專利名稱：一種生產(chǎn)纖維素乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體地涉及一種生產(chǎn)纖維素乙醇的方法。
背景技術(shù)：
能源是人類賴以生存和持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。而常規(guī)化石能源的儲量極其有 限，全球已探明的石油、天然氣和煤炭儲量將分別在今后40、60和100年左右耗盡。同時(shí)， 利用化石能源所造成的環(huán)境污染和氣候變化對人類生存和發(fā)展也提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。這使得 開發(fā)新型、清潔、可再生的新能源變得非常必要和緊迫。生物質(zhì)能源作為新興能源之一，據(jù) 估計(jì)，在未來40年將占全球總能耗的40%。燃料乙醇是生物質(zhì)能源中最容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的 品種之一，它作為一種新型的清潔能源，是正在使用的汽車燃料的理想替代品。目前，通過 發(fā)酵玉米淀粉、甘蔗汁等已經(jīng)實(shí)現(xiàn)第一代燃料乙醇產(chǎn)業(yè)化。然而，隨著我國人口不斷增加， 糧食危機(jī)日益加劇，利用玉米淀粉、甘蔗汁等生產(chǎn)燃料乙醇勢必將會嚴(yán)重影響糧食和飼料 供給。纖維素是地球上最廉價(jià)、最豐富的可再生資源之一，應(yīng)用纖維素作為原料可以有效地 避免乙醇生產(chǎn)和人類糧食供給的矛盾。同時(shí)，由于纖維素也是太陽能的轉(zhuǎn)化載體之一，生產(chǎn) 和利用纖維素乙醇，并不會引起環(huán)境中C02總量的增加。因此，纖維素生物質(zhì)已成為大規(guī)模 燃料乙醇生產(chǎn)中極具吸引力的原料。對我國而言，發(fā)展不與人爭糧、不與糧爭地，環(huán)境友好 的纖維素乙醇有利于低碳經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，有助于推動生物質(zhì)能源替代化石燃料的進(jìn)程。利用纖維素生產(chǎn)燃料乙醇，其最大的瓶頸在于生產(chǎn)成本過高。由纖維素 到乙醇的轉(zhuǎn)化目前有四種策略可以實(shí)現(xiàn)分步水解和發(fā)酵(S印arateHydrolysis and Fermentation, SHF)、同步糖化與發(fā)酵(SimultaneousSaccharification and Fermentation, SSF)、同步糖化與共酵角軍(SimultaneousSaccharification and Co-Fermentation, SSCF)和聯(lián)合生物加工(ConsolidatedBioProcessing，CBP)。對于 SHF、 SSF和SSCF，其成本主要在于纖維素酶的生產(chǎn)或購買、纖維素原料的預(yù)處理、預(yù)處理物的 糖化水解三個(gè)方面([Lynd，L. R.，ffeimer, P. J.，van Zyl, ff. H.，Pretorius, I. S. 2002. Microbialcellulose utilization :fundamentals and biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 506-577. ]、[Xu, Q. , Singh, A. , Himmel, M. E. 2009. Perspectivesand new directions for the production of bioethanol using consolidatedbioprocessing of lignocellulose. Curr. Opin. Biotechnol. 20，364-371.])。聯(lián)合生物加工(CBP)將纖維素 酶生產(chǎn)、水解糖化和戊糖己糖共發(fā)酵整合在同一反應(yīng)器內(nèi)由同一微生物或微生物群落完成 ([Lynd, L R.，van Zyl, W. H.，McBride，J. E.，Laser，M. 2005. Consolidated bioprocessing of cellulosicbiomass :an update. Curr. Opin. Biotechnol. 16，577-583. ]、[Lynd, L R.， Weimer, P. J.，van Zyl, W. H.，Pretorius，I. S. 2002. Microbial celluloseutilization fundamentals and biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66，506-577.])。 其 減 少了工藝步驟；降低了工藝的復(fù)雜性；不需要為纖維素酶的生產(chǎn)或購買投入資金，因此 可以大幅度降低生產(chǎn)成本，被公認(rèn)為是最理想的纖維素乙醇生產(chǎn)路線([Cardona，C. A.， Sanchez, 0. J.2007. Fuelethanol production :Process design trends and integrationopportunities. Bioresource Technology 98，2415-2457.]、[Gray, K. A. , Zhao，L.， Emptage, M. 2006. Bioethanol. Curr Op in Chem Biol 10，141-146. ])。2009 年，美國專利 US2009/0068714A1報(bào)道了一種可將纖維素直接轉(zhuǎn)化為乙醇的革蘭氏陰性細(xì)菌，其可以分解 城市垃圾、甘蔗渣、木屑、纖維素廢棄物等多種物質(zhì)，一步反應(yīng)后，乙醇轉(zhuǎn)化率能達(dá)到理論產(chǎn) 率的90%左右。除此之外，卻再沒有一種能滿足所有CBP工藝要求的天然微生物菌株被 報(bào)道。近年來，國內(nèi)外圍繞著能適應(yīng)CBP工藝要求的菌株的選育，遺傳改造等方面進(jìn)行了 大量研究，主要包括改造纖維素酶產(chǎn)生菌使其能發(fā)酵糖高產(chǎn)乙醇、改造乙醇產(chǎn)生菌使其獲 得降解纖維素和共發(fā)酵多種水解糖的能力兩種策略。Clostridium thermocellum([Heap J. T.，Kuehne，S. A.，Ehsaan，M.，Cart man, S. T.，Cooksley，C. M.，Scott, J. C.，Minton， N. P.2010.The ClosTron-Mutagenesis in Clostridium refined and streamlined. Journal ofMicrobiological Methods 80，49-55. ])、Saccharomyces cerevisiae([van Zyl，W. H.，Lynd，L. R.，den Haan，R.，McBride，J. E. 2007. Consolidatedbioprocessing for bioethanol production using Saccharomyces cerevisiae. AdvBiochem Eng Biotechnol 108，205-235.])、 Candida mycoderma、 Pichiapastoris、 Zymomonas mobilis ([Rogers, P. L，Jeon，Y. J.，Lee, K. J.，Lawford, H. G. 2007. Zymomonas mobilis for fuel ethanol and higher value products. Adv Biochem Eng Biotechnol 108， 263-288. ])、Escherichia col ([Dien，B. S.，Cotta，M. A.，Jeffries，T. W. 2003. bacteria engineerd for fuel ethanolproduction :current status. Applied Microbiology and Biotechnology 63. ])、Klebsiella oxytoca ([Jarboe，L. R.，Shanmugam，K. T.， Ingram，L. 0. 2009.Ethanol. in :Encyclopedia of Microbiology, (Ed. )S. Moselio， Academic Press.Oxford,pp.295-304. ])^Trichoderma reese([Xu,Q.，Singh，A.，Himmel， M. E. 2009. Perspectives and new directions for the production of bioethanol usingconsolidated bioprocessing of lignocellulose. Curr. Opin. Biotechnol.20， 364-371.])等菌都在不同程度上受到了研究。其中，較成功的例子是Shaw等([Shaw， A. J. , Podkaminer, K. K. , Desai, S. G. , Bardsley, J. S. , Rogers, S. R. , Thorne, P. G., Hogsett,D. A. ,Lynd,L. R. 2008. Metabolic engineering of athermophilic bacterium to produce ethanol at high yield. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.])采用基因工程技術(shù)敲除了 Thermoanaerobacterium saccharolyticum中的乙酸激酶、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和乳酸脫氫酶 基因，調(diào)整了代謝流向，極大地減少了乙酸、乳酸等副產(chǎn)物，使菌株的產(chǎn)乙醇能力大大提高。 重組后的菌株共發(fā)酵葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖等，可獲得37g/L乙醇。這一方法成功 地提高了 Thermoanaerobacterium saccharolyticum的產(chǎn)乙醇能力,但是其仍以糖類為底 物，要利用它轉(zhuǎn)化纖維素為乙醇，仍需要為纖維素的水解糖化投入大量的成本，此種方法并 不能完全解決纖維素乙醇生產(chǎn)成本高的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)纖維素乙醇的方法，以改善公知技術(shù)中存在的缺 陷。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的生產(chǎn)纖維素乙醇的方法，主要包括以下步驟a)將厭氧纖維素降解菌和乙醇厭氧桿菌接種于種子液培養(yǎng)基中，厭氧條件下50-70°C進(jìn)行活化；種子液培養(yǎng)基為:KH2P040. 5-3g/L，K2HP04 l_4g/L，氮源 l_3g/L，MgCl2 6H20 0. 5-2g/L, CaCl2 2H20 100-200mg/L, FeS04 6H20 0. 5-2mg/L, Cysteine hydrochloride 0. 5_2g/L，刃天青 l_3mg/L，碳源 4_6g/L，Morpholinopropane sulfonic acid 6_15g/L，酵 母浸出物 4-7g/L, Sodiumcitrate 2H20 1. 5-3. 5g/L ；b)將活化后的厭氧纖維素降解菌液接種于碳源為微晶纖維素的種子液培養(yǎng)基中， 將乙醇厭氧桿菌液接種于碳源為葡萄糖的種子液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液；c)種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧條件下，培養(yǎng)溫度50-70°C，培養(yǎng)時(shí)壓力 為-0. IMPa 0. IMPa，發(fā)酵時(shí)pH為6. 5-8. 0，發(fā)酵至纖維素降解。所述的方法中，氮源為尿素、黃豆餅粉、花生餅粉、玉米漿、硫酸銨、氯化銨、硝酸 銨、碳酸銨、碳酸氫銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨中的一種或任何幾種的組合。所述的方法中，碳源為葡萄糖、微晶纖維素、稻草、玉米秸稈、麥稈、莎草、甘蔗渣、 木屑的預(yù)處理物中的一種或任何幾種的組合。所述的方法中，碳源濃度大于15g/L，碳氮摩爾比為4-6 1。所述的方法中，所用厭氧纖維素降解菌包括熱纖梭菌 (Clostridiumthermocellum) > 口譽(yù)熱角軍糖梭菌(Clostridium thermosaccharolyticum) > 布氏嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium brockii)、嗜熱厭氧解木聚 糖桿菌(Thermoanaerobacterium xylanolyticum)禾口嗜熱厭氧解多糖桿菌 (Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum),以及在它們基礎(chǔ)上進(jìn)行的任何突變株；所用產(chǎn)乙醇厭氧桿菌包括嗜熱厭氧乙醇桿菌 (Thermoanaerobacterethanolicus) > 15 BW ^ M ft If lif (Thermoanaerobacterium mathranii)、嗜熱厭氧糖化桿菌(Thermoanaerobacterium saccharo 1 yticum)禾口意大禾1J嗜 熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter italicus)，以及在它們基礎(chǔ)上進(jìn)行的任何突變株。所述的方法中，厭氧纖維素降解菌和乙醇厭氧桿菌的接種體積比為10 1-1 3。所述的方法中，發(fā)酵培養(yǎng)中的菌種接種量體積比為1 10 1 50。所述的方法中，種子液培養(yǎng)基中碳源濃度大于15g/L時(shí)，控制pH為6. 8-7. 2。所述的方法中，發(fā)酵采用分批發(fā)酵、補(bǔ)料-分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)發(fā)酵的方 式。所述的方法中，發(fā)酵時(shí)采用間歇性或低速攪拌。本發(fā)明突破了傳統(tǒng)的單一菌種發(fā)酵，采用本身具有較強(qiáng)纖維素降解能力的高溫厭 氧纖維素降解菌和有較強(qiáng)乙醇轉(zhuǎn)化能力的高溫產(chǎn)乙醇厭氧桿菌進(jìn)行混合培養(yǎng)。利用高溫 厭氧纖維素降解菌產(chǎn)生的纖維素酶和半纖維素酶降解纖維素、半纖維素得到纖維二塘、纖 維糊精、木糖、木聚二糖等可發(fā)酵成分，同時(shí)由高溫產(chǎn)乙醇厭氧桿菌將還原糖直接轉(zhuǎn)化為乙 醇。高溫纖維素降解菌與高溫產(chǎn)乙醇厭氧桿菌二者互利共生，相互促進(jìn)，直接發(fā)酵纖維素糖 醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)理論值的71%。自然界中菌種眾多，到底哪種組合最優(yōu)呢？經(jīng)過我們探索，以 高溫纖維素降解菌與高溫產(chǎn)乙醇厭氧桿菌混合發(fā)酵的纖維素乙醇生產(chǎn)模式，采用本發(fā)明中 列舉的高溫細(xì)菌，是目前為止最優(yōu)的組合。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明開發(fā)了一條直接轉(zhuǎn)化纖維素生物質(zhì)為燃料乙醇的工藝。所要解決的技術(shù)問 題可以通過以下方案來實(shí)現(xiàn)高溫纖維素降解菌是一類厭氧纖維素降解菌，其能在60°C左右快速生長，并產(chǎn)生 大量的纖維小體分解纖維素、半纖維素為纖維二塘、木糖、木聚二糖等。其本身也能利用分 解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)生產(chǎn)乙醇、乙酸、乳酸、0)2和吐。本發(fā)明所采用的高溫纖維素降解菌 為能耐受3%乙醇、抗逆性能強(qiáng)的布氏嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium brockii) 菌株。高溫產(chǎn)乙醇厭氧桿菌能與高溫纖維素降解菌混合培養(yǎng)，其最大的特點(diǎn)在于可以同時(shí) 利用纖維素降解菌分解纖維素產(chǎn)生的己糖和戊糖轉(zhuǎn)化為乙醇，副產(chǎn)物為乙酸、乳酸、C02和 H2。本發(fā)明采用的高溫產(chǎn)乙醇厭氧桿菌為能耐受6%乙醇、抗逆性能強(qiáng)的麻氏嗜熱厭氧桿菌 (Thermoanaerobacterium mathranii)菌株。布氏嗜熱厭氧桿菌與麻氏嗜熱厭氧桿菌共同 培養(yǎng)、高溫厭氧發(fā)酵，可省去發(fā)酵過程中通入氧氣或壓縮空氣所需的昂貴消耗；高溫發(fā)酵不 易發(fā)生污染，可減少冷卻用水，還有助于乙醇的回收提??；二者的細(xì)胞得率都很低，有利于 總轉(zhuǎn)化率的提高。這些都將進(jìn)一步降低纖維素乙醇的生產(chǎn)成本。本發(fā)明以纖維素生物質(zhì)為原料，如微晶纖維素或稻草、玉米秸稈、麥稈、莎草、甘蔗 渣，木屑等的預(yù)處理物為原料，發(fā)酵法直接生產(chǎn)乙醇，主要包括以下步驟1)發(fā)酵種子液的制備。種子液培養(yǎng)基以尿素為氮源，布氏嗜熱厭氧桿菌以5g/L微晶纖 維素為碳源，麻氏嗜熱厭氧桿菌以5g/L葡萄糖為碳源，其余成分與1中發(fā)酵培養(yǎng)基配方相同。2)按配方:KH2P04 1. 5g/L，K2HP04 (anhydrous) 2. 9g/L，氮源 2. lg/L，MgCl2 6H20 1. Og/L, CaCl2 2H20 150mg/L,FeS04 6H20 1. 25mg/L, Cysteinehydrochloride 1. Og/L,刃 天青 2. 0mg/L，碳源 5. Og/L,Morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) 10. Og/L (恒定 pH 時(shí) 可不添加)，酵母浸出物6. 0g/L, Sodium citrate 2H20 3. Og/L配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并滅菌。 其中，碳源為纖維素質(zhì)生物質(zhì)，氮源為有機(jī)或無機(jī)氮源；滅菌前調(diào)節(jié)PH為7.6 ；若需擴(kuò)大底 物濃度，則仍應(yīng)保持碳氮比為5 1。3)接種將培養(yǎng)好的種子液按一定比例接入?yún)捬跗炕虬l(fā)酵罐中。4)培養(yǎng)溫度60°C，厭氧，罐或瓶壓為-0. IMPa 0. IMPa,間歇性或低速攪拌。高 底物濃度(碳源濃度大于15g/L)發(fā)酵時(shí)應(yīng)控制pH恒定為7. 0左右。發(fā)酵方式可采用分批， 補(bǔ)料分批，連續(xù)或半連續(xù)等。按照以上步驟，發(fā)酵纖維素質(zhì)生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn) 的。本發(fā)明開發(fā)的直接轉(zhuǎn)化纖維素質(zhì)生物質(zhì)為乙醇的工藝，基于CBP工藝思路，突破了傳統(tǒng) 的單菌純種培養(yǎng)，采用高溫纖維素降解菌與高溫產(chǎn)乙醇厭氧桿菌混合發(fā)酵，分別同時(shí)進(jìn)行 纖維素降解和乙醇轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步降低了燃料乙醇的生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面的了解本發(fā)明，但不以任 何方式限制本發(fā)明。 實(shí)施例1 100ml厭氧瓶發(fā)酵 1)用1ml注射器各取100^1布氏嗜熱厭氧桿菌 (Thermoanaerobacteriumbrockii)胃禾口 g 氏 口譽(yù) & M ft If lif (Thermoanaerobacterium mathranii)的甘油管菌種，接種于裝有5ml種子培養(yǎng)基(按配方KH2P04 1. 5g/L，K2HP04 (anhydrous) 2. 9g/L, urea 2. lg/L, MgCl2 6H20 1. Og/L, CaCl2 2H20 150mg/ L, FeS04 6H20 1. 25mg/L, Cysteine hydrochloride 1. Og/L,^ # 2. Omg/L,
microcrystalline cellulose 5. Og/L, Morpholinopropane sulfonic acid 10. Og/L, Yeast extract 6. Og/L, Sodium citrate 2H20 3. Og/L, pH 為 7. 6)的厭氧瓶中，60°C恒溫 培養(yǎng)，活化菌種。2)將活化好的布氏嗜熱厭氧桿菌液3ml和麻氏嗜熱厭氧桿菌液1ml分別接種于 30ml種子培養(yǎng)基中，60°C，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)，得到一級種子液。3)按配方[KH2P04 1. 5g/L, K2HP04 (anhydrous) 2. 9g/L, urea 2. lg/L, MgCl2 6H20 1. Og/L, CaCl2 2H20 150mg/L,FeS04 6H20 1. 25mg/L, Cysteinehydrochloride 1. Og/L,刃
2. Omg/L,microcrystalline cellulose 5. Og/L,Morpholinopropane sulfonic acid 10. Og/L, Yeast extract 6. Og/L, Sodiumcitrate 2H20 3. Og/L]配制發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)整初 始pH為7. 6。分裝培養(yǎng)基100ml于250ml厭氧瓶中，不斷通入氮?dú)?，并用聚丁酯塞密封，?保證瓶內(nèi)厭氧環(huán)境。115°C，15min濕熱滅菌。其中，鈣、鎂、鐵鹽分別配成100X母液于滅菌 后加入。4)測定布氏嗜熱厭氧桿菌和麻氏嗜熱厭氧桿菌一級種子液的々_，計(jì)算總體積 10ml下布氏嗜熱厭氧桿菌與麻氏嗜熱厭氧桿菌々_比為3 1時(shí)的體積。按計(jì)算所得的結(jié) 果接種布氏嗜熱厭氧桿菌和麻氏嗜熱厭氧桿菌于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，60°C恒溫培養(yǎng)。5)約36h后纖維素被完全降解，停止培養(yǎng)獲得發(fā)酵液中乙醇濃度為1. 7g/L，糖醇 轉(zhuǎn)化率33. 8%0實(shí)施例2 :5L發(fā)酵罐發(fā)酵1)按照實(shí)施例1所述方法制備布氏嗜熱厭氧桿菌一級種子液200ml，麻氏嗜熱厭 氧桿菌一級種子液100ml，并計(jì)算接種量為1 10，發(fā)酵液總體積為2L時(shí)各自所需體積。2)按配方[KH2P04 1. 5g/L, K2HP04 (anhydrous) 2. 9g/L, urea 17. 8g/L, MgCl2 6H20 1.Og/L, CaCl2 2H20 150mg/L, FeS04 6H20 1. 25mg/L, Cysteinehydrochloride 1. Og/L, 刃天青 2. Omg/L, microcrystalline cellulose 80g/L, Yeast extract 6. Og/L, Sodium citrate 2H20 3. Og/L]配制發(fā)酵培養(yǎng)基(鈣、鎂、鐵鹽母液滅菌后加入)，115°C，15min濕 熱滅菌。3)滅菌結(jié)束后，不斷向發(fā)酵罐中通入氮?dú)?，以去除培養(yǎng)基及發(fā)酵罐內(nèi)的氧氣。待 培養(yǎng)基由淡藍(lán)色或粉紅色(刃天青的顏色)變成無色后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH恒定為7.0，罐溫 60°C，同時(shí)接入所需體積的#143菌和#146菌一級種子液，停止通氣，80rpm攪拌發(fā)酵。4)約168h后纖維素被全部消耗，發(fā)酵液中乙醇濃度達(dá)21. 7g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá) 36. 17%，為理論值的71%。以上是結(jié)合具體實(shí)施例子對本發(fā)明所做的進(jìn)一步描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了 解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理， 在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都 落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
權(quán)利要求
一種生產(chǎn)纖維素乙醇的方法，主要包括以下步驟a)將厭氧纖維素降解菌和乙醇厭氧桿菌接種于種子液培養(yǎng)基中，厭氧條件下50-70℃進(jìn)行活化；種子液培養(yǎng)基為KH2PO40.5-3g/L，K2HPO41-4g/L，氮源1-3g/L，MgCl2·6H2O 0.5-2g/L，CaCl2·2H2O 100-200mg/L，F(xiàn)eSO4·6H2O 0.5-2mg/L，Cysteine hydrochloride 0.5-2g/L，刃天青1-3mg/L，碳源4-6g/L，Morpholinopropane sulfonic acid 6-15g/L，酵母浸出物4-7g/L，Sodiumcitrate·2H2O 1.5-3.5g/L；b)將活化后的厭氧纖維素降解菌液接種于碳源為微晶纖維素的種子液培養(yǎng)基中，將乙醇厭氧桿菌液接種于碳源為葡萄糖的種子液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液；c)種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧條件下，培養(yǎng)溫度50-70℃，培養(yǎng)時(shí)壓力為-0.1MPa～0.1MPa，發(fā)酵時(shí)pH為6.5-8.0，發(fā)酵至纖維素降解。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，氮源為尿素、黃豆餅粉、花生餅粉、玉米漿、硫酸 銨、氯化銨、硝酸銨、碳酸銨、碳酸氫銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨中的一種或任何幾種的組合.
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，碳源為葡萄糖、微晶纖維素、稻草、玉米秸稈、麥 稈、莎草、甘蔗渣、木屑的預(yù)處理物中的一種或任何幾種的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，碳源濃度大于15g/L，碳氮摩爾比為4-6 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所用厭氧纖維素降解菌包括熱纖梭 菌(Clostridium thermocellum)、嗜熱角軍糖梭菌(Clostridiumthermosacchar olyticum)、布氏嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumbrockii) >嗜熱厭氧角軍 木聚糖桿菌(Thermoanaerobacterium xyIanoIyticum)和嗜熱厭氧解多糖桿菌 (Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum),以及在它們基礎(chǔ)上進(jìn)行的任何突變株；所用產(chǎn)乙醇厭氧桿菌包括嗜熱厭氧乙醇桿菌(Thermoanaerobacterethanolicus) > 麻氏嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium mathranii)、嗜熱厭氧糖化 桿菌(Thermoanaerobacterium saccharoIyticum)禾口意大禾1J 嗜熱厭氧桿菌 (Thermoanaerobacter italicus)，以及在它們基礎(chǔ)上進(jìn)行的任何突變株。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其中，厭氧纖維素降解菌和乙醇厭氧桿菌的接種體 積比為10 1-1 3。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，發(fā)酵培養(yǎng)中的菌種接種量體積比為1 10 1 50。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，種子液培養(yǎng)基中碳源濃度大于15g/L時(shí)，控制pH 為 6. 8-7. 2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，發(fā)酵采用分批發(fā)酵、補(bǔ)料-分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵或 半連續(xù)發(fā)酵的方式。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，發(fā)酵時(shí)采用間歇性或低速攪拌。
全文摘要
一種生產(chǎn)纖維素乙醇的方法a)將厭氧纖維素降解菌和乙醇厭氧桿菌接種于種子液培養(yǎng)基中，厭氧條件下50-70℃進(jìn)行活化；b)將活化后的厭氧纖維素降解菌液接種于碳源為微晶纖維素的種子液培養(yǎng)基中，將乙醇厭氧桿菌液接種于碳源為葡萄糖的種子液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液；c)種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧條件下，培養(yǎng)溫度50-70℃，培養(yǎng)時(shí)壓力為-0.1MPa～0.1MPa，發(fā)酵時(shí)pH為6.5-8.0，發(fā)酵至纖維素降解。本發(fā)明所得乙醇轉(zhuǎn)化率為33％--36％。本發(fā)明同時(shí)進(jìn)行纖維素降解和乙醇轉(zhuǎn)化，節(jié)約能耗，降低了纖維素乙醇的生產(chǎn)成本，有利于推動低碳經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生物質(zhì)能源替代化石燃料的進(jìn)程。
文檔編號C12P7/14GK101851656SQ201010149120
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月19日
發(fā)明者宋厚輝, 徐健, 秦勇, 黃建忠 申請人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所