專利名稱：血液基因組磁珠小提試劑盒及其提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是提供了一種血液基因組磁珠小提試劑盒及其提取方法，快速小量提取血液基因組DNA的試劑盒。

背景技術(shù)：
DNA作為遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象。提取基因組DNA是許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，為了進(jìn)行諸如基因組測(cè)序，Southern雜交(包括RFLP)、基因的PCR分離、構(gòu)建BAC文庫等常規(guī)操作試驗(yàn)中，獲得高分子量和高純度的基因組DNA是非常重要的前提。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的深入發(fā)展，在基因水平上對(duì)疾病進(jìn)行診斷已經(jīng)成為臨床診斷技術(shù)的一項(xiàng)基本技術(shù)手段。尤其是法醫(yī)學(xué)中的個(gè)體識(shí)別、親子鑒定等，對(duì)提取基因組DNA的完整性及純度要求會(huì)更高，因?yàn)槠浠蚪MDNA用量不高，開發(fā)出快速小量提取基因組DNA試劑盒，就可以達(dá)到快速檢測(cè)的目的。
由于血液取材方便可靠，因此上述研究通常是從血液中提取完整的基因組DNA。簡(jiǎn)單地說，基因組DNA提取有以下幾個(gè)原則1、保證提取的DNA具有一定的長(zhǎng)度；2、純化后不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的物質(zhì)；3、排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染；4、蛋白質(zhì)，多糖，脂類等降低到最低程度；5、排除其他核酸分子的污染。目前的血液基因組提取方法有傳統(tǒng)的苯酚氯仿抽提法、蛋白酶/SDS法、以及基于介質(zhì)的Silica吸附柱法和磁性微粒(磁珠)法等等。隨著商品化DNA提取試劑盒的使用，尤其針對(duì)小樣品量的基因組提取可以完全取替了傳統(tǒng)苯酚氯仿抽提的方法，而磁性微粒(磁珠)法以其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)正在被越來越多的人廣泛接受。
基于磁性微粒(磁珠)的DNA提取技術(shù)是利用親水性磁性微粒(磁珠)吸附樣品溶液中的DNA分子，在外加磁場(chǎng)作用下將吸附DNA的磁性微粒(磁珠)從樣品溶液中分離出來，經(jīng)適當(dāng)清洗后，加入適當(dāng)?shù)娜芤菏沟肈NA從磁性微粒上(磁珠)脫附即得到純凈的DNA?；诖判晕⒘?磁珠)的提取方法使得DNA提取過程大為簡(jiǎn)化，不僅可以在常規(guī)的試管中以手工方式進(jìn)行，也可以在96孔或382孔微孔板中以自動(dòng)化方式進(jìn)行，已經(jīng)在歐美國(guó)家獲得了廣泛的應(yīng)用。磁性微粒(磁珠)法DNA提取試劑盒以其操作簡(jiǎn)便快捷和省時(shí)省力的特點(diǎn)，將會(huì)成為目前分子生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的理想的輔助工具。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種血液基因組磁珠小提試劑盒及其提取方法，基于磁珠提取血液基因組DNA的試劑盒。特別針對(duì)小樣品量(50-200微升)的全血材料，無需對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理直接裂解全血細(xì)胞，通過細(xì)胞蛋白沉淀液去除大部分血紅蛋白及其它雜質(zhì)，再利用單分散磁性微球特異性吸附基因組DNA，僅需簡(jiǎn)單的漂洗步驟后，就可以將磁性微球上的基因組DNA洗脫下來。本試劑盒提取的基因組DNA產(chǎn)量高、純度好、片段完整，適合于PCR檢測(cè)、酶切反應(yīng)、核酸雜交等下游試驗(yàn)。
本發(fā)明的試劑盒包括細(xì)胞裂解液、RNA酶工作液、細(xì)胞蛋白沉淀液、磁珠、異丙醇、漂洗液、DNA洗脫液等七種組分，各組分內(nèi)容如下 細(xì)胞裂解液10-20mmol/L Tris(三羥甲基氨基甲烷)鹽，PH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合劑、50-100mmol/L Na鹽、質(zhì)量濃度2-4％的SDS(十二烷基硫酸鈉)和終濃度0.1-0.4mg/mL的蛋白酶K； RNA酶工作液為核糖核酸酶A，其終濃度10-20mg/mL； 細(xì)胞蛋白沉淀液5-8mol/L胍鹽、0.5-2mol/L Na鹽、1-3mol/LKAC(醋酸鉀)、4-6mol/L HAC(醋酸)，PH值5.0-6.0； 磁珠粒徑1-2μm的單分散磁性微球； 異丙醇分析純的異丙醇； 漂洗液10-20mmol/L Tris(三羥甲基氨基甲烷)，PH值8.0-9.0、100-200mmol/L Li鹽、1-4mmol/L螯合劑與無水乙醇按1∶3-5的體積比混合而成； DNA洗脫液10-20mmol/LTris(三羥甲基氨基甲烷)鹽，PH7.5-8.5。
本發(fā)明上述試劑盒的提取方法步驟如下 取添加抗凝劑的新鮮血液200μl，加細(xì)胞裂解液150-300μl，混勻，55-70℃、15min；加入5-15μl RNA酶工作液，25～35℃放置5-10min；加細(xì)胞蛋白沉淀液250-400μl，上下顛倒數(shù)次，離心12000r/min，3-5min，貼近溶液上表面小心吸取350-700μl上清，放到另一離心管中；依次加入10-20μl磁珠、200-400μl異丙醇，水平轉(zhuǎn)動(dòng)1～1.5min；磁分離25～35s，吸去上清，加漂洗液600-800μl，重懸磁珠核酸復(fù)合物，清洗2-3次；放在磁分離器上盡量吸去乙醇，室溫～37℃放置數(shù)分鐘，直至聞不到酒精氣味；加50-80μl DNA洗脫液，至離心管于55-65℃水浴鍋中5-10min，以完全洗脫基因組DNA；磁分離30-40s，小心吸取上清于另一離心管中，備用或-20℃儲(chǔ)存。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn) 本試劑盒操作簡(jiǎn)便、無需對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理直接裂解全血細(xì)胞、快速提取1h即可完成操作； 本試劑盒不使用苯酚氯仿等有機(jī)試劑，對(duì)操作人員無毒副作用； 本試劑盒提取的基因組DNA，在純度有保證的情況下，DNA產(chǎn)率更高、片段更完整。



圖1為兩種試劑盒提取DNA瓊脂糖電泳比較。

具體實(shí)施例方式 小鼠、人抗凝全血基因組DNA提取 實(shí)驗(yàn)材料采集新鮮的小鼠、人血液樣本1mL，添加適量的抗凝劑EDTA鉀鹽，充分混勻后，于4℃?zhèn)溆谩?br> 基因組DNA提取步驟取添加抗凝劑的新鮮血液200μl，加細(xì)胞裂解液200μl，混勻，58℃、15min；加入10μl RNA酶工作液，室溫放置5-10min；加細(xì)胞蛋白沉淀液350μl，上下顛倒數(shù)次，離心12000r/min，3min，貼近溶液上表面小心吸取350μl上清，放到另一離心管中；依次加入20μl磁珠、200μl異丙醇，水平轉(zhuǎn)動(dòng)1min；磁分離30s，吸去上清，加漂洗液750μl，重懸磁珠核酸復(fù)合物，清洗2次；放在磁分離器上盡量吸去乙醇，37℃放置數(shù)分鐘，直至聞不到酒精氣味；加50μl DNA洗脫液，至離心管于65℃水浴鍋中10min，以完全洗脫基因組DNA；磁分離30s，小心吸取上清于另一離心管中，備用或-20℃儲(chǔ)存。
試劑盒提取步驟 取抗凝全血100-250μl至1.5ml的EP管中，加入4倍體積的RBL Buffer，上下顛倒充分混合均勻，室溫孵育5min。(2)孵育結(jié)束后，3000rpm離心10min；棄上清，留取底部細(xì)胞團(tuán)塊(少量殘留的紅細(xì)胞不影響后續(xù)操作)。(3)加入50μl Pre-Lysis buffer用槍頭充分吹打松散，無可見細(xì)胞團(tuán)快(重要)。(4)加入600ul gDNA Extraction Buffer上下顛倒混合均勻，室溫放置10min，使溶液變?yōu)橥该鳡睿瑹o可見細(xì)胞團(tuán)快，必要時(shí)延長(zhǎng)孵育時(shí)間(重要)。(5)將上述溶液加入到離心柱中，13000rpm離心5min。(6)棄收集管中液體，向離心柱中加入500μl Washing Buffer(確認(rèn)已經(jīng)加入無水乙醇)，13000rpm離心1min。(7)重復(fù)步驟6一次。(8)取出內(nèi)套管，棄去外套管中液體，仍然套回內(nèi)套管，不加洗液，13000rpm空離2min。(9)將內(nèi)套管移入新的eppendorf管中，室溫靜置1min，使殘留乙醇揮發(fā)，在膜中央加入Elution Buffer 40-100μl，室溫靜置1min，12,000rpm離心2min，獲得基因組DNA。
結(jié)果分析 提取的基因組DNA產(chǎn)量及純度檢測(cè) 分別吸取200μl新采集的小鼠、人抗凝全血，使用本試劑盒和A公司試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取，得到的基因組DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)260nm及280nm的吸光度值，DNA純度用OD260nm/OD280nm比值來衡量(1.8-2.0)、DNA濃度(μg/mL)＝OD260nm*稀釋倍數(shù)*50、DNA產(chǎn)量＝DNA濃度*洗脫體積。
表1.兩種試劑盒提取DNA結(jié)果比較
從表1可以看出兩種試劑盒提取得到的基因組DNA純度上來說，都達(dá)到了一定的要求，OD260nm/OD280nm比值都在1.8-1.9之間，A公司試劑盒結(jié)果要略好一些，但本發(fā)明所得的DNA產(chǎn)量明顯提高，為A公司試劑盒DNA產(chǎn)量的1.5倍左右。
基因組DNA片段完整性檢測(cè) 分別取2μl提取的基因組DNA，于0.8％的瓊脂糖凝膠上100V電壓，電泳15min，用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相，如圖1所示。
從圖1可以看到，兩種試劑盒提取得到的基因組DNA片段都在23Kb以上，A公司試劑盒提取得到的基因組DNA片段大約30Kb左右，而本試劑盒提取得到的基因組DNA片段在50Kb以上。
權(quán)利要求
1.一種血液基因組磁珠小提試劑盒，試劑盒包括細(xì)胞裂解液、RNA酶工作液、細(xì)胞蛋白沉淀液、磁珠、異丙醇、漂洗液、DNA洗脫液七種組分
細(xì)胞裂解液10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽，PH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合劑、50-100mmol/L Na鹽、質(zhì)量濃度2-4％的十二烷基硫酸鈉和終濃度0.1-0.4mg/mL的蛋白酶K；
RNA酶工作液為核糖核酸酶A，其終濃度10-20mg/mL；
細(xì)胞蛋白沉淀液5-8mol/L胍鹽、0.5-2mol/LNa鹽、1-3mol/L醋酸鉀、4-6mol/L醋酸，PH值5.0-6.0；
磁珠粒徑1-2μm的單分散磁性微球；
異丙醇分析純的異丙醇；
漂洗液10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷，PH值8.0-9.0、100-200mmol/L Li鹽、1-4mmol/L螯合劑與無水乙醇按1∶3-5的體積比混合而成；
DNA洗脫液10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽，PH8.0。
2.一種權(quán)利要求1所述試劑盒的提取方法，其特征在于，工藝步驟為取添加抗凝劑的新鮮血液200μl，加細(xì)胞裂解液150-300μl，混勻，55-70℃、15min；加入5-15μl RNA酶工作液，25～35℃放置5-10min；加細(xì)胞蛋白沉淀液250-400μl，上下顛倒數(shù)次，離心12000r/min，3-5min，貼近溶液上表面小心吸取350-700μl上清，放到另一離心管中；依次加入10-20μl磁珠、200-400μl異丙醇，水平轉(zhuǎn)動(dòng)1～1.5min；磁分離25～35s，吸去上清，加漂洗液600-800μl，重懸磁珠核酸復(fù)合物，清洗2-3次；放在磁分離器上盡量吸去乙醇，室溫～37℃放置數(shù)分鐘，直至聞不到酒精氣味；加50-80μl DNA洗脫液，至離心管于55-65℃水浴鍋中5-10min，以完全洗脫基因組DNA；磁分離30-40s，小心吸取上清于另一離心管中，備用或-20℃儲(chǔ)存。
全文摘要
一種血液基因組磁珠小提試劑盒及其提取方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。試劑盒包括細(xì)胞裂解液、RNA酶工作液、細(xì)胞蛋白沉淀液、自研磁珠、異丙醇、漂洗液、DNA洗脫液七種組分。特別針對(duì)50-200微升小樣品量的全血材料，無需對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理直接裂解全血細(xì)胞，通過細(xì)胞蛋白沉淀液去除大部分血紅蛋白及其它雜質(zhì)，再利用單分散磁性微球特異性吸附基因組DNA，僅需簡(jiǎn)單的漂洗步驟后，就可以將磁性微球上的基因組DNA洗脫下來。本試劑盒提取的基因組DNA產(chǎn)量高、純度好、片段完整，適合于PCR檢測(cè)、酶切反應(yīng)、核酸雜交等下游試驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12P19/34GK101812444SQ201010153890
公開日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者陳丹, 陳海生, 張華英, 陳寶俊 申請(qǐng)人:北京博邁世紀(jì)生物技術(shù)有限公司