專利名稱：：腰果過(guò)敏原pcr檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，本發(fā)明涉及一種腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法，快速檢測(cè)腰果過(guò)敏原的試劑盒，以及腰果致敏蛋白基因的特異性引物對(duì)在檢測(cè)腰果過(guò)敏原中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：食品過(guò)敏原現(xiàn)已成為一個(gè)新興的公眾性健康問(wèn)題，全世界范圍內(nèi)有1%_2%的成年人對(duì)食品過(guò)敏，有8%以上低于三歲兒童對(duì)食品過(guò)敏。產(chǎn)生的臨床癥狀有皮膚反應(yīng)(蕁麻疹、血管性水腫、濕疹等)、呼吸癥狀(哮喘、鼻炎等)、腸胃癥狀(嘔吐、腹瀉、腸胃痙攣等)、全身系統(tǒng)反應(yīng)(心血管癥狀等)，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生過(guò)敏性休克危及生命。現(xiàn)有食品中過(guò)敏原檢測(cè)方法主要有利用單克隆或多克隆抗體檢測(cè)食品過(guò)敏原蛋白的方法和采用PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)食品中過(guò)敏原基因的方法。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。針對(duì)過(guò)敏原蛋白的方法，直接檢測(cè)致敏蛋白，針對(duì)性更好；但對(duì)食品，特別是深加工食品檢測(cè)時(shí)，由于其中過(guò)敏原蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而易導(dǎo)致假陰性結(jié)果。針對(duì)過(guò)敏原基因的方法，沒(méi)有直接檢測(cè)致敏蛋白，而間接檢測(cè)過(guò)敏原成分，針對(duì)性不如前一種方法；但對(duì)深加工食品檢測(cè)時(shí)，由于深加工對(duì)DNA的破壞程度低于對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞，因此可改善假陽(yáng)性情況。目前，食品中腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，且尚無(wú)針對(duì)腰果致敏蛋白基因的檢測(cè)方法。此外，國(guó)外已經(jīng)開發(fā)了幾種腰果致敏蛋白檢測(cè)試劑盒，但是其通常與芝麻、胡桃、開心果等存在交叉反應(yīng)，特異性不高。本領(lǐng)域還未見(jiàn)報(bào)道用于快速檢測(cè)食品中腰果過(guò)敏原的試劑盒。因此，本領(lǐng)域需要一種快速、特異性好、靈敏度高的腰果過(guò)敏原檢測(cè)方法以及用于快速檢測(cè)腰果過(guò)敏原的試劑盒，進(jìn)行食品、藥品以及營(yíng)養(yǎng)品中腰果過(guò)敏原的檢測(cè)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供快速檢測(cè)腰果過(guò)敏原的PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供快速檢測(cè)腰果過(guò)敏原的試劑盒。本發(fā)明的還一個(gè)目的在于，提供腰果致敏蛋白基因的特異性引物對(duì)在檢測(cè)腰果過(guò)敏原中的應(yīng)用。針對(duì)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法，所述方法包括使用針對(duì)腰果致敏蛋白基因的特異性弓I物對(duì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法中特異性引物對(duì)的確定包括對(duì)腰果致敏蛋白基因的特異性引物的設(shè)計(jì)和引物篩選步驟。關(guān)于腰果過(guò)敏原的研究很少，而利用腰果致敏蛋白通過(guò)PCR檢測(cè)腰果過(guò)敏原的方法目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)腰果中主要致敏蛋白Anaol(參見(jiàn)acashew(Anacardiumoccidental)allergenofthevicilinseedstorageproteinfamily.FangWang，JasonM.Robotham，Suza皿eS.Teuber，PallaviTawde，ShridharK.Sathe，andKennethH.Roux.J.ALLERGYCLIN.IMMUNOL.，2002，110:1160-1166)、Anao2(參見(jiàn)aMajorCashew(AnacardiumoccidentaleL.)NutAllergenoftheLeguminFamily.FangWang，JasonM.，RobothamaSuzanneS.，TeuberbShridharK.Sathe，andKe騰thH.Roux.Int.Arch.AllergyImmunol.2003，132:27-39)以及Anao3(參見(jiàn)animportantcashew皿t(AnacardiumoccidentaleL)allergenofthe2Salbuminfamily.JasonM.，Robotham，F(xiàn)angWang，VanessaSeamon，SuzanneS.Teuber，ShridharK.Sathe，HughA.Sampson,KirstenBeyer，MargaretSeavyandKennethH.Roux.J.ALLERGYCLIN.IMMUNOL.2005，115:1284-1290)設(shè)計(jì)特異性引物，以通過(guò)PCR方法檢測(cè)腰果過(guò)敏原。在一個(gè)本發(fā)明的腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述腰果致敏蛋白基因選自Ana01、Ana02和Ana03基因中的一種或多種。在本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，針對(duì)腰果主要致敏蛋白AnaOl基因的特異性引物對(duì)為Ana01Fl:TTCCTCCGACCAGTCAATCT(SEQIDNO:1)和Ana01R2:TGCCTTCTGCGTTTACTTCA(SEQIDNO:2);Ana01F2:ACTATGCCGCTTTAGGTGTC(SEQIDNO:3)和Ana01R2:TGCCTTCTGCGTTTACTTC(SEQIDNO:4);Ana01F3:TCCTCCGACCAGTCAATCT(SEQIDNO:5)和Ana01R3:GTTGCCTTCTGCGTTTACTT(SEQIDNO:6)。在本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，針對(duì)腰果主要致敏蛋白Ana02基因的特異性引物對(duì)為Ana02Fl:AGGGTGAGGGTATGACAGGA(SEQIDNO:7)和Ana02Rl:TTTGAGGATTGGGAGGTTGA(SEQIDNO:8);Ana02F2:ATCCAACCTAATGGCCTTCT(SEQIDNO:9)和Ana02R2:ATTGGCTAACACTTCCTCTGG(SEQIDNO:10);Ana02F3:TCCAGGGTGAGGGTATGAC(SEQIDNO:11)和Ana02R3:TTGAGGATTGGGAGGTTGA(SEQIDNO:12)。在本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，針對(duì)腰果主要致敏蛋白Ana03基因的特異性弓l物對(duì)為Ana03Fl-TACTCCTCCTATCTGCCTTCG(SEQIDNO:13)和Ana03Rl:CACCCTTTATTTGTTCCTGTG(SEQ扁0:14);Ana03F2:AACGCCTCCATTTACCGA(SEQIDN0:15)禾口Ana03R2:CTGCCTCACCATTTGCTCTA(SEQIDNO:16);Ana03F3:TACTCCTCCTATCTGCCTTCG(SEQIDNO:17)和Ana03R3:CCTCCTCACCCTTTATTTGT(SEQIDNO:18)。更優(yōu)選地，在本發(fā)明的腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法中，所使用的針對(duì)腰果主要致敏蛋白基因的特異性引物對(duì)為Ana03F3:TACTCCTCCTATCTGCCTTCG(SEQIDNO:17)和Ana03R3:CCTCCTCACCCTTTATTTGT(SEQIDNO:18)。在一個(gè)實(shí)施方案中，引物設(shè)計(jì)采用美國(guó)Primere鄧ress3.0軟件進(jìn)行。在本發(fā)明的腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法中的特異性引物對(duì)的確定中，在引物篩選步驟中的篩選條件為選擇退火溫度較高、擴(kuò)增條帶清晰、無(wú)非特異性條帶、無(wú)引物二聚體的引物對(duì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法還進(jìn)一步包括提取樣品DNA的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述DNA提取采用CTAB方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述DNA提取采用商業(yè)化的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述商業(yè)化的試劑盒為WizardMagneticDNAPurificationforFood。在本發(fā)明的腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法中，還進(jìn)一步包括對(duì)PCR擴(kuò)增條件進(jìn)一步優(yōu)化的步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化的步驟中，使用不同的退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述PCR擴(kuò)增條件是94t:，5min;94°C，30s;5(TC，30s，R=3.0°C/s，G=5.5°C，35個(gè)循環(huán)；72。C，5min。在本發(fā)明的腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法中，還進(jìn)一步包括確定PCR方法特異性的步驟。在一個(gè)優(yōu)選的檢測(cè)PCR方法特異性的實(shí)施方案中，所使用的堅(jiān)果為開心果、杏仁、花生、巴西堅(jiān)果、長(zhǎng)壽果、核桃、山核桃、瓜子、芝麻、大麥、榛果、松子。在一個(gè)優(yōu)選的檢測(cè)PCR方法特異性的實(shí)施方案中，使用植物通用引物作為內(nèi)參照來(lái)保證擴(kuò)增有效性。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用腰果引物對(duì)Ana03F、Ana03R和植物通用擴(kuò)增弓l物對(duì)18Srdna-1:CTCAACCATAAACGATGCCGACCAG(SEQIDNO:19)，18Srdna-2:CCAGACAAATCGCTCCACCAACTAA(SEQIDNO:20)，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。在本發(fā)明的腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法中，還進(jìn)一步包括確定PCR方法靈敏度的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中。所述確定PCR方法靈敏度包括確定PCR方法的絕對(duì)靈敏度和相對(duì)靈敏度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品DNA溶液吸光值，用無(wú)菌水對(duì)樣品DNA溶液進(jìn)行系列稀釋，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)確定絕對(duì)靈敏度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)如下步驟確定相對(duì)靈敏度將腰果與大麥核酸裂解溶液混和，配成系列稀釋的含腰果成分的腰果大麥混合溶液，提取DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法的確定包括如下步驟1.提取樣品DNA;2.引物設(shè)計(jì)；3.引物篩選；4.PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化；5.確定方法特異性；禾口6.確定方法靈敏度。本發(fā)明提供了一種腰果過(guò)敏原的PCR檢測(cè)方法，其根據(jù)腰果的主要致敏蛋白Ana01、Ana02、Ana03的基因序列，設(shè)計(jì)引物，篩選出特異性好的最佳引物，建立了特異性好、靈敏度高的腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)法，從而實(shí)現(xiàn)廉價(jià)、快速、高特異性、高靈敏度地檢測(cè)腰果過(guò)敏原。本發(fā)明適宜于腰果過(guò)敏原的快速測(cè)定，可快速、特異且靈敏地測(cè)定腰果過(guò)敏原致敏基因，從而為確保食品過(guò)敏人群得到安全的食品提供技術(shù)手段。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的測(cè)定方法的確定包括以下步驟A.提取樣品DNA采用CTAB方法(Murray,M.G.andW.F.Thompson.1980.RapidisolationofhighmolecularweightDNA.NucleicAcidsRes.8:4321-4325)，也可采用商業(yè)化的試劑盒，如WizardMagneticDNAPurificationforFood(promega公司，美國(guó))等，提取樣品DNA。特異性實(shí)驗(yàn)中使用的其他堅(jiān)果樣品DNA的提取以及靈敏度實(shí)驗(yàn)中大麥粉和腰果混合樣品DNA的提取也采用上述方法。B.引物設(shè)計(jì)利用美國(guó)Primere鄧ress3.0軟件(ABI公司，美國(guó))，針對(duì)腰果的三種主要致敏蛋白Ana01、Ana02、Ana03的基因序列，設(shè)計(jì)9對(duì)引物，引物均由上海英駿技術(shù)公司合成。C.引物篩選引物對(duì)的初步篩選，以腰果樣品DNA(濃度為lOng/yL)為模板，分別采用上述引物進(jìn)行溫度梯度PCR擴(kuò)增，根據(jù)2%瓊脂糖凝膠電泳圖，選擇退火溫度較高、擴(kuò)增條帶清晰、無(wú)非特異性條帶、無(wú)引物二聚體的引物對(duì)。引物對(duì)的特異性篩選，選擇易與腰果發(fā)生交叉反應(yīng)的開心果、杏仁、花生、核桃、瓜子、芝麻、榛果，提取其DNA，以其DNA為模板，分別以初步篩選出的幾對(duì)引物為擴(kuò)增引物，進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)2%瓊脂糖凝膠電泳圖，選擇無(wú)交叉反應(yīng)的引物對(duì)。D.PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化以腰果樣品DNA為模板，采用篩選出來(lái)的腰果引物，使用不同退火溫度擴(kuò)增，2X瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，找出該引物反應(yīng)的最佳退火溫度。E.確定方法特異性以腰果、杏仁、開心果等13種堅(jiān)果DNA為模板，采用篩選出來(lái)的腰果引物對(duì)Ana03F、Ana03R和植物通用擴(kuò)增引物對(duì)18Srdna-1，18Srdna-2，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，在以植物通用引物作為內(nèi)參照來(lái)保證擴(kuò)增有效性的情況下，確定該方法的特異性。用2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。F.確定方法靈敏度確定方法的絕對(duì)靈敏度。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定腰果樣品DNA溶液吸光值，確定其濃度。用無(wú)菌水稀釋腰果樣品DNA溶液，使其質(zhì)量濃度分別為10ng/iiL、lng/iiL、100pg/iiL、10pg/iiL、lpg/iiL。分別取5iiL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，確定發(fā)生擴(kuò)增的最小濃度為絕對(duì)靈敏度。確定方法的相對(duì)靈敏度。分別稱取研磨成細(xì)粉狀的腰果、大麥0.5g放入1.5mL離心管中，加入lmL核酸裂解液，放入65tV恒溫振蕩2h。將腰果與大麥溶液混和，配成含有10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.001%、0.0001%腰果(W/W)溶液，采用A中方法提取DNA。分別取5yL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，確定發(fā)生擴(kuò)增的最小濃度為相對(duì)靈敏度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供快速檢測(cè)腰果過(guò)敏原的試劑盒，所述試劑盒包括用于PCR檢測(cè)腰果過(guò)敏原的針對(duì)腰果致敏蛋白基因的特異性引物對(duì)和使用說(shuō)明書。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括用于樣品DNA提取的試劑和用于PCR反應(yīng)的試劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒的使用說(shuō)明書中包括對(duì)用于腰果過(guò)敏原PCR擴(kuò)增的條件的描述。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒的說(shuō)明書中給出的PCR擴(kuò)增條件是94。C，5min;94。C，30s，55.4°C，30s，72°C，30s，35個(gè)循環(huán)；72。C，5min;4。C，保存。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供腰果致敏蛋白基因的特異性引物對(duì)在檢測(cè)腰果過(guò)敏原中的應(yīng)用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供腰果致敏蛋白基因的特異性引物對(duì)Ana01F3:TCCTCCGACCAGTCAATCT和Ana01R3:GTTGCCTTCTGCGTTTACTT在檢測(cè)腰果過(guò)敏原中的應(yīng)用。本發(fā)明的檢測(cè)方法和試劑盒不僅適合檢測(cè)食品中的腰果過(guò)敏原，還能夠檢測(cè)其他物品，例如藥品、營(yíng)養(yǎng)品等中的腰果過(guò)敏原。使用本發(fā)明的PCR檢測(cè)方法和PCR檢測(cè)試劑盒，能夠簡(jiǎn)單、快速、特異且靈敏地測(cè)定食品以及其他物品中是否含有腰果過(guò)敏原。圖1是顯示本發(fā)明的腰果致敏原特異性引物對(duì)的PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化，其中各泳道的腰果DNA的擴(kuò)增退火溫度如下:1:44.5°C;2:44.6°C;3:45.2°C;4:46.2°C;5:47.5°C;6:48.9°C;7:50.4°C;8:51.9°C;9:53.3°C;10:54.5°C;11:55.4°C;12:55.9°C。圖2是顯示腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法特異性的結(jié)果其中各泳道的樣品如下M:DNAMarker;1:腰果DNA的PCR產(chǎn)物；2.杏仁DNA的PCR產(chǎn)物；3:開心果DNA的PCR產(chǎn)物；4:花生DNA的PCR產(chǎn)物；5:巴西堅(jiān)果DNA的PCR產(chǎn)物；6:長(zhǎng)壽果DNA的PCR產(chǎn)物；7:核桃DNA的PCR產(chǎn)物；8:葵花籽DNA的PCR產(chǎn)物；9:山核桃DNA的PCR產(chǎn)物；10:榛果DNA的PCR產(chǎn)物；11:松子DNA的PCR產(chǎn)物；12:芝麻DNA的PCR產(chǎn)物；13:大麥DNA的PCR產(chǎn)物；14:空白對(duì)照。圖3是顯示腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法相對(duì)靈敏度的結(jié)果其中各泳道的樣品如下M:DNAMarker;1-9:依次為含10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.001%、0.0001%腰果成分的腰果大麥混合物的PCR產(chǎn)物；10:空白對(duì)照。圖4是顯示腰果過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法絕對(duì)靈敏度的結(jié)果其中各泳道的樣品如下:M:DNAMarker;1-6:依次為10ng/iiL、lng/iiL、lOOpg/yL、10pg組、lpg組、0.lpg/yL的腰果DNA的PCR產(chǎn)物;7:空白對(duì)照。具體實(shí)施例方式通過(guò)實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但是本發(fā)明并不僅僅局限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1本實(shí)施例為采用CTAB法提取腰果DNA的典型實(shí)例。稱取研磨后樣品0.lg放入1.5mL離心管中，加入lmLCTAB提取緩沖液(lOOmmol/LTris-HCl(pH8.0)、20mmol/LEDTA_Na2、1.4mol/LNaCl、2%CTAB，使用前加入0.1%(V/V)的P_巰基乙醇)，放入65°C，恒溫振蕩lh。經(jīng)13000r/min，lOmin離心后取上清700yL，加入490iiL氯仿，高速漩渦振蕩混合30s。經(jīng)13000r/min，lOmin離心后，取500yL上清，轉(zhuǎn)入新管中，加入2倍體積CTAB，室溫(20°C)孵化lh。13000r/min，5min離心后，棄上清，將沉淀溶于350iiL，1.2MNaCl溶液，65°C，放置20min。加入350yL氯仿，高速渦旋震蕩30s，混勻。13000r/min，離心10min，將定量的上清轉(zhuǎn)移至新管，加入0.8倍體積的異丙醇，_20°C放置0.5h。13000r/min，10min離心后，棄上清，用70%乙醇洗滌。13000r/min，lOmin離心后，棄上清。常溫下干燥后，溶于lOOiiLddH20，65。C放置5min。4。C保存，待用。對(duì)于腰果DNA，也可采用商品化的核酸提取試劑盒，如WizardMagneticDNAPurificationforFood進(jìn)行提取。實(shí)施例2本實(shí)施例提供用于本發(fā)明的PCR方法的腰果致敏原特異性引物對(duì)的設(shè)計(jì)。利用美國(guó)Primerexpress3.0軟件，針對(duì)腰果的三種主要致敏蛋白(AnaOl、Ana02、Ana03)的基因序列，設(shè)計(jì)9對(duì)引物(見(jiàn)表1)，引物均由上海英駿技術(shù)公司合成。表1引物序列、目的基因及長(zhǎng)度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例3本實(shí)施例提供用于本發(fā)明的PCR方法的腰果致敏原特異性引物對(duì)的初步篩選和特異性篩選。引物對(duì)的初步篩選，以腰果DNA(濃度為10ng/i!L)為模板，分別采用上述引物進(jìn)行溫度梯度PCR擴(kuò)增，根據(jù)2%瓊脂糖凝膠電泳圖，選擇退火溫度較高、擴(kuò)增條帶清晰、無(wú)非特異性條帶、無(wú)引物二聚體的引物對(duì)。擴(kuò)增條件為94°C，5min;94°C，30s;5(TC，30s，R=3.0°C/s，G=5.5。C，35個(gè)循環(huán)；72。C，5min;4。C，保存。擴(kuò)增體系為緩沖液，2.L;dNTP，2yL;弓l物，10iimol/L，各0.5iiL;Taq酶，0.2iiL;模板DNA，30ng/iiL，5iiL;水，補(bǔ)足至體積為25iiL。經(jīng)初步篩選，選出以下幾對(duì)引物Ana01F2和Ana01R2，Ana02F2和Ana02R2，Ana03Fl和Ana03Rl，Ana03F3和Ana03R3，將其用做后續(xù)步驟的擴(kuò)增引物。引物對(duì)的特異性篩選，選擇易與腰果發(fā)生交叉反應(yīng)的開心果、杏仁、花生、核桃、瓜子、芝麻、榛果，提取其DNA，以其DNA為模板，分別以初步篩選出的幾對(duì)引物為擴(kuò)增引物，進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)2X瓊脂糖凝膠電泳圖，選擇無(wú)交叉反應(yīng)的引物對(duì)Ana03F3和Ana03R3。PCR擴(kuò)增退火溫度，根據(jù)初步篩選結(jié)果確定。實(shí)施例4本實(shí)施例提供用于本發(fā)明的PCR方法的腰果致敏原特異性引物對(duì)的PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化。以腰果DNA為模板，采用篩選出來(lái)的腰果引物，使用不同退火溫度擴(kuò)增，2X瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，找出該引物反應(yīng)的最佳退火溫度。所使用的退火溫度為44.5t:、44.6°C、45.2°C、46.2°C、47.5°C、48.9°C、50.4°C、51.9°C、53.3°C、54.5°C、55.4°C、55.9°C。從圖1可見(jiàn)，退火溫度為55.4t:時(shí)能從樣品中擴(kuò)增出明亮清晰的條帶，且無(wú)拖尾，無(wú)非特性條帶和引物二聚體。實(shí)施例5本實(shí)施例是確定本發(fā)明的PCR方法特異性的實(shí)施例。如實(shí)施例1所述的方法，分別提取腰果、杏仁、開心果、花生、巴西堅(jiān)果、長(zhǎng)壽果、核桃、葵花籽、山核杉L榛果、松子、芝麻、大麥樣品的DNA。以上述13種堅(jiān)果DNA為模板，采用篩選出來(lái)的腰果引物對(duì)Ana03F，Ana03R和植物18SrDNA基因?yàn)閮?nèi)參照，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，在以植物通用引物作為內(nèi)參照來(lái)保證擴(kuò)增有效性的情況下，確定該方法的特異性。作為內(nèi)參照的植物18SrDNA基因的引物對(duì)序列為18Srdna-lCTCAACCATAAACGATGCCGACCAG(SEQIDNO:19)，18Srdna-2CCAGACAAATCGCTCCACCAACTAA(SEQIDNO:20)。用2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。根據(jù)篩選試驗(yàn)結(jié)果，確定PCR反應(yīng)的退火溫度為55.4°C。PCR反應(yīng)體系為:10x緩沖液，2.5iiL;dNTP0.1-0.5ymol/L，2yL;引物對(duì)Ana03F、Ana03R，10iimol/L，各0.5iiL;引物對(duì)18Srdna_l、18Srdna_2，10iimol/L，各0.5iiL;TaqDNA酶0.5_5U，0.2iiL;模板DNA，10ng/iiL，5iiL;水，補(bǔ)足至體積為25iiL。擴(kuò)增條件擴(kuò)增條件為94。C，5min;94。C，30s，55.4°C，30s，72°C，30s，35個(gè)循環(huán)；72。C，5min;4t:，保存。從圖2可見(jiàn)，篩選出的引物對(duì)Ana03F3和Ana03R3(簡(jiǎn)稱Ana03FR)，僅腰果擴(kuò)增出了目標(biāo)條帶和內(nèi)標(biāo)條帶；其他堅(jiān)果均未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，但是擴(kuò)增出了內(nèi)部條帶；空白對(duì)照未發(fā)生擴(kuò)增。說(shuō)明該方法特異性好。實(shí)施例6本實(shí)施例是確定本發(fā)明的PCR方法靈敏度的實(shí)施例，包括絕度靈敏度和相對(duì)靈敏度的確定。確定方法的絕對(duì)靈敏度。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定腰果DNA溶液吸光值，確定其濃度。用無(wú)菌水稀釋腰果DNA溶液，使其質(zhì)量濃度分別為10ng/iiL、lng/iiL、100pg/iiL、10pg/iiL、lpg/iiL。分別取5iiL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增中退火溫度為55.4°C。用2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，確定發(fā)生擴(kuò)增的最小濃度為絕對(duì)靈敏度。確定方法的相對(duì)靈敏度。分別稱取研磨成細(xì)粉狀的腰果、大麥0.5g放入1.5mL離心管中，加入lmL核酸裂解液，放入65tV恒溫振蕩2h。將腰果與大麥溶液混和，配成含有10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.001%、0.0001%腰果(W/W)溶液，采用A中方法提取DNA。分別取5yL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，確定發(fā)生擴(kuò)增的最小濃度為相對(duì)靈敏度。從圖3可見(jiàn)，該方法可檢出0.001%腰果成分，從圖4可見(jiàn)，該方法可檢出0.lpg/pL的腰果DNA。說(shuō)明該方法檢測(cè)食品中腰果過(guò)敏原成分的相對(duì)靈敏度為0.001%(W/W)，絕對(duì)靈敏度為O.lpg/iiL。實(shí)施例7本實(shí)施例提供本發(fā)明的腰果過(guò)敏原的PCR檢測(cè)方法。所述食品中腰果過(guò)敏原的PCR檢測(cè)方法包括如下步驟1.食品DNA提取如實(shí)施例1中所述，采用CTAB法提取食品樣品DNA。2.使用腰果致敏原特異性引物對(duì)Ana03F，Ana03R和植物通用擴(kuò)增引物對(duì)18Srdna-l，18Srdna_2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件如表1和2所示。表1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>該方法特異性好、靈敏度高地檢測(cè)了食品中腰果過(guò)敏原。實(shí)施例8本實(shí)施例提供檢測(cè)食品中腰果過(guò)敏原的試劑盒。所述試劑盒包括引物對(duì)Ana03F，Ana03R和引物對(duì)18Srdna-l，18Srdna-2PCR，以及使用說(shuō)明書，其中引物對(duì)Ana03F，Ana03R是用于PCR檢測(cè)食品中腰果過(guò)敏原的針對(duì)腰果主要致敏蛋白基因的特異性引物對(duì)，18Srdna-1，18Srdna-2是植物通用擴(kuò)增引物，所述使用說(shuō)明書中給出了PCR擴(kuò)增條件，擴(kuò)增條件為:94。C，5min;94°C，30s，55°C，30s，72°C，30s，35個(gè)循環(huán)；72°C，5min;4"，保存。雖然已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在不偏離本發(fā)明的范圍或精神的前提下可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種改變與修飾。因而，本發(fā)明意欲涵蓋落在附屬權(quán)利要求書及其同等物范圍內(nèi)的所有這些改變與修飾。權(quán)利要求一種腰果過(guò)敏原的PCR檢測(cè)方法，所述方法包括使用針對(duì)腰果致敏蛋白基因的特異性引物對(duì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述致敏蛋白基因選自致敏蛋白Ana01、Ana02和Ana03基因中的一種或多種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述PCR檢測(cè)方法是檢測(cè)腰果致敏蛋白Ana03基因。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述特異性的引物對(duì)為SEQIDN0:17和SEQIDNO:18。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中PCR反應(yīng)的擴(kuò)增退火溫度為55.4°C。6.快速檢測(cè)腰果過(guò)敏原的試劑盒，所述試劑盒包括用于PCR檢測(cè)腰果過(guò)敏原的針對(duì)腰果致敏蛋白基因的特異性引物對(duì)和使用說(shuō)明書。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，所述特異性引物對(duì)為SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，所述使用說(shuō)明書中給出的PCR反應(yīng)的擴(kuò)增退火溫度為55.4°C。9.腰果致敏蛋白基因的特異性引物對(duì)在檢測(cè)腰果過(guò)敏原中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述特異性引物對(duì)為SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。全文摘要本發(fā)明涉及測(cè)定腰果過(guò)敏原的PCR檢測(cè)方法，所述方法包括使用針對(duì)腰果致敏蛋白基因的特異性引物對(duì)。本發(fā)明還涉及快速檢測(cè)腰果過(guò)敏原的試劑盒，所述試劑盒包括用于PCR檢測(cè)腰果過(guò)敏原的針對(duì)腰果致敏蛋白基因的特異性引物對(duì)。本發(fā)明還涉及腰果致敏蛋白基因的特異性引物對(duì)在檢測(cè)腰果過(guò)敏原中的應(yīng)用。使用本發(fā)明的PCR檢測(cè)方法和PCR檢測(cè)試劑盒，能夠簡(jiǎn)單、快速、特異且靈敏地測(cè)定食品、藥品以及營(yíng)養(yǎng)品等中是否含有腰果過(guò)敏原。文檔編號(hào)C12N15/11GK101792815SQ20101015080公開日2010年8月4日申請(qǐng)日期2010年3月25日優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日發(fā)明者袁飛申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院;袁飛