)基因編碼的酶的細(xì)胞內(nèi)活性， 這通常能夠通過所述基因的過表達(dá)實(shí)現(xiàn)。過表達(dá)目標(biāo)基因的方法有很多。例如，可以通過 修飾目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)和/或5’ -UTR內(nèi)的堿基；通過在染色體上引入目標(biāo)基因的額 外拷貝；或者通過將目標(biāo)基因與自體同源啟動(dòng)子或異源啟動(dòng)子相組合引入到載體上，然后 將所述載體轉(zhuǎn)化到微生物株中實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。另外，目標(biāo)基因ORF(開放閱讀框)內(nèi)的突變可 以引起其過表達(dá)。用數(shù)字表示，當(dāng)發(fā)生過表達(dá)時(shí)，與天然狀態(tài)的表達(dá)相比，相應(yīng)蛋白的活性 或濃度提高了 10%、25%、50 %、75%、100%、150%,200%、300%、400%或 500%、1000% 或者高達(dá)2000%。為了引入并增強(qiáng)基因，可以對相應(yīng)的啟動(dòng)子進(jìn)行突變或者增加基因的拷貝數(shù)。優(yōu) 選使用強(qiáng)啟動(dòng)子。只要其是組成型的啟動(dòng)子，任何啟動(dòng)子均可在本發(fā)明中使用而不受限制。 可以使用pTac、pTrc、pPro、pR和pL，其中最優(yōu)選SEQ ID NO. 9的pPro。目標(biāo)基因可以全 部或部分地包含SEQ ID NO. 9的pPro啟動(dòng)子。所述乙酰-CoA合酶和泛酸激酶可以來自多種不同的微生物，且可以分別由本發(fā) 明中稱為“acs”和“coaA”的基因編碼。在本發(fā)明中，提供了通過修飾而增強(qiáng)乙酰-CoA合酶活性、具有高的產(chǎn)生0-乙酰高 絲氨酸的能力的菌株，和利用所述菌株產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的方法。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸株的制備如下所示。為了提高0-乙酰-L-高絲氨酸的產(chǎn)生，用SEQ ID N0. 9的組成型啟動(dòng)子P (pro) 取代菌株中編碼乙酰-CoA合酶基因的啟動(dòng)子，然后構(gòu)建組成型表達(dá)質(zhì)粒從而誘導(dǎo)不受代 謝物阻遏的目標(biāo)基因過表達(dá)。編碼乙酰-CoA合酶的基因通常表示為acs。它可以從之前 公開的大腸桿菌基因組序列(gi 89110790)獲得(Mol Syst Biol. 2006 ；2 =2006. 0007. Epub 2006 Feb 21)。另外，也可以從公用數(shù)據(jù)庫，例如美國國立生物技術(shù)信息中心(the National Center for Biotechnologylnformation, NCBI)禾口曰本 DNA 數(shù)據(jù)庫(DNA Data Bank of Japan, DDBJ)構(gòu)建的公用數(shù)據(jù)庫中獲得所述基因序列。乙酰-CoA合酶具有催化以下反應(yīng)的活性。如果編碼所述酶的基因的表達(dá)被增強(qiáng)， 則會(huì)誘導(dǎo)乙酰-CoA在細(xì)胞內(nèi)累積。乙酸+CoA< = > 乙酰-CoA
接著，對具有組成型表達(dá)質(zhì)粒的微生物株進(jìn)行操作，從而進(jìn)一步提高乙酰-CoA的 合成。本發(fā)明中采取的方法是使針對CoA合成的反饋抑制失效。關(guān)于這一點(diǎn)，催化第一關(guān) 鍵步驟并作為CoA生物合成中的限速酶的泛酸激酶被突變，從而對CoA的反饋抑制產(chǎn)生抗 性。為此，向編碼泛酸激酶的基因中引入突變，即CoaA(R106A)。該基因可以從之前公開的 大腸桿菌基因組序列(gi :89110060)獲得(Mol Syst Biol. 2006 ；2 2006. 0007. Epub 2006 Feb 21.)。另外，也可以從公用數(shù)據(jù)庫，例如美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)和日本DNA 數(shù)據(jù)庫(DDBJ)構(gòu)建的公用數(shù)據(jù)庫中獲得所述基因序列。除了具有催化如下反應(yīng)所示的從泛酸至4’ -磷酸泛酸的磷酸化的活性外，所述突 變的泛酸激酶對CoA反饋抑制不敏感。因此，增強(qiáng)編碼突變的泛酸激酶的基因提高細(xì)胞內(nèi) CoA庫的水平。泛酸+ATP< = >4，-磷酸泛酸 +ADP由此獲得的突變株在其中累積了大量作為底物的CoA和乙酰-CoA以及高絲氨酸， 用于通過metX編碼的酶產(chǎn)生0-乙酰-L-高絲氨酸。因此，所述突變株能夠高產(chǎn)量地產(chǎn)生 0-乙酰-L-高絲氨酸。由此，將三株產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸株CJM-X/(pCL-P (pro)-Acs)、CJM-X/ (pCL-P (pro) -coaA (R106A))和 CJM-X/(pCL_P (pro)-acs，pACYC-coaA (R106A))分別命名為 “大腸桿菌CA05-0565”、“大腸桿菌CA05-0564”和“大腸桿菌CA05-0566”，制備并于2009年 8 月 11 日保藏在 KCCM(Korean Culture of Microorganism, Eulim build, Hongje-l-Dong, Seodaemun-ku, Seoul，361-221，Korea),保藏號分別為 KCCM11023P、KCCMl 1022P 和 KCCMl1024P。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，提供產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸株，在該株中，在組成型啟 動(dòng)子Pro的控制下過表達(dá)參與乙酰-CoA生物合成的基因acs。更具體地，pPro啟動(dòng)子由 SEQ ID N0. 9的全長序列或其部分構(gòu)成。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸株，在所述株中負(fù) 責(zé)CoA生物合成的關(guān)鍵步驟的泛酸激酶對CoA的反饋抑制具有抗性。另外，本發(fā)明還提供 高產(chǎn)量地產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的方法。優(yōu)選地，對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶在 第106位氨基酸發(fā)生突變。更優(yōu)選地，通過用丙氨酸取代精氨酸使泛酸激酶在第106位氨 基酸發(fā)生突變，由此對CoA的反饋抑制具有抗性。最優(yōu)選地，對CoA的反饋抑制具有抗性的 泛酸激酶具有SEQ ID N0. 8的氨基酸序列。在本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，提供產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的大腸桿菌菌株， 其中在所述菌株中同時(shí)采取兩種方法以增強(qiáng)乙酰-CoA合酶的活性和泛酸激酶的活性。優(yōu)選地，用于制備產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸株的大腸桿菌菌株是能夠產(chǎn)生賴氨酸、蘇氨 酸、異亮氨酸或蛋氨酸的大腸桿菌菌株。更優(yōu)選地，所述大腸桿菌菌株的特征在于引入并增 強(qiáng)了(a)高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶；(b)天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性；或(c) (a)和(b) 兩者。最優(yōu)選的是源自CJM-X/pthrA(M)-CL(保藏號KCCM 10921P)的大腸桿菌。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，克隆acs基因并用于構(gòu)建在SEQ ID N0. 9的組成型啟 動(dòng)子PPro控制下的acs表達(dá)載體pCL-P (pro)-acs (圖2)。將coaA基因的第106位氨基 酸從精氨酸突變?yōu)楸彼?，從而產(chǎn)生SEQ ID N0. 8的突變coaA基因，其編碼對CoA的反饋 抑制具有抗性的所述酶。將該突變基因克隆至攜帶SEQ ID而.9的組成型啟動(dòng)子？ 1~0的質(zhì)粒中，從而產(chǎn)生在組成型啟動(dòng)子PPro控制下的重組表達(dá)質(zhì)粒pCL-P(pro)-coaA(R106A) 和pACYC-coaA(R106A)(圖3)。向CJM-X中單獨(dú)或組合轉(zhuǎn)化入重組質(zhì)粒pCL_P (pro)-acs 和pCL-P (pro)-coaA(R106A)或pACYC_coaA(R106A)，從而制備特征在于引入并增強(qiáng)了(a) 編碼乙酰-CoA合酶(acs)的基因，(b)編碼對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的基 因(coaA)，和(c) (a)和(b)兩種基因的產(chǎn)0_乙酰高絲氨酸株(實(shí)施例1_3)，其中所述 CJM-X是通過從在US12/062835(即美國專利公開第US 2009-0253186 Al號)中公開的增 加 了 thrA 和 metX 的菌株 CJM-X/pthrA (M) -CL (保藏號 KCCM 10921P)中除去 pthrA (M) -CL 質(zhì)粒而構(gòu)建的。培養(yǎng)瓶培養(yǎng)表明，與對照CJM-X相比，在用攜帶(a)的乙酰-CoA合酶基 因(acs)的pCL-P(pr0)-acS轉(zhuǎn)化的菌株中，0-乙酰高絲氨酸的生產(chǎn)能力在產(chǎn)量上提高 了 2.8g/L，產(chǎn)率上提高了 4.7% ；在用攜帶(b)的對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶 的pCL-P(Pro)-CoaA(R106A)轉(zhuǎn)化的菌株中，O-乙酰高絲氨酸的生產(chǎn)能力在產(chǎn)量上提高了 2. lg/L，產(chǎn)率上提高了 3. 5%;在用(b)和(c) ^ pCL-P (pro) -acs ^P pACYC-coaA (R106A)轉(zhuǎn) 化的菌株中，O-乙酰高絲氨酸生產(chǎn)能力在產(chǎn)量上提高了 6. 8g/L，產(chǎn)率上提高了 11.4% (參 見實(shí)施例2，表2)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的方法，所述方法包 括在培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的大腸桿菌菌株，從而在培養(yǎng)基中累積0-乙酰高 絲氨酸。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生L-蛋氨酸和乙酸的方法，所述方法包括
(a)通過發(fā)酵本發(fā)明的產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的埃希氏菌屬的菌株產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸；
(b)分離0-乙酰高絲氨酸；和(c)在選自胱硫醚Y-合酶、0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶和 0-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶的轉(zhuǎn)化酶存在下，將分離的0-乙酰高絲氨酸和甲基硫醇一 起轉(zhuǎn)化為L-蛋氨酸和乙酸。當(dāng)與本發(fā)明的微生物株組合使用時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人的WO 2008/013432中公開 的基于使用轉(zhuǎn)化酶(胱硫醚Y -合酶、0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶或0-琥珀酰高絲氨酸 硫化氫解酶)的L-蛋氨酸生產(chǎn)方法能夠產(chǎn)生更高產(chǎn)量的L-蛋氨酸。以上制備的產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的微生物株可以在本領(lǐng)域已知的培養(yǎng)基和培養(yǎng) 條件下培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全理解，可以根據(jù)所用微生物株對培養(yǎng)方法進(jìn)行調(diào)整。發(fā) 酵可以以分批、連續(xù)培養(yǎng)或分批補(bǔ)料的形式進(jìn)行，但并不限于此。以下參考文獻(xiàn)公開了多種 發(fā)酵方法“BiochemicalEngineering，，by James Μ. Lee, Prentice-Hall International Editions，pp 138-176。培養(yǎng)基必須滿足特定微生物株的培養(yǎng)條件。以下參考文獻(xiàn)中公開了多種微生物培 養(yǎng)基"Manual of Methods for General Bacteriology"by the AmericanSociety for Bacteriology, Washington D. C.，USA，1981。通常，培養(yǎng)基包括多種碳源、氮源和微量元 素。碳源的實(shí)例包括碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素；脂 肪，例如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸；醇類，例 如甘油和乙醇；和有機(jī)酸，例如乙酸。這些碳源可以單獨(dú)或組合使用。氮源的實(shí)例包括有機(jī) 氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉湯、麥芽膏、玉米漿(CSL)和豆粉；無機(jī)氮源，例如尿素、 硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨，這些氮源可以單獨(dú)或組合使用。另外，所述培養(yǎng) 基還可以包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和/或其相應(yīng)的含鈉鹽。另外，所述培養(yǎng)基中還可以以鹽的形式包含金屬，例如磷酸鎂或硫酸鐵。此外，還可以加入氨基酸、維生素和適當(dāng)?shù)那?體?？梢苑峙蜻B續(xù)的方式將所述培養(yǎng)基或前體加入到培養(yǎng)物(culture)中?？梢岳煤线m的化合物，例如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨水、磷酸和硫酸，調(diào)整培養(yǎng)物 的PH。為了防止在培養(yǎng)物中產(chǎn)生泡沫，可以使用消泡劑，例如脂肪酸聚乙二醇酯。為了產(chǎn)生 有氧條件，可以向培養(yǎng)基中充入氧或含氧氣體(例如空氣)。培養(yǎng)基保持在20 45°C，優(yōu) 選25 40°C。將微生物株培養(yǎng)至L-蛋氨酸前體的期望水平，優(yōu)選培養(yǎng)10 160小時(shí)。通過以下實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，但以下實(shí)施例僅用于說明而非限制本發(fā) 明的范圍。實(shí)施例1 制備產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸株<1-1> 克隆 acs 基因?qū)τ赼cs基因的克隆，利用大腸桿菌W3110(ATCC 27325)的基因組DNA作為模板， 通過PCR擴(kuò)增編碼乙酰-CoA合酶的acs基因。從NIH的GenBank數(shù)據(jù)庫獲得acs基因的 堿基序列(NCBI-gi :89110790)，并表示為SEQ ID NO. 7。在所述堿基序列的基礎(chǔ)上，利用含 有選擇性酶切位點(diǎn)EcoRV和HindIII的引物對(SEQ ID N0S. 1和2)，以大腸桿菌W3110的 基因組DNA為模板，在高保真DNA聚合酶PfuUltra (Stratagene)存在下，通過PCR擴(kuò)增從 ATG至TAA的0RF。所述PCR包括96°C變性30秒、50°C退火30秒和72°C延伸2分鐘的30 個(gè)循環(huán)，從而合成含有EcoRV和HindIII位點(diǎn)的約2. Okb的acs基因。用限制性酶EcoRV和HindIII消化后，將所擴(kuò)增的acs基因連接到此前用相同酶 進(jìn)行處理的pPro-GFP載體上，從而構(gòu)建攜帶acs基因并包含組成型啟動(dòng)子Pro的重組組成 型表達(dá)載體，稱為pCL-P(pro)-acS。圖2顯示了所述表達(dá)載體pCL_P (pro)-acs的遺傳圖和 構(gòu)建。<1-2>克隆反饋抗性coaA基因?yàn)榱丝寺》答伩剐詂oaA基因，利用大腸桿菌W3110(ATCC 27325)的基因組DNA作 為模板，通過PCR擴(kuò)增編碼對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的coaA基因。為此，首先 從NIH的GenBank數(shù)據(jù)庫獲得coaA基因的堿基序列(NCBI-gi =89110060)。在所述堿基序 列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增從ATG至TAA的coaA片段的引物對(SEQ ID N0S. 3和4)， 使其包含限制性酶切位點(diǎn)EcoRV，并且在第316 318位的核苷酸為密碼子GCC而非CGT， 從而產(chǎn)生對CoA的反饋抑制的抗性。另外，單獨(dú)設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增coaA片段的引物對(SEQ ID N0S. 5和6)，使其包含限制性酶切位點(diǎn)Hindlll，并且出于與上述相同的原因而使其第 316 318位的核苷酸為密碼子GCC而非CGT。當(dāng)以大腸桿菌W3110的染色體DNA作為模板時(shí)，在高保真DNA聚合酶 PfuUltra (Stratagene)存在下，分別利用合成引物對SEQ ID N0S. 3和4，以及SEQ ID N0S. 5和6進(jìn)行PCR，包括在96°C變性30秒、50°C退火30秒和72°C延伸2分鐘，共30個(gè) 循環(huán)。結(jié)果，獲得兩個(gè)基因片段一個(gè)片段從coaA的起始ATG密碼子開始延伸，并且在第 316 318位核苷酸具有從CGT密碼子至GCC密碼子的突變的大小約344bp的片段；另一 個(gè)片段是包含終止密碼子TAA，并且在第316 318位核苷酸具有從CGT密碼子至GCC密碼 子的突變的大小約642bp的片段。利用所述兩種片段作為模板進(jìn)行PCR，所述PCR包括96°C變性60秒、50°C退火60 秒和72°C延伸2分鐘的10個(gè)循環(huán)，隨后利用引物對SEQ ID N0S. 3和6在相同的熱條件進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。結(jié)果，獲得第316 318位的CGT密碼子被取代為GCC密碼子的963bp的基 因(coaA(R106A))。用限制性酶EcoRV和HindiII消化后，通過連接將突變的coaA基因克隆至 PPro-GFP載體上，從而構(gòu)建稱為pCL-P (pro) -coaA (R106A)的重組表達(dá)載體，該載體受組成 型啟動(dòng)子Pro(SEQ ID NO. 9)的控制，并攜帶第106位氨基酸殘基的密碼子由CGT突變?yōu)?GCC的突變coaA基因。所述突變coaA的氨基酸序列表示為SEQ ID N0. 8。接著，將突變coaA的基因克隆到pACYC177載體中。用限制性酶處理重組質(zhì) 粒 pCL-P (pro) -coaA (R106A)，以從其中切出含有 Pro 啟動(dòng)子的 1. 45kb 的 coaA (R106A) 片段。將所述coaA(R106A)片段插入到此前用BamHI和HindIII處理的pACYC177載 體中，由此構(gòu)建重組載體pACYC-cOaA(R106A)。在圖3中，圖示說明了重組表達(dá)載體 pCL-P (pro)-coaA (R106A)和 pACYC-coaA (R106A)的構(gòu)建。<1-3>制備產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸株將實(shí)施例<1_1>和<1_2>中構(gòu)建的質(zhì)粒pCL-P (pro)-acs和 pCL-P (pro)-coaA(R106A)轉(zhuǎn)化到菌株 CJM-X 中，然后在 LB-Sp (酵母提取物 10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、壯觀霉素25 μ g/L)上培養(yǎng)從而針對每個(gè)轉(zhuǎn)化體選出10個(gè)壯觀霉素 抗性菌落，其中，所述CJM-X是通過從US12/062835(即，美國專利公開第US 2009-0253186 Al號)中公開的(^1^/ 讓^^)-(^中除去？讓^^)-(^質(zhì)粒而構(gòu)建的。另外，用實(shí)施 例<1_2>中構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pACYC-CoaA(R106A)轉(zhuǎn)化攜帶pCL_P(pro)-acs載體的 CJM-X,并在LB-Sp-Ap (酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、壯觀霉素25 μ g/L、 氨芐青霉素50 μ g/L)上培養(yǎng)，從而選出10個(gè)具有壯觀霉素和氨芐青霉素抗性的菌落。對 其產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的能力進(jìn)行相互比較。為了檢測實(shí)施例1中制備的菌株產(chǎn)生蛋氨酸前體0-乙酰高絲氨酸的能力，在錐形 瓶中培養(yǎng)這些菌株。對于該培養(yǎng)，使用表1中所示的0-乙酰高絲氨酸滴定培養(yǎng)基(titermedium)。表1用于生產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸的培養(yǎng)基的組成
組成濃度(幾)葡萄糖60g硫酸銨17gKH2PO4l.OgMgSO4 · 7H200. 5gFeSO4 · 7H205mg
權(quán)利要求
1. 一種能夠產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的埃希氏菌屬的菌株，其中在所述菌株中引入并增 強(qiáng)了 (a)乙酰-CoA合酶基因(acs)；(b)編碼對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)；或(c)(a)中的乙酰-CoA合酶基因(acs)和(b)中的泛酸激酶基因(coaA)兩者。
2.如權(quán)利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其中通過利用新的啟動(dòng)子或突變的啟動(dòng)子 或者通過增加所述基因的拷貝數(shù)來引入并增強(qiáng)所述基因。
3.如權(quán)利要求2所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述新的啟動(dòng)子選自由pTrC、pPro、pR 和PL組成的組。
4.如權(quán)利要求3所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述啟動(dòng)子為pPro啟動(dòng)子，所述pPro 啟動(dòng)子具有SEQ ID NO. 9的堿基序列或其部分序列。
5.如權(quán)利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述由基因coaA編碼、對CoA的 反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的氨基酸序列在第106位不同于野生型酶(NCBI-Gene ID 948479)。
6.如權(quán)利要求5所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述氨基酸序列在第106位為丙氨酸 殘基，而不是所述野生型酶的精氨酸。
7.如權(quán)利要求6所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述氨基酸序列具有SEQID N0. 8的氨基酸序列。
8.如權(quán)利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其源自能夠產(chǎn)生賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸 或蛋氨酸的菌株。
9.如權(quán)利要求8所述的埃希氏菌屬的菌株，其源自的菌株中引入并增強(qiáng)了(a)高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性；(b)天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性；或(c)(a)和(b)兩者。
10.如權(quán)利要求9所述的埃希氏菌屬的菌株，其源自保藏號為KCCM10921P的菌株。
11.如權(quán)利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述(a)的菌株為大腸桿菌 CA05-0565 (保藏號 KCCMl 1023P)。
12.如權(quán)利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述(b)的菌株為大腸桿菌 CA05-0564(保藏號 KCCMl 1022P)。
13.如權(quán)利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述(c)的菌株為大腸桿菌 CA05-0566 (保藏號 KCCMl 1024P)。
14.如權(quán)利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其屬于大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了能夠以高產(chǎn)量產(chǎn)生L-蛋氨酸前體O-乙酰高絲氨酸的微生物株和利用所述微生物株產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的方法。所述微生物株是埃希氏菌屬的菌株，其中，向所述菌株中引入并表達(dá)了乙酰-CoA合酶基因(acs)和/或編碼對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)。
文檔編號C12R1/19GK102002472SQ20101014487
公開日2011年4月6日 申請日期2010年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者全成后, 孫晟光, 徐昌一, 李漢珍, 李相穆, 申容旭, 羅光鎬, 許仁庚, 金朱恩, 金素影, 金賢雅 申請人:Cj第一制糖株式會(huì)社