專利名稱：：具有誘導(dǎo)和組織特異表達(dá)特性的啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有誘導(dǎo)和組織特異表達(dá)特性的啟動(dòng)子。
背景技術(shù)：
：重金屬，如銅、鋅等，可以作為酶或其它蛋白的輔助因子或結(jié)構(gòu)組分，對(duì)植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。然而，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)這些重金屬離子的濃度升高時(shí)，將會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，并導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受到抑制。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，進(jìn)化出一系列有效的分子機(jī)制用于重金屬解毒，從而提高植物對(duì)重金屬的耐受性，如利用一些生物分子對(duì)金屬離子進(jìn)行高度特異性螯合是其中最重要的機(jī)制之一。這些特異性的分子包括氨基酸、有機(jī)酸以及兩類富含半胱氨酸多肽，植物螯合肽(phytochelatin，PC)和金屬硫蛋白(metallothionein,MT)，金屬硫蛋白可以結(jié)合金屬離子，形成金屬離子_硫簇，從而對(duì)胞內(nèi)金屬離子濃度的提高起到緩沖作用，降低重金屬對(duì)細(xì)胞的毒性，在植物細(xì)胞中，PC的合成主要是由PC合成酶的轉(zhuǎn)錄后激活進(jìn)行調(diào)控的，而MT蛋白是由一類基因(MT基因)所編碼的。MT基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中存在一系列精確的調(diào)控，因此對(duì)MT基因啟動(dòng)子進(jìn)行分析和研究具有重要的意義，有助于揭示植物中MT基因的表達(dá)模式，如MT基因表達(dá)的組織特異性及其對(duì)金屬誘導(dǎo)的響應(yīng)特性等，并可以進(jìn)一步為農(nóng)作物的遺傳改良提供新的材料。到目前為止，已有100多個(gè)植物MT基因的全序列可以在數(shù)據(jù)庫(kù)中直接獲得。許多報(bào)導(dǎo)表明多數(shù)植物MT基因的表達(dá)具有組織特異性，而且這些基因編碼的MT蛋白在許多植物的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，如果實(shí)成熟、根的發(fā)育、栓化、授粉、種子成熟等過(guò)程中起著重要的作用。不同的MT基因由于不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式，因而具有不同的表達(dá)模式，編碼的蛋白產(chǎn)物也特異地在相應(yīng)的組織中發(fā)揮其功能。在植物MT基因啟動(dòng)子對(duì)金屬離子的響應(yīng)特性方面，目前的研究報(bào)導(dǎo)還很少，還需要更加深入的研究，尤其是對(duì)金屬響應(yīng)的DNA順式作用元件的鑒定等方面?，F(xiàn)在植物中一個(gè)已知的金屬響應(yīng)元件是銅響應(yīng)元件(copperresponseelement，CuRE)，是研究人員從綠藻Chlamydomonasreinhardtii中分離得到的。CuRE含有一段保守的核心序列5‘-GTAC-3‘(QuinnJM,MerchantS(1995).Twocopper-responsiveelementsassociatedwiththeChlamydomonasCyc6genefunctionastargetsfortranscriptionalactivators.PlantCell7,623-638.；QuinnJM,BarracoP,ErikssonM,MerchantS(2000).Coordinatecopper—andoxygen-responsiveCyc6andCpxlexpressioninChlamydomonasismediatedbythesameelement.J.Biol.Chem.275,6080-6089·)。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)了與CuRE結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，銅響應(yīng)因子(copperresponseregulator,CRR1)。在綠藻中，當(dāng)銅缺乏時(shí)，CRRl可以結(jié)合到位點(diǎn)上，并激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。另外也有報(bào)導(dǎo)證實(shí)，CuRE和CRRl在植物對(duì)鎳離子的響應(yīng)中也發(fā)揮重要的作用(QuinnJM，KropatJ,MerchantS(2003).CopperresponseelementandCrrl-dependentNi2+-responsivepromoterforinduced,reversiblegeneexpressioninChlamydomonasreinhardtii.Eukaryot.Cell2，995-1002·)。在對(duì)金屬響應(yīng)元件及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子的鑒定方面，與植物中相對(duì)較少的研究相比，在酵母和動(dòng)物細(xì)胞中的研究則較為深入系統(tǒng)。在酵母中，已有報(bào)導(dǎo)表明銅響應(yīng)的MT基因上游啟動(dòng)子中含有一段金屬響應(yīng)元件(metal-responsiveelement,MRE)，它的核心序列為5’-HTHNNGCTCD-3’，與之對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子為ACE1。ACEl可以結(jié)合到MRE元件上，從而調(diào)控下游MT基因的轉(zhuǎn)錄。在動(dòng)物中，MT基因?qū)饘俚捻憫?yīng)是通過(guò)金屬響應(yīng)元件(metal-responsiveelement,MRE)介導(dǎo)的，MRE含有一段保守的DNA序列5，-TGCRCNC-3，，轉(zhuǎn)錄因子MRE-結(jié)合因子(MREbindingtranscriptionfactor-1,MTF-1)可以識(shí)別并結(jié)合到MRE元件上，激活下游MT基因的表達(dá)。在動(dòng)物細(xì)胞中，MRE元件通常呈多個(gè)拷貝串聯(lián)排列出現(xiàn)在MT基因上游的啟動(dòng)子區(qū)。目前，有相關(guān)的報(bào)導(dǎo)表明在植物中也存在與動(dòng)物MRE元件序列相似的順式作用元件，這些元件在植物MT基因響應(yīng)金屬誘導(dǎo)過(guò)程中有重要作用。如呂世友等發(fā)現(xiàn)在水稻MT基因ricMT的啟動(dòng)子中，片段-331/-194對(duì)于啟動(dòng)子響應(yīng)銅離子誘導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用，該片段的缺失可以導(dǎo)致ricMT基因啟動(dòng)子對(duì)銅離子的不響應(yīng)，進(jìn)一步的序列分析發(fā)現(xiàn)在該片段中存在一段DNA序列，與動(dòng)物MRE元件非常相似(LUSY，GuHY，YuanXJ，WangΧΜ,WuAM,QuLJetal.(2007).TheGUSreporter-aidedanalysisofthepromoteractivitiesofaricemetallothioneingenerevealsdifferentregulatoryregionsresponsiblefortissue-specificandinducibleexpressionintransgenicArabidopsis.TransgenicRes.16，177-191.)。類似的情況在許多其它植物的MT基因中也有報(bào)道，如PsMTA(Fordham-SkeltonAP,LilleyC,UrwinPE,RobinsonNJ(1997).GUSexpressioninArabidopsisdirectedby5'-regionsofthepeametallothionein-likegenePsMTA.PlantMol.Biol.34,659-668.),LeMTB(WhitelawCA,LeHuquetJA,ThurmanDA,TomsettAB(1997).TheisolationandcharacterizationoftypeIImetallothioneinlikegenesfromtomato(LycopersiconesculentumL·)·PlantMol.Biol.33,503-511.),PmMT(ChatthaiM,OsuskyM,OsuskaL,YevtushenkoD,MisraS(2004).FunctionalanalysisofaDouglas-firmetallothionein-likegenepromotertransientassaysinzygoticandsomaticembryosandstabletransformationintransgenictobacco.Planta220,118-128.)等。動(dòng)物MRE類似序列也在其它非MT的金屬響應(yīng)基因中發(fā)現(xiàn)，如大豆(Phaseolusvulgaris)脅迫相關(guān)基因2(stress-relatedgenenumber2，PvSR2)的表達(dá)受到多種金屬離子的誘導(dǎo)，在該基因的啟動(dòng)子中，片段-222/-188驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告基因活性可以對(duì)重金屬誘導(dǎo)響應(yīng)，經(jīng)HgCl2處理后，⑶S活性提高約8.2倍。這一片段中含有一個(gè)與動(dòng)物MRE序列相似的元件，對(duì)該元件進(jìn)行點(diǎn)突變后，該片段對(duì)金屬離子的響應(yīng)能力顯著減弱，可見(jiàn)該元件在PvSR2基因響應(yīng)金屬誘導(dǎo)過(guò)程中具有重要作用(QiXT,ZhangYX,ChaiTY(2007).CharacterizationofanovelplantpromoterspecificalIyinducedbyheavymetalandidentificationofthepromoterregionsconferringheavymetalresponsiveness.PlantPhysiol.143，50-59.)。但是對(duì)于這些動(dòng)物MRE類似元件在植物中是如何發(fā)揮其調(diào)控作用的，以及它對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子是什么等問(wèn)題目前還知之甚少，還有待進(jìn)一步的研究分析。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供具有誘導(dǎo)和組織特異表達(dá)特性的啟動(dòng)子。本發(fā)明提供的DNA片段(啟動(dòng)子)，為如下1)至8)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子(Rl)；2)序列表中序列1自5’端第679至1730位核苷酸所示的DNA分子(R2)；3)序列表中序列1自5’端第817至1730位核苷酸所示的DNA分子(R3)；4)序列表中序列1自5，端第1148至1730位核苷酸所示的DNA分子(R4)；5)序列表中序列1自5，端第1589至1730位核苷酸所示的DNA分子(R5)；6)序列表中序列2所示的DNA分子(R5m)；7)在嚴(yán)格條件下與1)中6)中任一所述的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；8)與1)中6)中任一所述的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC,0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC,0.1%SDS和1XSSC,0.1%SDS各洗膜一次。含有所述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體可為在pCAMBIA-1381的多克隆位點(diǎn)插入所述DNA片段得到重組質(zhì)粒，具體可為用所述DNA片段取代pCAMBIA-1381的BamHI和SpeI酶切識(shí)別位點(diǎn)間的小片段(CaMV35S啟動(dòng)子)得到的重組質(zhì)粒。所述DNA片段可應(yīng)用于啟動(dòng)目的基因表達(dá)。所述目的基因表達(dá)可為誘導(dǎo)表達(dá)和/或組織特異表達(dá)。所述組織特異表達(dá)中的組織具體可為根、花的柱頭、萼片、花絲中的至少一種。所述誘導(dǎo)表達(dá)具體可為為脫落酸誘導(dǎo)表達(dá)、黑暗誘導(dǎo)表達(dá)、鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)、干旱誘導(dǎo)表達(dá)和傷誘導(dǎo)表達(dá)中的至少一種。所述誘導(dǎo)表達(dá)具體可為Pb2+離子誘導(dǎo)表達(dá)、Al3+離子誘導(dǎo)表達(dá)、Zn2+離子誘導(dǎo)表達(dá)、Cu2+離子誘導(dǎo)表達(dá)和Cd2+離子誘導(dǎo)表達(dá)中的至少一種。所述Pb2+離子具體來(lái)源于PbSO4,所述Al3+離子具體來(lái)源于AlCl3,所述Zn2+離子具體來(lái)源于ZnSO4,所述Cu2+離子具體來(lái)源于CuSO4，所述Cd2+離子具體來(lái)源于CdCl2；所述誘導(dǎo)表達(dá)為根特異性表達(dá)。所述DNA片段可應(yīng)用于植物育種中。本發(fā)明的啟動(dòng)子在生長(zhǎng)期和成株期的擬南芥中均具有根特異性。本發(fā)明的啟動(dòng)子在生長(zhǎng)期擬南芥的根和成株期擬南芥花的柱頭中活性很高，在生長(zhǎng)期擬南芥的地上部分活性較低，在莖中沒(méi)有活性。本發(fā)明的啟動(dòng)子在蓮座葉和莖生葉中只在排水器和表皮毛中具有活性，衰老葉片中只在排水器中具有活性，另外，在莖生葉中本發(fā)明的啟動(dòng)子具有傷誘導(dǎo)特性。擬南芥的花器官中本發(fā)明的啟動(dòng)子在柱頭頂部具有較強(qiáng)的活性，在萼片和花絲中也有一定活性，在花瓣的微觀組織中具有相對(duì)較弱的活性。在幼嫩的果莢中本發(fā)明的啟動(dòng)子主要在果莢的上半部分具有活性，隨著果實(shí)的逐漸成熟，活性逐漸降低，當(dāng)果莢完全成熟開(kāi)裂時(shí)，幾乎檢測(cè)不到活性；在成熟的種子中，本發(fā)明的啟動(dòng)子沒(méi)有活性。在擬南芥的根中，本發(fā)明的啟動(dòng)子受到各種環(huán)境信號(hào)的誘導(dǎo)(如ABA、干旱、暗處理等)，還受到多種金屬離子的強(qiáng)烈誘導(dǎo)(如Cu2+，Zn2+，Pb2+和Al3+)，而且啟動(dòng)子響應(yīng)的程度因金屬離子的類型和濃度的不同而有所差異，根是植物與外界環(huán)境進(jìn)行離子交換的最重要的部位。在植物轉(zhuǎn)基因工程中，啟動(dòng)子的選擇是十分重要的。有時(shí)，利用組成型啟動(dòng)子在植物中過(guò)量表達(dá)某一目的基因，往往對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育是有害的，甚至有時(shí)無(wú)法得到高表達(dá)的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物。在這種情況下，誘導(dǎo)型表達(dá)的啟動(dòng)子，如金屬誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子就是很好的選擇。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子可作為金屬響應(yīng)的啟動(dòng)子，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物工程中，用于獲得對(duì)重金屬高度耐受的農(nóng)作物新品種，或用于培育可以大量累積重金屬的植物。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子可作為脅迫響應(yīng)的啟動(dòng)子，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物工程中，用于獲得對(duì)逆境耐受的農(nóng)作物新品種。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子可作為使目的蛋白在組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物工程中，用于獲得在根中特異啟動(dòng)目的基因表達(dá)的農(nóng)作物新品種。圖1為0sMT-I_4b基因啟動(dòng)子序列中的順式作用元件分析；翻譯起始密碼子ATG中A堿基記為+1位置；預(yù)測(cè)的CAAT和TATAbox用灰色陰影并下劃線表示；預(yù)測(cè)的與重金屬誘導(dǎo)相關(guān)的元件用灰色陰影并方框表示；其它各種順式作用元件用方框表示；所有的元件名稱均標(biāo)記在序列下方。圖2為擬南芥不同發(fā)育時(shí)期的⑶S組織化學(xué)分析。圖3為幼苗在各種非生物脅迫條件下根中的⑶S活性變化。圖4為幼苗在各種金屬離子存在的條件下根中的GUS活性變化。圖5為幼苗在各種濃度金屬離子存在的條件下根中的GUS活性變化。圖6為不同長(zhǎng)度0sMT-I_4b啟動(dòng)子的缺失構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因活性分析；左側(cè)為不同長(zhǎng)度0sMT-I-4b啟動(dòng)子缺失構(gòu)建的示意圖。其中丨代表推測(cè)的TATAbox，■代表預(yù)測(cè)的與動(dòng)物MRE類似的順式元件，0代表預(yù)測(cè)的CuRE元件，左側(cè)數(shù)字表示每個(gè)缺失片段的5’-起始位點(diǎn)(以翻譯起始位點(diǎn)定義為+1)；n.d.，檢測(cè)不到GUS活性(notdetectable)。圖7為轉(zhuǎn)基因擬南芥根中，不同長(zhǎng)度0sMT-I_4b啟動(dòng)子對(duì)金屬離子的響應(yīng)；圖中橫坐標(biāo)表示轉(zhuǎn)基因幼苗經(jīng)Cu2+(100yM，A)、Pb2+(50yM，B)或Al3+(50μM，C)處理24h后，與處理前相比，根中⑶S活性增長(zhǎng)的倍數(shù)，縱坐標(biāo)轉(zhuǎn)入不同DNA片段(R1、R2、R3、R4、R5和R5m)的轉(zhuǎn)基因植株。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。下述實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。GUS活性測(cè)定中，實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行3次重復(fù)；每次實(shí)驗(yàn)中每個(gè)株系每個(gè)處理采用30-40株幼苗，標(biāo)準(zhǔn)誤用誤差線表示，*P<0.05；**p<0.01。水稻中花10號(hào)(OryzasativaL.cv.Zhonghua10)國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)保存中心，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，郵編100081；聯(lián)系電話010-68919715。擬南芥Col-O=Columbia生態(tài)型擬南芥(ArabidopsisthalianaecotypeColumbia)。pCAMBIA-1381=CambiaInstitute，澳大利亞。農(nóng)桿菌GV3101中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)1.1488。實(shí)施例1、0sMT-I_4b基因啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)根據(jù)水稻I型MT基因0sMT-I-4b的全長(zhǎng)cDNA(NCBI序列號(hào)ΝΜ_001073598)，利用PCR的方法，以水稻中花10號(hào)(OryzasativaL.cv.Zhonghua10)基因組DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，克隆得到0sMT-I-4b基因上游1730bp的DNA片段，并命名為P0sMT_I_4b(0sMT_I_4b基因啟動(dòng)子)。P0sMT-I-4b中的順式作用元件分析見(jiàn)圖1，將其中翻譯起始密碼子ATG中的A堿基定義為+1，該序列中存在兩個(gè)基本啟動(dòng)子元件，TATAbox和CAATbox,分別位于-109/-103和-214/-211區(qū)，這些元件在真核基因轉(zhuǎn)錄中作為基本元件發(fā)揮功能。利用PLACE(http//www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/)軟件對(duì)0sMT-I_4b啟動(dòng)子中的順式作用元件進(jìn)行搜索預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)基本啟動(dòng)子元件的上游區(qū)域中，含有眾多與已知真核生物的順式元件的同源序列含有與動(dòng)物MRE元件核心序列類似的元件，共4個(gè)拷貝串聯(lián)分布，分別位于-1542/-1536、-1370/-1364、-371/-365和_275/_269處；與金屬響應(yīng)相關(guān)的元件CuRE元件，它以6個(gè)拷貝的形式串聯(lián)分布于-1498/-1495、-1041/-1038、-1014/-1011、-670/-667、-600/-597和-119/-116處，這些可能的金屬響應(yīng)元件的存在，說(shuō)明0sMT-I-4b基因?qū)饘匐x子的響應(yīng)過(guò)程存在復(fù)雜精細(xì)的調(diào)控；還存在一些其它的順式作用元件，這些元件在其它許多植物基因啟動(dòng)子中都存在，如ABRE(-996/-989)，MYC(-1082/-1077,-415/-410)，MYB(-1467/-1462、-1297/-1292和-856/-851)等，這些元件與0sMT-I-4b基因響應(yīng)ABA和其它脅迫信號(hào)有關(guān)；0sMT_I_4b中還包括2個(gè)拷貝的I-boX(-1008/-1003、-311/-306)，該元件在光信號(hào)的傳遞和響應(yīng)過(guò)程中其重要的調(diào)控作用；還包含2個(gè)拷貝的W-box(-465/-461、_336/_332)，它可以被WRKY類轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別，并在0sMT-I-4b基因響應(yīng)傷誘導(dǎo)中其作用。上述這些元件都與植物響應(yīng)各種環(huán)境脅迫有關(guān)，它們的存在說(shuō)明0sMT-I-4b基因啟動(dòng)子的活性除受到金屬離子誘導(dǎo)外，可能還受到環(huán)境因素的誘導(dǎo)，如ABA、干旱、光信號(hào)、傷害等。0sMT-I-4b基因啟動(dòng)子的核苷酸序列如序列表的序列1所示。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因植株的獲得一、重組表達(dá)載體A的構(gòu)建1、以水稻中花10號(hào)的基因組DNA為模板，用特異性引物對(duì)Rl(R1_F5，-CAGGATCCCCCCTCAAAAACTG-3’/Rl-R:5，-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3，，下劃線序列分別表示BamHI和SpeI酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化1.7kb左右的的DNA片段(啟動(dòng)子；-1730/-1；記為Rl；序列表的序列1所示的DNA片段)。2、用限制性內(nèi)切酶BamHI和SpeI酶切步驟1回收的PCR產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶BamHI和SpeI酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA_1381，回收載體骨^KO4、將步驟2的酶切產(chǎn)物與步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。5、將重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pCAMBIA-pMT-GUS(在出發(fā)載體的BamHI和SpeI酶切位點(diǎn)之間，用序列表的序列1所示的DNA片段替換了原有的CaMV35S啟動(dòng)子；又稱重組質(zhì)粒A)。二、轉(zhuǎn)基因植株的獲得1、將重組質(zhì)粒A導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌。2、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)，通過(guò)花浸泡法(CloughSJ,BentAF(1998).Floral-dipasimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.16，735-743.)將重組質(zhì)粒A導(dǎo)入擬南芥Col-0，得到Tl代種子。Tl代種子收獲后在MS培養(yǎng)基(含有25mg/L潮霉素)中篩選抗性植株，將未出現(xiàn)性狀分離的抗性植株(純合子株系)移栽到土中，收獲轉(zhuǎn)基因植株的T2代種子。三、轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的獲得用限制性內(nèi)切酶BamHI和SpeI酶切pCAMBIA_1381，回收載體骨架，用DNA聚合酶I的Klenow片段補(bǔ)平載體骨架的粘性末端，然后用T4DNA連接酶使載體環(huán)化，得到GUS報(bào)告基因上游不含任何啟動(dòng)子的空載體。用空載體代替重組質(zhì)粒A，其它步驟同步驟二，得到轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的T2代種子。實(shí)施例3、啟動(dòng)子的組織特異性將實(shí)施例2得到的轉(zhuǎn)基因植株的T2代和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照的T2代進(jìn)行⑶S組織化學(xué)染色，以確定其組織特異性。擬南芥種子經(jīng)表面消毒后，鋪在l/2MS(pH5.8，1.5%蔗糖，0.75%瓊脂)平板上，經(jīng)過(guò)4°C春化2天后，置于22°C培養(yǎng)箱中，光照16h，黑暗8h培養(yǎng)。在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)兩周后，擬南芥幼苗被移植到營(yíng)養(yǎng)土中，繼續(xù)生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)基因擬南芥中⑶S的組織化學(xué)檢測(cè)按照J(rèn)efferson等(JeffersonRA,KavanaghTA,BevanMW(1987).GUSfusionsβ-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ.6,3901-3907.)白勺方法進(jìn)。具體步驟取幼苗或其發(fā)育過(guò)程的各個(gè)器官，在含0.5%多聚甲醛的0.IM磷酸鈉緩沖液(ρΗ7.0)固定30min；然后置于⑶S反應(yīng)液中(含0.IM磷酸鈉緩沖液，ρΗ7.0IOmMEDTA,5mM鐵氰化鉀，1.OmMX-gluc及0.TritonX_100)，于30°C放置過(guò)夜；觀察植物的著色強(qiáng)度。幼苗或光合組織用70-100%系列乙醇脫色以去掉葉綠素，在體視鏡(Olympus，Japan)下觀察并照相。⑶S著色情況如圖2所示。圖2中，圖2a為1天大擬南芥幼苗，圖2b為3天大擬南芥幼苗，圖2c為5天大擬南芥幼苗，圖2d為10天大擬南芥幼苗，圖2e為20天大擬南芥幼苗的蓮座葉，圖2f為35天大擬南芥幼苗的蓮座葉，圖2g為35天大擬南芥幼苗的莖生葉，圖2h為擬南芥的衰老葉片，圖2i為擬南芥的衰老葉片的局部放大圖，圖2j為35天大擬南芥的莖，圖2k為40天大擬南芥的成熟花器官，圖21為40天大擬南芥的幼花，圖2m為45天大擬南芥的幼嫩果莢，圖2η為55天大擬南芥的成熟果莢，圖2ο為空載體對(duì)照擬南芥35天大的蓮座葉(左)和莖生葉(右)。1天大擬南芥幼苗中，可見(jiàn)GUS活性在子葉和胚根中相對(duì)較高，而在胚軸中相對(duì)較弱。3天大和5天大的幼苗中，GUS著色情況有所改變，GUS活性主要分布在胚根和胚軸中，而在子葉中的活性較低。在10天大的幼苗中，根中仍保持較強(qiáng)的GUS活性，另外在第1對(duì)真葉中也能檢測(cè)到GUS報(bào)告基因的表達(dá)。在1-10天大幼苗的根尖都檢測(cè)不到GUS著色。對(duì)于轉(zhuǎn)化空載體擬南芥幼苗，各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)間均檢測(cè)不到任何GUS著色。對(duì)于成熟擬南芥，根中同樣能檢測(cè)到較高的GUS活性。如在20天大和35天大的轉(zhuǎn)基因擬南芥的蓮座葉中，GUS活性只在排水器和表皮毛中可以檢測(cè)到，在莖生葉的排水器和表皮毛中也能檢測(cè)到GUS著色。而在衰老葉片中，只能在排水器中檢測(cè)到GUS活性。另夕卜，在莖生葉中受傷部位周?chē)梢詸z測(cè)到GUS著色，而在蓮座葉的受傷部位則檢測(cè)不到，說(shuō)明0sMT-I-4b啟動(dòng)子特異地在莖生葉中對(duì)傷誘導(dǎo)有響應(yīng)。在成熟擬南芥的莖中無(wú)明顯的GUS著色。對(duì)于轉(zhuǎn)化空載體擬南芥植株，各個(gè)組織中均檢測(cè)不到任何GUS著色。擬南芥的花器官中在柱頭頂部可以檢測(cè)到較強(qiáng)的GUS活性；在萼片和花絲中也有一定的GUS著色；另外在花瓣的微觀組織中也能檢測(cè)到相對(duì)較弱的GUS活性；在幼嫩的果莢中，GUS著色主要分布在果莢的上半部分，隨著果實(shí)的逐漸成熟，GUS活性逐漸降低，當(dāng)果莢完全成熟開(kāi)裂時(shí)，幾乎檢測(cè)不到GUS活性；在成熟的種子中也檢測(cè)不到GUS著色。在轉(zhuǎn)化空載體的擬南芥植物的花器官、果莢和種子中都檢測(cè)不到GUS活性。啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的根中表現(xiàn)出很高的活性。啟動(dòng)子活性在轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片中雖然比較低，但主要集中在葉片的表皮毛和葉緣的排水器中，這兩個(gè)部位都是植物體內(nèi)重金屬離子通過(guò)葉片向外排出的重要途徑。在生殖生長(zhǎng)階段，啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS主要在花器官的柱頭、花絲和萼片中有較強(qiáng)的著色?；ǖ陌l(fā)育過(guò)程需要多種金屬離子的參與。0sMT-I-4b的特異性高表達(dá)可能有助于花中金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和交換，從而在花發(fā)育過(guò)程中起重要作用。以上結(jié)果說(shuō)明，無(wú)論是在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，還是生殖生長(zhǎng)階段，0sMT-I-4b啟動(dòng)子的活性都受到復(fù)雜的調(diào)控，從而保證0sMT-I-4b基因特異地在某些組織中表達(dá)并發(fā)揮功能。實(shí)施例4、啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá)(對(duì)ABA和非生物脅迫處理的響應(yīng)能力)將實(shí)施例2得到的轉(zhuǎn)基因植株的T2代和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照的T2代分別進(jìn)行各種脅迫處理，然后進(jìn)行GUS活性測(cè)定，以確定其誘導(dǎo)表達(dá)特性。1、進(jìn)行各種脅迫處理擬南芥種子經(jīng)表面消毒后，鋪在l/2MS(pH5.8，1.5%蔗糖，0.75%瓊脂)平板上，經(jīng)過(guò)4°C春化2天后，置于22°C培養(yǎng)箱中，光照16h，黑暗8h培養(yǎng)。將V2MS平板上生長(zhǎng)10天的幼苗收集，用去離子水清洗2次后，分成5組，分別進(jìn)行如下處理干旱脅迫處理(干旱)將幼苗置于干的濾紙(Whatman，3mm)上，在空氣濕度為60%的培養(yǎng)箱中處理6h;鹽脅迫處理(高鹽)將幼苗置于浸滿IOOmMNaCl水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理6h；黑暗脅迫處理(暗處理)將幼苗置于浸滿去離子水的濾紙上，并于22°C下避光培養(yǎng)6h；脫落酸(ABA)處理將幼苗置于浸滿100μMABA水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理6h；對(duì)照處理(對(duì)照)將幼苗置于浸滿去離子水的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理6h。處理完畢后，分別收集未處理和不同處理后的擬南芥幼苗的根和地上部分，將其在液氮中速凍，用于隨后的GUS活性測(cè)定。2、⑶S活性測(cè)定(1)收集擬南芥材料，在研缽中加入液氮研磨成粉末，懸浮在GUS提取緩沖液(50mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0；0.1%TritonX-100,IOmMβ-疏基乙醇，IOmM1，2_環(huán)己二胺-N，N，N，N-四乙酸，0.月桂酸鈉)中，12，000Xg、4°C離心IOmin后收集上清。(2)蛋白質(zhì)的濃度按照Bradford的方法(BradfordMM(1976).Arapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinuti1izingtheprincipleofprotein-dyebinding.Anal.Biochem.72,248-254.)定量。用牛血清白蛋白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)Jefferson等的熒光測(cè)定法(JeffersonRA,KavanaghΤΑ,BevanMW(1987).GUSfusionsβ-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ.6，3901-3907.)測(cè)定⑶S活性。反應(yīng)底物為4-甲基-傘形酮-β-D-半乳糖苷(4-methyl-umbelliferyl-0-D-galactoside，4-MUG)，檢測(cè)不同反應(yīng)時(shí)間的樣品中，在激發(fā)光365nm、發(fā)射光455nm、狹縫IOnm條件下各樣品的熒光強(qiáng)度。(4)計(jì)算⑶S的活性。⑶S活性以每mg可溶性蛋白每分鐘產(chǎn)生的pmol4_甲基-傘形酮(4-methyl-umbelliferone，4-MU)為單位。以未處理樣品中的⑶S活性為1.0，計(jì)算各種處理后樣品中的相對(duì)GUS活性。幼苗在各種非生物脅迫條件下根中的⑶S活性變化見(jiàn)圖3。未經(jīng)任何處理時(shí)，⑶S活性為150.OlpmolMU/min/mg蛋白，經(jīng)去離子水處理6h后，⑶S活性為171.03pmolMU/min/mg蛋白，與處理前的對(duì)照相比，無(wú)顯著差異。100μMABA脅迫6h后，⑶S活性提高了7.65倍。干旱脅迫6h后，⑶S活性提高了5.38倍。黑暗脅迫6h后，⑶S活性提高了3.57倍。鹽脅迫6h后，⑶S活性只有較少的提高，為364.5lpmolMU/min/mg蛋白，是對(duì)照活性的2.43倍。這些結(jié)果說(shuō)明，0sMT-I-4b啟動(dòng)子對(duì)不同的環(huán)境脅迫有不同程度的響應(yīng)。與對(duì)照組相比，各種處理后擬南芥的地上部分的⑶S活性并未出現(xiàn)顯著性差異。以上結(jié)果說(shuō)明，該啟動(dòng)子對(duì)各種環(huán)境脅迫的響應(yīng)是根特異的。實(shí)施例5、啟動(dòng)子對(duì)各種金屬離子的響應(yīng)情況將實(shí)施例2得到的轉(zhuǎn)基因植株的T2代和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照的T2代分別進(jìn)行各種金屬離子處理，然后進(jìn)行GUS活性測(cè)定，以確定其誘導(dǎo)表達(dá)特性。1、進(jìn)行各種金屬離子處理擬南芥種子經(jīng)表面消毒后，鋪在l/2MS(pH5.8，1.5%蔗糖，0.75%瓊脂)平板上，經(jīng)過(guò)4°C春化2天后，置于22°C培養(yǎng)箱中，光照16h，黑暗8h培養(yǎng)。將V2MS平板上生長(zhǎng)10天的幼苗收集，用去離子水清洗2次后，分成7組，分別進(jìn)行如下處理CuSO4處理將幼苗置于浸滿100μMCuSO4水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；ZnSO4處理將幼苗置于浸滿100μMZnSO4水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；CoCl2處理將幼苗置于浸滿ΙΟΟμΜCoCl2水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；CdCl2處理將幼苗置于浸滿50μMCdCl2水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；PbSO4處理將幼苗置于浸滿20μMPbSO4水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；AlCl3處理將幼苗置于浸滿50μMAlCl3水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；對(duì)照處理將幼苗置于浸滿去離子水的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理6h。處理完畢后，分別收集未處理和不同處理后的擬南芥幼苗的根和地上部分，將其在液氮中速凍，用于隨后的GUS活性測(cè)定。2、⑶S活性測(cè)定同實(shí)施例4的步驟2。幼苗在各種金屬離子存在的條件下根中的⑶S活性變化見(jiàn)圖4。對(duì)照處理中，⑶S活性沒(méi)有顯著提高。Pb2+處理后⑶S活性提高的倍數(shù)最高(10.38倍)。之后，依次為Al3+和Zn2+處理，經(jīng)24h的誘導(dǎo)后GUS活性分別提高了8.24倍和8.06倍。Cu2+誘導(dǎo)后，GUS活性也有6.64倍的提高。Cd2+處理后，⑶S活性只提高了2.07倍。Co2+處理后，⑶S活性與對(duì)照組相比，沒(méi)有顯著性的差異(P>0.05)，說(shuō)明啟動(dòng)子在擬南芥根中對(duì)Co2+不響應(yīng)。與對(duì)照組相比，各種處理后擬南芥的地上部分的⑶S活性未出現(xiàn)顯著性差異。以上結(jié)果說(shuō)明，該啟動(dòng)子對(duì)各種金屬離子的響應(yīng)是根特異的。實(shí)施例6、啟動(dòng)子對(duì)各種濃度的金屬離子的響應(yīng)情況將實(shí)施例2得到的轉(zhuǎn)基因植株的T2代和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照的T2代分別進(jìn)行各種濃度金屬離子處理，然后進(jìn)行⑶S活性測(cè)定，以確定其誘導(dǎo)表達(dá)特性。1、進(jìn)行各種濃度金屬離子處理擬南芥種子經(jīng)表面消毒后，鋪在l/2MS(pH5.8，1.5%蔗糖，0.75%瓊脂)平板上，經(jīng)過(guò)4°C春化2天后，置于22°C培養(yǎng)箱中，光照16h，黑暗8h培養(yǎng)。將V2MS平板上生長(zhǎng)10天的幼苗收集，用去離子水清洗2次后，分成13組，分別進(jìn)行如下處理CuSO4高濃度處理將幼苗置于浸滿200μMCuSO4水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；CuSO4中濃度處理將幼苗置于浸滿100μMCuSO4水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；CuSO4低濃度處理將幼苗置于浸滿50μMCuSO4水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；ZnSO4高濃度處理將幼苗置于浸滿200μMZnSO4水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；ZnSO4中濃度處理將幼苗置于浸滿100μMZnSO4水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；ZnSO4低濃度處理將幼苗置于浸滿50μMZnSO4水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；PbSO4高濃度處理將幼苗置于浸滿50μMPbSO4水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；PbSO4中濃度處理將幼苗置于浸滿20μMPbSO4水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；PbSO4低濃度處理將幼苗置于浸滿10μMPbSO4水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；AlCl3高濃度處理將幼苗置于浸滿100μMAlCl3水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；AlCl3中濃度處理將幼苗置于浸滿50μMAlCl3水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；AlCl3低濃度處理將幼苗置于浸滿25μMAlCl3水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；對(duì)照處理將幼苗置于浸滿去離子水的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理6h。處理完畢后，分別收集處理前和不同處理后的擬南芥幼苗的根，將其在液氮中速凍，用于隨后的GUS活性測(cè)定。2、⑶S活性測(cè)定同實(shí)施例4的步驟2。幼苗在各種濃度金屬離子存在的條件下根中的⑶S活性變化見(jiàn)圖5。對(duì)照處理中，⑶S活性沒(méi)有顯著提高。隨著Cu2+濃度的提高，⑶S活性逐漸升高，至Cu2+達(dá)到100μM時(shí)，⑶S活性最高(為對(duì)照組的6.93倍)，但當(dāng)Cu2+濃度升高至200μM時(shí)，⑶S活性反而有所降低(為對(duì)照組的5.02倍)。在0-100μMZn2+處理時(shí)，⑶S活性逐漸升高，而在200μMZn2+處理時(shí)，GUS活性只有100μM處理時(shí)的84.6%。當(dāng)25μM禾口50μMAl3+處理后，GUS活性較對(duì)照組比有了顯著的升高，分別提高了5.25倍和8.59倍，而當(dāng)Al3+濃度達(dá)到100μM時(shí)，⑶S活性降低，只是對(duì)照組的6.37倍。在一定的Pb2+濃度范圍(0-50μΜ)內(nèi)，0sMT_I_4b啟動(dòng)子活性隨著Pb2+濃度的升高而逐漸升高。在高濃度金屬離子處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物根中GUS活性不升反降，推測(cè)可能是由于高濃度的金屬離子對(duì)細(xì)胞的毒害作用引起的?？偨Y(jié)以上結(jié)果，說(shuō)明對(duì)于不同的金屬離子誘導(dǎo)及不同的誘導(dǎo)濃度，0sMT-I-4b啟動(dòng)子的響應(yīng)程度不同。實(shí)施例7、啟動(dòng)子中的各個(gè)片段的功能驗(yàn)證為了深入研究0sMT-I_4b啟動(dòng)子活性的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制，并對(duì)該啟動(dòng)子中對(duì)特異金屬離子誘導(dǎo)的響應(yīng)區(qū)域和元件進(jìn)行定位，對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行了缺失分析。一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒B的構(gòu)建重組質(zhì)粒B:在出發(fā)載體的BamHI和SpeI酶切位點(diǎn)之間，用序列表的序列1所示的DNA片段的-1052/-1(-1052/-1；記為R2；序列表的序列1自5，端第679至1730位核苷酸所示的DNA片段)替換了原有的CaMV35S啟動(dòng)子。采用特異性引物對(duì)R2(R2-F/R1-R)代替特異性引物對(duì)R1，其它同實(shí)施例2的步驟一中重組質(zhì)粒A的構(gòu)建方法。R2-F5，~TTGGATCCAAATTGAATTCGTACAGC~3，(下劃線序列表示BamHI酶切位點(diǎn)；Rl-R:5，-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下劃線序列表示SpeI酶切位點(diǎn))。2、重組質(zhì)粒C的構(gòu)建重組質(zhì)粒C在出發(fā)載體的BamHI和SpeI酶切位點(diǎn)之間，用序列表的序列1所示的DNA片段的-914/-1(-914/-1；記為R3；序列表的序列1自5，端第817至1730位核苷酸所示的DNA片段)替換了原有的CaMV35S啟動(dòng)子。采用特異性引物對(duì)R3(R3-F/R1-R)代替特異性引物對(duì)R1，其它同實(shí)施例2的步驟一中重組質(zhì)粒A的構(gòu)建方法。R3-F5’~CTGGATCCATGATAAACTTAAGTTC~3’(下劃線序列表示BamHI酶切位點(diǎn))；Rl-R:5，-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下劃線序列表示SpeI酶切位點(diǎn))。3、重組質(zhì)粒D的構(gòu)建重組質(zhì)粒D在出發(fā)載體的BamHI和SpeI酶切位點(diǎn)之間，用序列表的序列1所示的DNA片段的-583/-1(-583/-1；記為R4；序列表的序列1自5，端第1148至1730位核苷酸所示的DNA片段)替換了原有的CaMV35S啟動(dòng)子。采用特異性引物對(duì)R4(R4-F/R1-R)代替特異性引物對(duì)R1，其它同實(shí)施例2的步驟一中重組質(zhì)粒A的構(gòu)建方法。R4-F5’-CAGGATCCAAACAGCTAAGAACTTT-3’(下劃線序列表示BamHI酶切位點(diǎn))；Rl-R:5，-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下劃線序列表示SpeI酶切位點(diǎn))。4、重組質(zhì)粒E的構(gòu)建重組質(zhì)粒E在出發(fā)載體的BamHI和SpeI酶切位點(diǎn)之間，用序列表的序列1所示的DNA片段的-142/-1(-142/-1；記為R5；序列表的序列1自5，端第1589至1730位核苷酸所示的DNA片段)替換了原有的CaMV35S啟動(dòng)子。采用特異性引物對(duì)R5(R5-F/R1-R)代替特異性引物對(duì)R1，其它同實(shí)施例2的步驟一中重組質(zhì)粒A的構(gòu)建方法。R5-F:5，-TTGGATCCAATTCCGCAGCTTCTT-3’(下劃線序列表示BamHI酶切位點(diǎn))；Rl-R:5，-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下劃線序列表示SpeI酶切位點(diǎn))。5、重組質(zhì)粒F的構(gòu)建①在R5片段中引入點(diǎn)突變重組質(zhì)粒F在出發(fā)載體的BamHI和SpeI酶切位點(diǎn)之間，用R5m片段(序列表的序列2)替換了原有的CaMV35S啟動(dòng)子。R5m片段R5片段中，-119至-116位(序列1自5’端第1612位核苷酸和第1615位核苷酸)的CuRE元件的核心序列GTAC被突變?yōu)門(mén)TCC，用于分析這個(gè)距離TATAbox最近的可能的CuRE元件在啟動(dòng)子活性調(diào)節(jié)中的作用。采用特異性引物對(duì)R5m(R5m-F/Rl-R)代替特異性引物對(duì)R1，其它同實(shí)施例2的步驟一中重組質(zhì)粒A的構(gòu)建方法。在R5片段中引入點(diǎn)突變是通過(guò)在PCR引物的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)引入突變而實(shí)現(xiàn)的。R5m-F:5，-TTGGATCCAATTCCGCAGCTTCTTCTCAAGGTtCCTA-3，；(下劃線序列表示BamHI酶切位點(diǎn)；雙下劃線序列表示引入的突變位點(diǎn)G—T，A—C)；Rl-R:5，-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下劃線序列表示SpeI酶切位點(diǎn))。二、轉(zhuǎn)基因植株的獲得同實(shí)施例2的步驟二。收獲轉(zhuǎn)基因植株的T2代種子。三、各個(gè)片段的啟動(dòng)活性比較將實(shí)施例2得到的轉(zhuǎn)基因植株的T2代和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照的T2代本實(shí)施例得到的各種轉(zhuǎn)基因植株的T2代分別正常培養(yǎng)，然后對(duì)10天齡幼苗進(jìn)行GUS活性測(cè)定。GUS活性測(cè)定同實(shí)施例4的步驟2。Rl片段、R2片段、R3片段、R4片段、R5片段和R5m片段及其⑶S活性測(cè)定結(jié)果如圖6所示。各個(gè)片段均具有不同程度的啟動(dòng)子活性。在轉(zhuǎn)基因幼苗的根中，GUS活性明顯高于地上部分。地上部分R1驅(qū)動(dòng)的⑶S活性最高(24.68pmolMU/min/mg蛋白)，然后隨著5，序列的不斷缺失，⑶S活性逐漸降低。在構(gòu)建R5m中，由于-119/-116位CuRE元件的突變，⑶S活性比其野生型形式R5中的⑶S活性下降了約26.4%。根R4片段(-583/-1)驅(qū)動(dòng)的⑶S活性最高，為225.96pmolMU/min/mg蛋白，略高于由全長(zhǎng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S活性(Rl，210.58pmolMU/min/mg蛋白)。當(dāng)啟動(dòng)子片段缺失到-142(R5)時(shí)，⑶S活性只有23.47pmolMU/min/mg蛋白，約為最高⑶S活性(R4)的10.4%。與R5相比，其突變形式R5m中，⑶S活性沒(méi)有顯著差異。上述結(jié)果說(shuō)明，0sMT-I-4b啟動(dòng)子中片段即可驅(qū)動(dòng)下游報(bào)告基因在擬南芥根中特異地大量表達(dá)，而在擬南芥的地上部分中大量表達(dá)，則需要全長(zhǎng)啟動(dòng)子片段的參與。四、各個(gè)片段對(duì)各種金屬離子響應(yīng)能力的比較將實(shí)施例2得到的轉(zhuǎn)基因植株的T2代和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照的T2代、本實(shí)施例得到的各種轉(zhuǎn)基因植株的T2代種子分別經(jīng)表面消毒后，鋪在l/2MS(pH5.8，1.5%蔗糖，0.75%瓊脂)平板上，經(jīng)過(guò)4°C春化2天后，置于22°C培養(yǎng)箱中，光照16h，黑暗8h培養(yǎng)。將1/2MS平板上生長(zhǎng)10天的幼苗收集，用去離子水清洗2次后，分成4組，分別進(jìn)行如下處理CuSO4處理將幼苗置于浸滿100μMCuSO4水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；PbSO4處理將幼苗置于浸滿50μMPbSO4水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；AlCl3處理將幼苗置于浸滿50μMAlCl3水溶液的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理24h；對(duì)照處理將幼苗置于浸滿去離子水的濾紙上，于培養(yǎng)箱中處理6h。處理完畢后，分別收集處理前和不同處理后的擬南芥幼苗的根和地上部分，將其在液氮中速凍，用于隨后的GUS活性測(cè)定。⑶S活性測(cè)定同實(shí)施例4的步驟2。與對(duì)照組相比，各種處理后擬南芥的地上部分的⑶S活性并未出現(xiàn)顯著性差異。根的⑶S活性測(cè)定結(jié)果如圖7所示。經(jīng)Cu2+誘導(dǎo)24h后(圖7A)全長(zhǎng)啟動(dòng)子片段(Rl，-1730/-1)驅(qū)動(dòng)的⑶S活性提高了6.93倍，這是在所有啟動(dòng)子缺失片段中，GUS活性提高倍數(shù)最高的；R2片段(-1052/-1)中，雖然啟動(dòng)子中缺失了2個(gè)MRE類似元件(-1542/-1536，-1370/-1364)禾口1個(gè)CuRE元件(-1498/-1495)，但它驅(qū)動(dòng)的活性經(jīng)相同誘導(dǎo)后仍有6.19倍的提高；在R3片段(-914/-1)中，啟動(dòng)子中5’側(cè)第2個(gè)和第3個(gè)CuRE元件進(jìn)一步發(fā)生缺失，Cu2+處理使其驅(qū)動(dòng)的⑶S基因表達(dá)提高了3.08倍，而在R4(-583/-l)構(gòu)建中，隨著兩個(gè)CuRE元件(-670/-667，-600/-597)的進(jìn)一步缺失，該片段對(duì)Cu2+誘導(dǎo)不響應(yīng)，誘導(dǎo)后⑶S活性只有誘導(dǎo)前⑶S活性的0.77倍；與R4片段類似，R5片段(-142/-1)也對(duì)Cu2+誘導(dǎo)不響應(yīng)。以上結(jié)果說(shuō)明，片段-1052/-583對(duì)于啟動(dòng)子響應(yīng)Cu2+誘導(dǎo)是必需的，這一片段中含有4個(gè)可能的CuRE元件，推測(cè)0sMT-I-4b啟動(dòng)子對(duì)Cu2+的響應(yīng)調(diào)控是由這些元件介導(dǎo)完成的。對(duì)Pb2+響應(yīng)程度(圖7B)最高的是全長(zhǎng)啟動(dòng)子片段(R1)，⑶S活性提高了10.38倍，之后隨著啟動(dòng)子片段的缺失，啟動(dòng)子對(duì)Pb2+誘導(dǎo)的響應(yīng)能力逐漸減弱；當(dāng)缺失至-142位(R5構(gòu)建)時(shí)，Pb2+處理后，⑶S活性只有2.01倍的提高；若R5片段中CuRE元件發(fā)生突變(R5m構(gòu)建)，經(jīng)Pb2+誘導(dǎo)后，⑶S活性只提高了1.51倍。這些結(jié)果說(shuō)明，0sMT_I_4b啟動(dòng)子對(duì)Pb2+處理的響應(yīng)需要全長(zhǎng)啟動(dòng)子中各個(gè)元件的參與。在Al3+處理時(shí)(圖7C):R2片段(-1052/-1)驅(qū)動(dòng)的⑶S活性在Al3+處理后提高了7.97倍，而R3構(gòu)建(-914/-1)中⑶S活性只有1.41倍的提高，說(shuō)明片段-1052/-914對(duì)于啟動(dòng)子響應(yīng)Al3+誘導(dǎo)是至關(guān)重要的，推測(cè)這一區(qū)域中含有的兩個(gè)CuRE元件(-1041/-1038,-1014/-1011)參與了這一響應(yīng)調(diào)控過(guò)程?？偨Y(jié)不同的金屬響應(yīng)元件(如CuRE，動(dòng)物MRE類似元件等)的組合介導(dǎo)了啟動(dòng)子對(duì)不同金屬離子的響應(yīng)；啟動(dòng)子中片段-583/-1就足以驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在模式植物根中的特異表達(dá)；0sMT-I-4b啟動(dòng)子中不同區(qū)域，由于含有不同的金屬響應(yīng)元件，從而負(fù)責(zé)對(duì)不同類型的金屬離子的響應(yīng)；0sMT-I-4b啟動(dòng)子中不同的區(qū)域，對(duì)金屬離子的響應(yīng)具有特異性，將各個(gè)片段與報(bào)告基因融合，有可能會(huì)成為一種新的生物發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，用于監(jiān)測(cè)環(huán)境中重金屬污染的水平。權(quán)利要求DNA片段，為如下1)至8)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’端第679至1730位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5’端第817至1730位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列1自5’端第1148至1730位核苷酸所示的DNA分子；5)序列表中序列1自5’端第1589至1730位核苷酸所示的DNA分子；6)序列表中序列2所示的DNA分子；7)在嚴(yán)格條件下與1)中6)中任一所述的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；8)與1)中6)中任一所述的DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。2.含有權(quán)利要求1所述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。3.如權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在pCAMBIA-1381的多克隆位點(diǎn)插入權(quán)利要求1所述DNA片段得到重組質(zhì)粒；所述重組載體優(yōu)選為用權(quán)利要求1所述DNA片段取代pCAMBIA-1381的BamHI和SpeI酶切識(shí)別位點(diǎn)間的小片段得到的重組質(zhì)粒。4.權(quán)利要求1所述DNA片段在啟動(dòng)植物中目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述目的基因表達(dá)為誘導(dǎo)表達(dá)和/或組織特異表達(dá)。6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述組織特異表達(dá)中的組織為根、花的柱頭、萼片、花絲中的至少一種。7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述誘導(dǎo)表達(dá)為脫落酸誘導(dǎo)表達(dá)、黑暗誘導(dǎo)表達(dá)、鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)、干旱誘導(dǎo)表達(dá)和傷誘導(dǎo)表達(dá)中的至少一種。8.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述誘導(dǎo)表達(dá)為Pb2+離子誘導(dǎo)表達(dá)、Al3+離子誘導(dǎo)表達(dá)、Zn2+離子誘導(dǎo)表達(dá)、Cu2+離子誘導(dǎo)表達(dá)和Cd2+離子誘導(dǎo)表達(dá)中的至少一種。9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述Pb2+離子來(lái)源于PbSO4，所述Al3+離子來(lái)源于AlCl3,所述Zn2+離子來(lái)源于ZnSO4,所述Cu2+離子來(lái)源于CuSO4,所述Cd2+離子來(lái)源于CdCl2；所述誘導(dǎo)表達(dá)為根特異性表達(dá)；所述植物為擬南芥，優(yōu)選哥倫比亞生態(tài)型擬南芥；所述目的基因?yàn)镚US基因。10.權(quán)利要求1所述DNA片段在植物育種中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種具有誘導(dǎo)和組織特異表達(dá)特性的啟動(dòng)子。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子為序列表的序列1所示的DNA分子或其部分片段。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子可作為金屬響應(yīng)的啟動(dòng)子，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物工程中，用于獲得對(duì)重金屬高度耐受的農(nóng)作物新品種，或用于培育可以大量累積重金屬的植物。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子可作為脅迫響應(yīng)的啟動(dòng)子，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物工程中，用于獲得對(duì)逆境耐受的農(nóng)作物新品種。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子可作為使目的蛋白在組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物工程中，用于獲得在根中特異啟動(dòng)目的基因表達(dá)的農(nóng)作物新品種。文檔編號(hào)C12N15/113GK101845437SQ201010152850公開(kāi)日2010年9月29日申請(qǐng)日期2010年4月19日優(yōu)先權(quán)日2010年4月19日發(fā)明者余世實(shí),劉進(jìn)元,王云,董春娟申請(qǐng)人:清華大學(xué)