專利名稱：：基于磁珠提取細(xì)菌基因組試劑盒及其提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是提供了一種基于磁珠提取細(xì)菌基因組DNA的試劑盒及其提取方法。
背景技術(shù)：
：核酸是現(xiàn)代分子生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)研究中的重要課題。核酸不僅是基本的遺傳物質(zhì)，而且在蛋白質(zhì)的生物合成上也占重要位置，因而在生長、遺傳、變異等一系列重大生命現(xiàn)象中起決定性的作用。因此，無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究，還是進(jìn)行基因改造工程、蛋白質(zhì)工程，首先需要對核酸進(jìn)行分離與純化。從復(fù)雜生物樣品中分離純化核酸或者制備核酸模板是許多分子生物學(xué)技術(shù)中的關(guān)鍵步驟。由于樣品基質(zhì)中存在大量的細(xì)胞裂解產(chǎn)物如蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，它們可能抑制下游處理中使用的聚合酶和限制性內(nèi)切酶的活性，也可能導(dǎo)致目標(biāo)核酸的降解，因此，在進(jìn)行核酸測序、擴(kuò)增、雜交、酶切等操作之前都需要首先采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⒑怂釓幕旌衔镏蟹蛛x出來。常規(guī)的核酸提取方法涉及細(xì)胞裂解、有機(jī)溶劑萃取、沉淀和離心等步驟，傳統(tǒng)方法如苯酚氯仿抽提法、Silica管柱法、高鹽溶液法等。細(xì)菌基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交(包括RFLP)及PCR分離基因等，而隨著PCR及熒光定量PCR技術(shù)的迅速發(fā)展，一些食品致病菌(微生物)如金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、出血性大腸桿菌0157:H7、單增李斯特、沙門氏菌、阪崎腸肝菌等革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌的分子檢測得以快速、準(zhǔn)確的鑒定，也需要對其進(jìn)行基因組DNA的提取。目前，商品化核酸提取試劑盒的使用具有方便、快捷、無需有機(jī)溶劑酚仿抽提等優(yōu)點(diǎn)，大大的替代了傳統(tǒng)的核酸提取方法。尤其是新近發(fā)展起來的基于磁性微粒的提取方法使得核酸純化過程大為簡化，已經(jīng)在歐美國家獲得了廣泛的應(yīng)用?；诖判晕⒘５暮怂峒兓夹g(shù)是利用親水性磁性微粒吸附樣品溶液中的核酸分子，在外加磁場作用下將負(fù)載核酸的磁性微粒從樣品溶液中分離出來，經(jīng)適當(dāng)清洗后，加入適當(dāng)?shù)娜芤菏沟煤怂釓拇判晕⒘Ｉ厦摳郊吹玫郊兓怂帷：怂峒兓襟E不僅可以在常規(guī)的試管中以手工方式進(jìn)行，也可以在96孔或382孔微孔板中以自動(dòng)化方式進(jìn)行?；诖判晕⒘５暮怂岱蛛x純化試劑盒以其操作簡便快捷和省時(shí)省力的特點(diǎn)，成為目前分子生物學(xué)和基礎(chǔ)研究的理想的輔助工具。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種基于磁珠提取細(xì)菌基因組DNA的試劑盒及其提取方法，特別涉及葡萄球菌屬、鏈球菌屬等革蘭陽性細(xì)菌細(xì)胞壁難于裂解的困難，試劑盒中提供的高效溶菌酶工作液用于裂解革蘭陽性細(xì)菌細(xì)胞壁。通過菌體蛋白沉淀液去除大部分殘壁菌體及蛋白等雜質(zhì)，再利用單分散磁性微球特異性吸附基因組DNA;僅需簡單的漂洗步驟后，就可以將磁性微球上的基因組DNA洗脫下來。本發(fā)明的試劑盒包括溶菌酶工作液、細(xì)菌重懸裂解液、RNA酶工作液、菌體蛋白沉淀液、磁珠、異丙醇、漂洗液、DNA洗脫液等八種組分，各組分內(nèi)容如下溶菌酶工作液10-20mmol/LTris(三羥甲基氨基甲烷)鹽，PH值7.0-8.0、l-4mmol/L螯合劑、體積分?jǐn)?shù)0.8-1.2%Trition-X-100，溶菌酶的終濃度為20_30mg/mL；細(xì)菌重懸裂解液10-20mmol/LTris(三羥甲基氨基甲烷)鹽，PH值7.0-8.0、l-4mmol/L螯合劑、50-IOOmmol/LNa鹽、質(zhì)量濃度2_4%的SDS(十二烷基硫酸鈉)和終濃度0.1-0.4mg/mL的蛋白酶K；RNA酶工作液為核糖核酸酶A，其終濃度10-20mg/mL；菌體蛋白沉淀液5-8mol/L胍鹽、2_3mol/LNa鹽，PH值6.5-7.5；磁珠粒徑1-2μm的單分散磁性微球；異丙醇分析純的異丙醇；漂洗液10-20mmol/LTris鹽，PH值6.8-7.2、100-200mmol/LLi鹽、l_4mmol/L螯合劑與無水乙醇按13-5的體積比混合而成；DNA洗脫液10-20mmol/LTris(三羥甲基氨基甲烷)，PH7.5-8.5。本發(fā)明上述試劑盒的提取方法步驟如下提取步驟為將l_2mL供提取細(xì)菌培養(yǎng)液放入1.52.OmL離心管中，離心8000-10000r/min、3-5min，倒掉培養(yǎng)液并盡量吸凈；加溶菌酶工作液100-300μ1，渦流混勻室溫或37°C，10-30min；加細(xì)菌重懸裂解液150-250μ1，混勻，65_70°C、10-20min；力口RNA酶工作液5-15μ1混勻，室溫放置5-lOmin；加菌體蛋白沉淀液250-500μ1，上下顛倒數(shù)次，混勻，離心12000r/min，3-5min，貼上清表面吸取350-700μ1，放到另一離心管中；加入10-20μ1磁珠、200-400μ1異丙醇，水平轉(zhuǎn)動(dòng)l-2min；磁分離至完全清澈，吸去上清，加漂洗液600-800μ1，重懸磁珠核酸復(fù)合物，清洗2-3次；放在磁分離器上盡量吸去乙醇，2037°C放置數(shù)分鐘，直至聞不到酒精氣味；加50-80μ1DNA洗脫液，至離心管于55_65°C水浴鍋中5-lOmin，以完全洗脫基因組DNA；磁分離30_40s，吸取上清于另一離心管中，備用或-20°C儲(chǔ)存。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，試劑盒提取的基因組DNA產(chǎn)量高、純度好、片段完整，適合于PCR檢測、酶切反應(yīng)、核酸雜交及構(gòu)建文庫等下游試驗(yàn)。圖1為基因組DNA的PCR鑒定。圖2為兩種試劑盒提取DNA瓊脂糖電泳比較。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌基因組DNA提取實(shí)驗(yàn)材料為革蘭陽性致病菌金黃色葡萄球菌及乙型溶血性鏈球菌株，按照各自的生長習(xí)性，配制增菌培養(yǎng)基，36士1°C、搖菌16h?；蚪MDNA提取將l-2mL金黃色葡萄球菌及乙型溶血性鏈球菌培養(yǎng)液放入1.5mL離心管中，離心10000r/min、3min，倒掉培養(yǎng)液并盡量吸凈；加溶菌酶工作液200μ1，渦流混勻室溫或37°C，30min；加細(xì)菌重懸裂解液200μ1，混勻，70°C、IOmin；加RNA酶工作液10μ1混勻，室溫放置IOmin；加菌體蛋白沉淀液350μ1，上下顛倒數(shù)次，混勻，離心12000r/min，5min，貼上清表面吸取350μ1，放到另一離心管中；加入20μ1磁珠、200μ1異丙醇，水平轉(zhuǎn)動(dòng)Imin；磁分離至完全清澈，吸去上清，加漂洗液750μ1，重懸磁珠核酸復(fù)合物，清洗2次’放在磁分離器上盡量吸去乙醇，37°C放置數(shù)分鐘，直至聞不到酒精氣味；加50μ1DNA洗脫液，至離心管于65°C水浴鍋中l(wèi)Omin，以完全洗脫基因組DNA；磁分離30s，吸取上清于另一離心管中，備用或-20°C儲(chǔ)存。試劑盒提取步驟1、向1.5111壓？管中加入過夜培養(yǎng)細(xì)菌，13，000印111離心21^11;2、離心完畢后，丟棄上清液體，留取底部細(xì)胞團(tuán)塊(用移液器盡量移除多余的殘留液體)。用80μ1雙蒸水重懸細(xì)胞團(tuán)塊吹吸混勻至無可見團(tuán)塊(可用漩渦混合器劇烈震蕩)；3、向上述重懸細(xì)胞液中，力口入20μ1ProteinaseK(10mg/ml)禾口100μ1gDNALysisBuffer，輕彈離心管混合均勻，放置于58°C水浴中孵育30min，期間輕柔顛倒幾次EP管以助盡快裂解；4、裂解完全后取出離心管，加入400μ1gDNABindingBuffei^PlOylRnaseA(20mg/ml)，上下顛倒混合均勻，并室溫靜置5min(延長靜止時(shí)間可減少RNA污染，可延長至IOmin)；5、向步驟4產(chǎn)物中加入200μ1無水乙醇，顛倒混合均勻；6、13，OOOrpm室溫離心2min；7、吸取上清液轉(zhuǎn)入至吸附柱中(盡量不要吸入未完全消化的不溶物，以免堵塞離心柱)，13000rpm室溫離心30s，棄廢液；8、向吸附柱中加入500μ1的WashingBuffer(確保已加入無水乙醇)，13，OOOrpm室溫離心30s，棄收集管中廢液；9、重復(fù)步驟8一次，棄收集管中廢液；10、將吸附柱放回空收集管中，13，OOOrpm空離2min；11、取出吸附柱，放入新的1.5mlEP管中室溫靜置Imin使痕量乙醇完全揮發(fā)；12、向吸附柱的柱面加入30-100μ1的ElutionBuffer，室溫放置lmin，然后13，OOOrpm離心2min，所得液體即為基因組DNA。2結(jié)果分析基因組DNA的PCR鑒定以提取的基因組DNA為模板，分別使用特異性引物對金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因、乙型溶血性鏈球菌編碼M蛋白的emm基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別得到了687bp、1154bp的目的片段。提取的基因組DNA產(chǎn)量及純度檢測培養(yǎng)的ImL金黃色葡萄球菌及乙型溶血性鏈球菌液，分別使用本試劑盒和A公司試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取，得到的基因組DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測260nm及280nm的吸光度值，DNA純度用0D260nm/0D280nm比值來衡量(1.8-2.0)、DNA濃度(μg/mL)=0D260nm*稀釋倍數(shù)*50、DNA產(chǎn)量=DNA濃度*洗脫體積。表1.兩種試劑盒提取DNA結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從表1可以看出兩種試劑盒提取得到的基因組DNA純度上來說，都達(dá)到了一定的要求，0D260nm/0D280nm比值都在1.8-1.9之間，A公司試劑盒結(jié)果要略好一些，但本發(fā)明所得的DNA產(chǎn)量明顯提高，為A公司試劑盒DNA產(chǎn)量的1.5倍?；蚪MDNA片段完整性檢測分別取2μ1提取的基因組DNA，于0.8%的瓊脂糖凝膠上100V電壓，電泳15min，用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相，如圖1所示。從圖1可以看到，兩種試劑盒提取得到的基因組DNA片段都在23Kb以上，A公司試劑盒提取得到的基因組DNA片段大約30Kb左右，而本試劑盒提取得到的基因組DNA片段在50Kb以上。權(quán)利要求一種基于磁珠提取細(xì)菌基因組DNA的試劑盒，包括溶菌酶工作液、細(xì)菌重懸裂解液、RNA酶工作液、菌體蛋白沉淀液、磁珠、異丙醇、漂洗液、DNA洗脫液；溶菌酶工作液10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽，PH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合劑、體積分?jǐn)?shù)0.8-1.2％Trition-X-100，溶菌酶的終濃度為20-30mg/mL；細(xì)菌重懸裂解液10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽，PH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合劑、50-100mmol/LNa鹽、質(zhì)量濃度2-4％的十二烷基硫酸鈉和終濃度0.1-0.4mg/mL的蛋白酶K；RNA酶工作液為核糖核酸酶A，其終濃度10-20mg/mL；菌體蛋白沉淀液5-8mol/L胍鹽、2-3mol/LNa鹽，PH值6.5-7.5；磁珠粒徑1-2μm的單分散磁性微球；異丙醇分析純的異丙醇；漂洗液10-20mmol/LTris鹽，PH值6.8-7.2、100-200mmol/LLi鹽、1-4mmol/L螯合劑與無水乙醇按1∶3-5的體積比混合而成；DNA洗脫液10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷，PH7.5-8.5。2.—種權(quán)利要求1所述試劑盒的提取方法，其特征在于，提取步驟為將l_2mL供提取細(xì)菌培養(yǎng)液放入1.52.OmL離心管中，離心8000-10000r/min、3-5min，倒掉培養(yǎng)液并盡量吸凈；加溶菌酶工作液100-300μ1，渦流混勻，室溫37°C，10-30min；加細(xì)菌重懸裂解液150-250μ1，混勻，65-70°C、10-20min；加RNA酶工作液5_15μ1混勻，室溫放置5-10min；加菌體蛋白沉淀液250_500μ1，上下顛倒數(shù)次，混勻，離心12000r/min，3_5min，貼上清表面吸取350-700μ1，放到另一離心管中；加入10-20μ1磁珠、200-400μ1異丙醇，水平轉(zhuǎn)動(dòng)l_2min；磁分離至完全清澈，吸去上清，加漂洗液600-800μ1，重懸磁珠核酸復(fù)合物，清洗2-3次；放在磁分離器上盡量吸去乙醇，2037°C放置，直至聞不到酒精氣味；力口50-80μ1DNA洗脫液，至離心管于55-65°C水浴鍋中5-lOmin，以完全洗脫基因組DNA；磁分離30-40s，吸取上清于另一離心管中，備用或-20°C儲(chǔ)存。全文摘要一種基于磁珠提取細(xì)菌基因組試劑盒及其提取方法，屬于分子生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。試劑盒，包括溶菌酶工作液、細(xì)菌重懸裂解液、RNA酶工作液、菌體蛋白沉淀液、自研磁珠、異丙醇、漂洗液、DNA洗脫液。試劑盒中提供的高效溶菌酶工作液用于裂解革蘭陽性細(xì)菌細(xì)胞壁。通過菌體蛋白沉淀液去除大部分殘壁菌體及蛋白等雜質(zhì)，再利用單分散磁性微球特異性吸附基因組DNA，僅需簡單的漂洗步驟后，就可以將磁性微球上的基因組DNA洗脫下來。本試劑盒提取的基因組DNA產(chǎn)量高、純度好、片段完整，適合于PCR檢測、酶切反應(yīng)、核酸雜交及構(gòu)建文庫等下游試驗(yàn)。文檔編號(hào)C12R1/01GK101824450SQ20101015389公開日2010年9月8日申請日期2010年4月23日優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日發(fā)明者張華英,陳丹,陳寶俊,陳海生申請人:北京博邁世紀(jì)生物技術(shù)有限公司