專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法及其發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種Y-氨基丁酸的生產(chǎn)方法，尤其指以發(fā)酵方式處理米糠原料，使其Y-氨基丁酸含量遠(yuǎn)高于米糠原料中的含量。
背景技術(shù)：
Y-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)屬于非蛋白質(zhì)氨基酸，極易溶于水中，但不溶于醇、醚及苯，分子量103. 12，化學(xué)式為NH2 (CH2)3COOH或(C4H9NO2)，屬于耐高溫型，不易受熱破壞。GABA為抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳遞物質(zhì)，具有許多生理功能，例如有降血壓功能、增進腦機能代謝作用、增強記憶力、有效抑制焦慮與失眠可達(dá)鎮(zhèn)靜效果，預(yù)防帕金森氏癥、改善更年期障礙、預(yù)防動脈硬化、活化腎機能、促進酒精代謝、防止肥胖等諸多功能 (引用文獻3、5和6)。米糠(麩皮)為稻谷碾制后的副產(chǎn)品，一般多廢棄或僅作為飼料用途，利用率頗低。米糠雖然僅占谷粒的5-8%，卻含有重要的營養(yǎng)成分及生理活性物質(zhì)，美國農(nóng)業(yè)部研究報告顯示，稻米中約64%的營養(yǎng)素都存在米糠中，內(nèi)含豐富的油脂、植物性活性物質(zhì)，包括維生素B群、生育酚(a-tocopherol)、生育三烯酚CTocotrienols)、植物甾醇(Phytosterols)、谷維醇(Y-oryzanol)、植酸(Phytic acid)、肌醇六磷酸 Gnositol hexaphosphate)等(引用文獻1)。米糠中另含有GABA，但其含量僅約28. lmg/100g。在植物體中GABA的含量很低，必須經(jīng)過化學(xué)合成或生物法處理才得以提高 GABA含量(引用文獻7、9和10)。化學(xué)合成法是利用鄰苯二甲酰亞胺鉀(Phthalimide Potassium)和4_氯丁腈(4-Chlorobutyronitrile)在強烈條件下反應(yīng)，再以濃硫酸(Sulfuric Acid)水解后得到產(chǎn)物，或是利用吡咯烷酮(Pyrrolidone)經(jīng)氫氧化鈣 (Calcium Hydroxide)、碳酸氫銨(Ammonium AcidCarbonate)水解、開環(huán)制得 GABA?；瘜W(xué)法雖反應(yīng)較快速、產(chǎn)率高，但是制備過程中除去有毒物質(zhì)較為復(fù)雜，安全性較差且所耗成本較高(引用文獻4和8)；生物合成法主要利用酶催化將氨基丁酸前體轉(zhuǎn)換合成，由谷氨酸脫羧酶直接且不可逆的脫去谷氨酸的α -羧基來合成GABA，或者利用GABA轉(zhuǎn)氨酶和琥珀半醛酸脫氫酶將GABA轉(zhuǎn)換為琥珀酸而消耗GABA(引用文獻2和8)。另外研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌(Lactic acid bacteria)具有谷氨酸脫羧酶的活性，可以通過發(fā)酵過程產(chǎn)生GABA ；此夕卜大腸桿菌(Escherichia coli)、紅曲霄(Monascus)、米曲菌(Aspergillus oryzae)禾口根霉(lihizopus spp.)亦有生產(chǎn)GABA的功能；然而考慮安全性較高的微生物，多使用具有保健功效的益生菌如乳酸菌來進行發(fā)酵，如臺灣專利第20081U88號、日本專利特開第 2000-210075號、日本專利第3似6157號、日本專利第2704493號。這些專利的發(fā)酵方法有的使用酪蛋白(casein)、消化蛋白質(zhì)(peptone)等高價成分，若考慮到成本則生產(chǎn)性欠佳； 或有的使用12. 5-18%的鹽，對于現(xiàn)今社會低鹽飲食的趨勢，并不利于推廣。引用文獻1. Raghuram TC 禾口 Rukminic，Nutritional significance of rice bran oil. (1995)Indian Jouranal of Medical Research. ，102 :241-244.
2. Shelp B. J. , Bown A. W.，禾口 Mclean Μ. D. (1999). Metabolism and functions ofgamma-aminobutyric acid. Trends Plant Sci.4 (11) :446-452.3.岡田忠司，2001。GABA富化二 f 胚芽生理機能，36 (6) :7_9。4.林少琴、吳若紅、鄒開煌、程開，2004。米胚芽中Y-氨基丁酸的分離提取及鑒定。食品科學(xué)，25(1) :76-78。5.茅原纮、杉浦友美，2001。近年們GABA生理機能研究(腦機能改善作用、高血壓作用全中心(二 ),36(6) 4-6ο6.許建軍、江波、許時嬰，2003。γ-氨基丁酸(gaba) —種新型的功能食品因子。 食品科技，24(1) :40-42。7.陳怡伶，2003。發(fā)芽糙米對糖尿病癥患者血糖值及血清膽固醇濃度的影響。靜宜大學(xué)食品營養(yǎng)所。8.陳海軍、林親彔、李麗輝，2006。食品原料中GABA的富集研究進展?，F(xiàn)代食品科技，22(1) :196-198。9.蕭鳳岐，2004。積極開發(fā)GABA食品。中國釀造，12 :22_24。10.白松、林向陽、阮榕生、鄭丹丹、劉玉環(huán)、何承云，2005。Y-氨基丁酸的分布與制備?，F(xiàn)代食品科技。21 (2) :202-205。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于目前生產(chǎn)GABA技術(shù)的缺點，因此本發(fā)明解決的首要問題是，降低GABA生產(chǎn)中的高成本、高鹽分及復(fù)雜的制備過程。本發(fā)明要解決的另一問題是，提高米糠的GABA的含量，以便提高米糠的利用價值。為解決上述問題，本發(fā)明提供一種GABA的生產(chǎn)方法，即發(fā)酵處理米糠以生產(chǎn)GABA 的方法，其包括步驟制備培養(yǎng)基將米糠、谷氨酸及奶粉按比例混合，其余以水補足，并調(diào)節(jié)pH值；將乳酸菌液接種至冷卻后的培養(yǎng)基；將均勻混合的乳酸菌液與培養(yǎng)基在30-42°C下發(fā)酵4小時以上。經(jīng)如上方法所得到的米糠發(fā)酵產(chǎn)物的GABA含量最高可達(dá)2501mg/100g以上，遠(yuǎn)高于米糠原料的GABA含量lmg/100g)；而本發(fā)明最終發(fā)酵產(chǎn)物再經(jīng)過真空冷凍干燥處理，可保留其營養(yǎng)價值，其亦有具保健功能性的膳食纖維、多酚類化合物及肌醇六磷酸等抗癌及抗氧化物質(zhì)，可以直接作為食品添加物。本發(fā)明如上述的GABA生產(chǎn)方法，由于僅使用碾米后副產(chǎn)物的米糠為原料，且培養(yǎng)基中的其它成分及乳酸菌粉亦是為商業(yè)所大量應(yīng)用，故其成本很低。再者，整個步驟中并未使用任何鹽分，對于作為成品應(yīng)用于食品時，亦有低鹽分的保證。最后，本發(fā)明在原料前處理及整個發(fā)酵過程中，其操作簡單不繁雜，亦可提高其產(chǎn)率。本發(fā)明如上述的GABA生產(chǎn)方法，其中米糠添加比例為培養(yǎng)基總體積的0. 1-15% ； 谷氨酸(glutamic acid)添加比例為培養(yǎng)基總體積的0. 1-0. 5% ；奶粉添加比例為培養(yǎng)基總體積的0. 1-5%。乳酸菌液由嗜熱鏈球菌(Sti^ptococcusthermophilus)和保加利亞乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)調(diào)配而成，乳酸菌液的接種量為培養(yǎng)基總體積的1-5% (ν/ν)；即本發(fā)明如上述的GABA生產(chǎn)方法中所應(yīng)用的培養(yǎng)基包括培養(yǎng)基總體積0. 1-15%的米糠、0. 1-0. 5%的谷氨酸、0. 1-5%的奶粉及的乳酸菌液，其余為水。本發(fā)明如上述的GABA生產(chǎn)方法，其中培養(yǎng)基的ρΗ值調(diào)節(jié)至6. 5，而優(yōu)選食品級的 PH調(diào)節(jié)劑如碳酸鉀或檸檬酸來進行調(diào)節(jié)。本發(fā)明如上述的GABA生產(chǎn)方法，其中米糠優(yōu)選為穩(wěn)定米糠；谷氨酸優(yōu)選為食品級；奶粉優(yōu)選為脫脂奶粉。本發(fā)明如上述的GABA生產(chǎn)方法，其中為減少發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)流失，且保有其中的乳酸菌活性；還可以在發(fā)酵完成后進行真空冷凍干燥的步驟。以下以優(yōu)選的實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的進一步技術(shù)特征，而非限制本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式實施例1 發(fā)酵生產(chǎn)Y -氨基丁酸的方法本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸(GABA)的方法包括步驟制備培養(yǎng)基將米糠、 谷氨酸及奶粉按比例混合，其余以水補足，并調(diào)節(jié)PH值；將乳酸菌液接種至冷卻后的培養(yǎng)基；均勻混合的乳酸菌液與培養(yǎng)基在30-42°C下發(fā)酵4小時以上。利用前述的方法，本實施例的培養(yǎng)基，選用穩(wěn)定米糠(stabilized rice bran), 其添加比例為培養(yǎng)基總體積的11.；食品級谷氨酸，其添加比例為培養(yǎng)基總體積的 0. 378% ；脫脂奶粉，其添加比例為培養(yǎng)基總體積的1%。上述步驟中所接種的乳酸菌液，在本實施例中是由商用型制作酸奶的代號YC-380 菌粉所調(diào)配而成的，該菌粉是由嗜熱鏈球菌(Str印tococcusthermophilus)和保加利亞乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)所組合而成的；乳酸菌液的調(diào)配是利用每包規(guī)格50U的菌粉，將一包菌粉溶入經(jīng)90°C、30分鐘加熱過的10%脫脂奶水中，利用磁力攪拌使菌粉完全溶解后，再加入培養(yǎng)基中。乳酸菌液的接種量在本實施例中為培養(yǎng)基總體積的2. 5% (ν/ν)。本實施例利用上述步驟，將米糠、谷氨酸及奶粉按比例混合后先扣除要加入的乳酸菌液量，其余比例以水補足；并利用碳酸鉀或檸檬酸等食品級PH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的ρΗ 值至6. 5后進行滅菌，待冷卻后接種2. 5% (ν/ν)乳酸菌液；并待乳酸菌液與培養(yǎng)基混合均勻后在40°C下發(fā)酵4小時以上；隨后進行真空冷凍干燥處理，便成為富含GABA的米糠發(fā)酵產(chǎn)物。實施例2 =GABA含量分析(1)取實施例1的米糠發(fā)酵產(chǎn)物均質(zhì)后精確秤量0. 5 2g的樣品，置入50mL離心管中，加入25%酒精30mL，在室溫下萃取30分鐘，再在4°C下以1000 X g離心10分鐘，收集上層澄清液至濃縮瓶中，再將沉淀物重復(fù)上述步驟2-3次，將所收集的上層澄清液，在35°C 下通過減壓濃縮機濃縮至完全干燥。(2)再以0. 5mL的0. 02N鹽酸溶液震蕩潤洗濃縮瓶，將洗出液轉(zhuǎn)移至IOmL離心管， 再重復(fù)步驟一次，合并洗出液低溫高速離心10分鐘G°C，17000Xg)，取上層澄清液至樣品瓶，備用。
(3)標(biāo)準(zhǔn)品的配制(GABA標(biāo)準(zhǔn)品)精確秤量GABA標(biāo)準(zhǔn)藥品0. 05g置于燒杯，用 0. 02N鹽酸溶解轉(zhuǎn)并移至50mL定量瓶中再進行定容，則為所需濃度1000mg/L。(4)標(biāo)準(zhǔn)操作液取標(biāo)準(zhǔn)原液1、2、3及4mL于20mL定量瓶，用0. 02N鹽酸進行定容，即為 50、100、150 及 200mg/L。(5)測量樣品的配制取20 μ L上層澄清液樣品與980 μ L 0. 02Ν HCl混合均勻成ImL后，由此再取出 10 μ L混合液于試管中加入70 μ L Vial 1 (AccQ Fluor硼酸鹽)緩沖溶液，再加入20 μ L Vial 2Α (將AccQ Fluor衍生試劑粉末加入到ImL的IOmM AccQFluor中)試劑，震蕩10秒， 室溫靜置1分鐘，再置于55°C水浴10分鐘，水浴后用流水冷卻至室溫。再將配制的測量樣品以0. 20 μ m樣品過濾膜過濾至樣品瓶，進行HPLC分析。(6) HPLC 分析條件A.層析柱3.9X 150mm Nova-pak C18(Part No. WAT086344，Waters)。B.保護柱Nova-pak C18(Part No. WAT044380，Waters)。C.標(biāo)準(zhǔn)品GABA標(biāo)準(zhǔn)品，購自s i gma。D.流動相比例A液為醋酸鈉緩沖溶液(取WAT052890 AccQ Tag洗脫液A IOOmL, 加去離子水定量至IOOOmL)，B液為60%乙腈(取乙腈600mL，加去離子水定量至IOOOmL)。A液與B液的比例
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，該方法包括步驟將米糠、谷氨酸及奶粉按比例混合，其余以水補足，并調(diào)節(jié)PH值以制備培養(yǎng)基； 將乳酸菌液接種至冷卻后的培養(yǎng)基；將均勻混合的乳酸菌液與培養(yǎng)基在30-42°C下發(fā)酵4小時以上。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述米糠添加比例為培養(yǎng)基總體積的0.1-15% ；谷氨酸添加比例為培養(yǎng)基總體積的0. 1-0. 5% ；奶粉添加比例為培養(yǎng)基總體積的0. 1-5%。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值至6.5。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中以食品級的碳酸鉀或檸檬酸為PH調(diào)節(jié)劑以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述米糠為穩(wěn)定米糠。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述奶粉為脫脂奶粉。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述乳酸菌液由嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌調(diào)配而成。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述乳酸菌液的接種量的體積為培養(yǎng)基總體積的 1-5%。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括在發(fā)酵完成后對發(fā)酵產(chǎn)物實施真空冷凍干燥的步馬聚ο
10.一種在權(quán)利要求1所述的方法中所使用的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括培養(yǎng)基總體積 0. 1-15%的米糠、0. 1-0. 5%的谷氨酸、0. 1-5%的奶粉及的乳酸菌液，其余為水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，其包括步驟將米糠、谷氨酸及奶粉按比例混合，其余以水補足，以制作培養(yǎng)基；然后，將乳酸菌液接種至冷卻后的培養(yǎng)基，并于均勻混合后，在30-42℃下發(fā)酵4小時以上。由此方法及其培養(yǎng)基所得到的發(fā)酵物的γ-氨基丁酸含量遠(yuǎn)高于米糠原料，可以直接作為食品添加物。
文檔編號C12R1/225GK102212564SQ20101014562
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月2日
發(fā)明者鐘愛嵐 申請人:財團法人中華谷類食品工業(yè)技術(shù)研究所