專利名稱：魚肉制品中鱈魚種源的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于魚肉制品中物種來源鑒定的檢測技術(shù)，具體地說是用實時熒光PCR技術(shù)檢測食品中鱈魚的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
海洋捕撈的海洋大型魚類一直是世界各國人民喜愛的食品，也是國際貿(mào)易的重要商品種類。海洋大型魚類在貿(mào)易中常常包括加工成魚肉片或者魚肉塊，更包括一些魚的內(nèi)臟或者其他深加工的產(chǎn)品。這些產(chǎn)品從外觀上已經(jīng)不能看出用來加工的原料魚種類，因此需要不受外觀和加工工藝的限制來確認商品的真?zhèn)?。基于DNA的檢測方法可以從基因水平進行物種鑒定。實時熒光PCR法以其操作簡便、靈敏、特異、快速、重復性好、定量準確、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，得到研究者的普遍認可，成為基因檢測和鑒定的重要工具。目前國內(nèi)外還沒有對鱈魚物種的鑒定方法公開，本發(fā)明可彌補上述缺陷，完成魚肉制品中鱈魚種源的鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明屬于魚肉制品中物種來源鑒定的檢測技術(shù)，具體地說是用實時熒光PCR技術(shù)檢測食品中鱈魚的快速檢測方法?？朔谛螒B(tài)學的檢測方法在魚類產(chǎn)品加工過程中帶來的鑒定困難，為確定鱈魚的種源提供技術(shù)手段，從而確保食品標簽的一致性。本發(fā)明的主要原理為針對保守序列設(shè)計一組引物上游引物C088F 5-GGCTTTGGGAACTGACTC-3,下游引物 C088R :5-AAAGGAGCAGGAAAGATGG_3。利用裂解液破碎細胞，三氯甲烷抽提蛋白質(zhì)，異丙醇沉淀得到DNA ；以提取的DNA為模板進行PCR擴增；測定熔解曲線時，在反應(yīng)體系中加入熒光染料Eva Green，染料與DNA雙鏈結(jié)合并發(fā)出熒光， 由于反應(yīng)中存在少量的非特異聚合體(如引物二聚體等)，能引起干擾，但非特異聚合體的熔解溫度較特異性結(jié)合低，當擴增結(jié)束后，再緩慢加溫，當DNA變性后，染料被釋放，熒光減少，而非特異性結(jié)合先于特異性結(jié)合減少，對熔解過程進行連續(xù)動態(tài)監(jiān)測可得熔解曲線，通過曲線將非特異性訊號和特異性訊號區(qū)分出來，同時對特異性訊號區(qū)，熒光減少的快慢與濃度的對數(shù)成正比，以此可以確定是否有引物特異性擴增產(chǎn)物。本發(fā)明涉及的鱈魚種源快速檢測方法，其中的試劑包括如下(I)PCR擴增反應(yīng)液包括10\ 0 反應(yīng)緩沖液、0.1-0.4讓01/1dNTP、2_4mmol/L硫酸鎂、1-2U Taq 酶、 0. 2-0. 6ymol/L 上游引物、0. 2-0. 6 μ mol/L 下游引物、1. 25 μ L 20 XEva Green 染料(美國Biotum公司)；其中10XPCR反應(yīng)緩沖液含有l(wèi)OOmmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、 500mmol/L氯化鉀和1 %曲拉通X-100 ；上游弓丨物C088F :5-GGCTTTGGGAACTGACTC-3，下游弓丨物 C088R 5-AAAGGAGCAGGAAAGATGG-3。其中上游引物、下游引物體積比為1 1;
使用上述試劑盒檢測食品中鱈魚種源的方法，依次包括下列步驟(1)-(3)(1)待檢樣品DNA的提取DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。DNA提取質(zhì)量使用 OD260和OD28tl的光吸收來衡量，或者使用其他方法衡量。(2)鱈魚種源的實時熒光PCR擴增A.在裝有MyL PCR擴增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入1 μ L待檢樣品DNA，混勻。B.檢測過程中分別設(shè)陽性對照、空白對照。使用具有溯源性的陽性標準物質(zhì)作為陽性對照，用已知不含魚類成分的樣品作陰性對照，用等體積的水代替模板DNA作空白對照。C.將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴增94-95 "C 2_4min，l 個循環(huán)；94-95"C 10_60s，61°C 10-60s，共 40 個循環(huán)；950C 15s，60°C 15s，20min 內(nèi)升溫至 95°C，95°C 15s。(3)使用熔解曲線分析PCR擴增結(jié)果。非鱈魚樣品熔解曲線在80.5士 1°C無單一峰；鱈魚樣品熔解曲線在80.5士 1°C
有單一峰。本發(fā)明建立了鱈魚種源的實時熒光PCR檢測方法及檢測方法。本發(fā)明采用實時熒光PCR技術(shù)，該技術(shù)特異性強、靈敏度高、操作簡便，特別適用于一些成分復雜的魚肉制品中鱈魚種源的檢測。


圖1是實施例1中鱈魚樣品PCR產(chǎn)物的熔解曲線圖。圖2是實施例2中鱈魚樣品PCR產(chǎn)物的熔解曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1按下述方法檢測市售鱈魚包括10XPCR 反應(yīng)緩沖液、0. 2mmol/L dNTP、2mmol/L 硫酸鎂 1. 5U Taq 酶、0. 4ymol/L 上游引物 C088F :5-GGCTTTGGGAACTGACTC_3，下游引物 C088R 5-AAAGGAGCAGGAAAGATGG-3。其中10XPCR反應(yīng)緩沖液含有100mmol/LpH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、 500mmol/L氯化鉀和1 %曲拉通X-100 ； 按照以下程序進行檢測(1)待測魚肉樣品DNA的提取A.稱取0.5g魚肉，剪碎，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中。加入500 μ L抽提裂解緩沖液 (0. 05MTris-HCL (三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸)、0. IM EDTA (乙二胺四乙酸)、0. 2M氯化鈉、 PH值7. 6滅菌雙蒸水)，充分振蕩；B.加入蛋白酶K 60 yL,10% SDS 2 μ L，顛倒混勻。57°C水浴IOh至原料消化為清液，4000rpm離心2min，取上清；C.加入500 μ L等體積的Tris-酚，顛倒混勻IOmin, 12000rpm離心IOmin,取上清；D.重復上步；E.在上清液中加入Tris-酚、氯仿和異戊醇(體積比為25 24 1)，顛倒混勻 lOmin，12000rpm 離心 lOmin，取上清；F.在上清液中加入氯仿和異戊醇(體積比為M 1)，顛倒混勻10min，12000rpm 離心lOmin，取上清；G.加入兩倍體積無水乙醇，1/5體積的醋酸鈉(4M)，顛倒混勻lOmin，沉淀DNA ； 12000rpm離心lOmin，棄上清；H.加入600 μ L乙醇(70% )洗滌DNA，離心棄上清，開蓋，晾干；I.加入100 μ L滅菌雙蒸水溶解DNA。J. DNA提取質(zhì)量純度OD260/OD280 = 1. 83，濃度為IOlng/ μ L。滿足PCR反應(yīng)的條件。(2)待測魚片DNA的實時熒光PCR擴增Α.在PCR反應(yīng)管中加入MyL PCR反應(yīng)液A禾Π 1 μ L樣品DNA,混勻。B.將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴增94-95 "C 2_4min，1 個循環(huán)；94-95"C 10_60s，61°C 10_60s，共 40 個循環(huán)；950C 15s，60°C 15s，20min 內(nèi)升溫至 95°C，95°C 15s。(3)應(yīng)用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析熔解曲線結(jié)果。非鱈魚樣品熔解曲線在81 士 1°C無單一峰；鱈魚樣品熔解曲線在81 士 1°C有單一峰。單一峰分別為鱈魚陽性標準品和待檢樣品的熔解曲線。沒有出峰的線是空白對照， 見圖1實施例2按下述方法檢測市售魚內(nèi)臟是否為鱈魚來源包括IOXPCR 反應(yīng)緩沖液、0. 2mmol/L dNTP、2mmol/L 硫酸鎂 1. 5U Taq 酶、0. 4ymol/L 上游引物 C088F :5-GGCTTTGGGAACTGACTC_3，下游引物 C088R 5-AAAGGAGCAGGAAAGATGG-3。其中IOXPCR反應(yīng)緩沖液含有l(wèi)OOmmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、 500mmol/L氯化鉀和1 %曲拉通X-100 ；按照以下程序進行檢測(1)待測魚內(nèi)臟樣品DNA的提取A.稱取0.5g魚內(nèi)臟，剪碎，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中。加入500 μ L抽提裂解緩沖液 (0.05Μ Tris-HCL (三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸)、0. IM EDTA(乙二胺四乙酸)、0. 2Μ氯化鈉、pH值7. 6滅菌雙蒸水)，充分振蕩；B.加入蛋白酶K 60 μ L，10% SDS 2 μ L，顛倒混勻。57°C水浴IOh至原料消化為清液，4000rpm離心2min，取上清；C.加入500 μ L等體積的Tris-酚，顛倒混勻lOmin, 12000rpm離心IOmin,取上清；D.重復上步；E.在上清液中加入Tris-酚、氯仿和異戊醇(體積比為25 24 1)，顛倒混勻 lOmin，12000rpm 離心 lOmin，取上清；F.在上清液中加入氯仿和異戊醇(體積比為M 1)，顛倒混勻10min，12000rpm 離心lOmin，取上清；G.加入兩倍體積無水乙醇，1/5體積的醋酸鈉(4M)，顛倒混勻lOmin，沉淀DNA ； 12000rpm離心lOmin，棄上清；H.加入600 μ L乙醇(70% )洗滌DNA，離心棄上清，開蓋，晾干；I.加入100 μ L滅菌雙蒸水溶解DNA。J. DNA提取質(zhì)量純度OD260/OD280 = 1. 87，濃度為127ng/ μ L。滿足PCR反應(yīng)的條件。(2)待測魚片DNA的實時熒光PCR擴增A.在PCR反應(yīng)管中加入MyL PCR反應(yīng)液A禾Π 1 μ L樣品DNA,混勻。B.將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴增94-95"C 2-4min, 1 個循環(huán)；94-95"C 10_60s，61°C 10_60s，共 40 個循環(huán)；950C 15s，60°C 15s，20min 內(nèi)升溫至 95°C，95°C 15s。(3)應(yīng)用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析熔解曲線結(jié)果。單一峰分別為鱈魚陽性標準品的熔解曲線。沒有出峰的線是待檢樣品和空白對照，見圖2。樣品的熔解曲線在80. 5士 1°C無單一峰；據(jù)此可判定該樣品不是鱈魚來源。
權(quán)利要求
1.一種鱈魚物種鑒定的快速檢測方法，其特征在于其中的引物 上游引物 C088F 5-GGCTTTGGGAACTGACTC-3 ；下游引物 C088R :5-AAAGGAGCAGGAAAGATGG-3。
2.一種使用權(quán)利要求一所述的快速鑒定鱈魚物種的檢測方法，其特征是依次包括下列步驟(1)待檢樣品的DNA提??；(2)鱈魚COI基因的實時熒光PCR擴增在裝有M μ L的PCR擴增反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入1 μ L的待檢樣品DNA，混勻。按照下述步驟完成PCR擴增。94-950C 2-4min, 1 個循環(huán)；94-950C 10-60s，61°C 10_60s，共 40 個循環(huán)；950C 15s，60°C 15s，20min 內(nèi)升溫至 95°C，95°C 15s。(3)使用熔解曲線分析PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物的熔解曲線的單一熔解峰出現(xiàn)在80. 5 士 1 °C。
全文摘要
本發(fā)明屬于魚肉制品中物種來源鑒定的檢測技術(shù)，具體地說是用實時熒光PCR技術(shù)檢測食品中鱈魚的快速檢測方法。方法包括PCR擴增反應(yīng)液和上游引物CO88F5-GGCTTTGGGAACTGACTC-3，下游引物CO88R5-AAAGGAGCAGGAAAGATGG-3。鱈魚的快速檢測方法包括魚肉制品DNA的提取、鱈魚種屬特異性基因的實時熒光PCR擴增和使用熔解曲線進行結(jié)果判定。其優(yōu)點是快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便。
文檔編號C12N15/11GK102191316SQ20101015029
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者劉彩霞, 孫敏, 林超, 梁成珠, 高宏偉 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心