專(zhuān)利名稱(chēng)：水體致突變性檢測(cè)的Ames實(shí)驗(yàn)微量波動(dòng)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水體致突變性檢測(cè)的Ames實(shí)驗(yàn)微量波動(dòng)法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
一般認(rèn)為，85 % -90 %的化學(xué)致癌物為致突變物。由于Ames試驗(yàn)的重現(xiàn)性好，預(yù)測(cè) 已經(jīng)在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)致癌作用的準(zhǔn)確性較高。因而，Ames試驗(yàn)作為任何致突變篩選計(jì) 劃中不可缺少的一部分。1976年Green [1]發(fā)明的波動(dòng)試驗(yàn)和傳統(tǒng)致畸變檢測(cè)Ames試驗(yàn)均以細(xì)菌回變作為 檢測(cè)終點(diǎn)，且在已知誘變劑的測(cè)試中，發(fā)現(xiàn)它能在更低的濃度下獲得陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果。后來(lái)， Gatehouse將波動(dòng)試驗(yàn)改良為微量法，這一創(chuàng)舉不僅大大減輕了工作量，而且進(jìn)一步提高了 波動(dòng)法的靈敏性。國(guó)內(nèi)有關(guān)于微量波動(dòng)法實(shí)驗(yàn)體系組氨酸濃度，細(xì)菌濃度，生物素濃度的報(bào) 道[2]。上述方法在鼠傷寒沙門(mén)氏菌不同菌株間無(wú)通用性，并且存在待測(cè)物處理繁瑣等問(wèn) 題。參考文獻(xiàn)1. Green, MHL, WJ M. Mutagen testing using trp+reversion in Escherichia coli.Mutat Res 38(3) :32，1976.2.胡長(zhǎng)燈，詹卓玲.微量波動(dòng)試驗(yàn)的影響因素及靈敏度研究.衛(wèi)生毒理學(xué)4 (2) 115-116，1990.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有微量波動(dòng)法檢測(cè)方法的不足，而提供一種通用于鼠傷 寒沙門(mén)氏菌不同菌株的測(cè)試體系，并使待測(cè)物處理變得簡(jiǎn)單的水體致突變性檢測(cè)的Ames 實(shí)驗(yàn)微量波動(dòng)法。本發(fā)明方法是在現(xiàn)有微量波動(dòng)法檢測(cè)方法基礎(chǔ)上的改進(jìn)。本發(fā)明方法闡述了 TA97、TA98、TA100, TA102系列菌株的最佳反應(yīng)條件。具體通過(guò)采用鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA98 菌株為測(cè)試菌株，二氨基芴為陽(yáng)性物，通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析體系中不同菌液濃度、不同S9濃 度，不同陽(yáng)性物濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了該方法的最佳反應(yīng)劑量，并通過(guò)對(duì)TA97，TA100, TA102菌株反應(yīng)情況分析，驗(yàn)證了反應(yīng)體系的通用性。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有微量波動(dòng)法檢測(cè)方法改進(jìn)點(diǎn)有如下幾個(gè)方面1、生長(zhǎng)培養(yǎng)液生物素0.8ug/ml，組氨酸0. 2ug/ul，葡萄糖16mg/ml，溶于 Vogel-Bonner 緩沖液。2、溴甲酚紫(BCP) 0. 15g溴甲酚紫溶于30ml Vogel-Bormer緩沖液，制得5ug/ml 的溴甲酚紫指示劑，微孔濾膜過(guò)濾除菌備用。3、反應(yīng)體系中細(xì)菌濃度10ul/ml，S9濃度為40ul/ml。4、采用待測(cè)物暴露細(xì)菌24小時(shí)，加入 色劑繼續(xù)培養(yǎng)48或72小時(shí)后觀察結(jié)果，即陽(yáng)性孔數(shù)。5、以濃度為橫坐標(biāo)，陽(yáng)性孔數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，采用常規(guī)的線性回歸分?jǐn)M合 直線，通過(guò)常規(guī)的線性方程的計(jì)算，以斜率為依據(jù)判定待測(cè)物致畸變強(qiáng)度，斜率越大，即相 對(duì)致突變能力越強(qiáng)。本發(fā)明的方法用于水質(zhì)及食品等的致突變性檢測(cè)，具有快速、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，有 良好的應(yīng)用前景。


圖1為不同劑量陽(yáng)性物反應(yīng)結(jié)果示意圖。圖2為不同反應(yīng)時(shí)間下反應(yīng)結(jié)果示意圖。圖3為不同菌濃度條件下反應(yīng)結(jié)果示意圖。具體實(shí)施方法1、菌株用鼠傷寒沙門(mén)氏菌M0LT0X標(biāo)準(zhǔn)菌株TA98，TA97，TA100, TA102,培養(yǎng)至菌濃度為 108。2、S9輔助因子混合液制備方法依照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)。3,10% S-9混合液(活化系統(tǒng))每10ml含無(wú)菌的0. 2mol/l磷酸鹽緩沖液(PH6. 4)6. 0ml, 1. 65mol/l氯化鉀溶液 0. 2ml,0. 4mol/l 氯化鎂溶液 0. 2ml,0. 05mol/l 葡萄糖-6-磷酸鹽溶液 1. 0ml,0. 025mol/l 輔酶-II溶液1. 6ml和大鼠肝勻漿液(S-9) 1. 0ml，混勻。4、溶液Vogel-Bonner緩沖液貯備液(50倍)磷酸氫鈉按16. 5g，檸檬酸10. 0g,磷酸氫二 鉀50. 0g，硫酸鎂1. 0g，加蒸餾水至100ml，溶解后滅菌。5、生長(zhǎng)培養(yǎng)液生物素0. 8ug/ml，組氨酸0. 2ug/ul，葡萄糖16mg/ml，溶于上述VB buffer。6、溴甲酚紫(BCP)0. 15g溴甲酚紫溶于30ml Vogel-Bormer緩沖液，制得5ug/ml的溴甲酚紫指示劑， 微孔濾膜過(guò)濾除菌備用。7、陽(yáng)性物二氨基芴。8、反應(yīng)體系中菌濃度10ul/ml，S9濃度為40ul/ml。9、將上述反應(yīng)體系分別用生長(zhǎng)培養(yǎng)液配置12ml體系，加到96孔板中，每個(gè)樣品的 每個(gè)濃度為48孔。37°孵育24h。然后每孔加入溴甲酚紫(BCP)20ul，繼續(xù)培養(yǎng)72h，觀察 陽(yáng)性孔數(shù)。10、孔內(nèi)培養(yǎng)物由紫色變?yōu)辄S色為陽(yáng)性，即為陽(yáng)性反應(yīng)，計(jì)算每種菌種每個(gè)濃度陽(yáng) 性孔數(shù)，以濃度為橫坐標(biāo)，陽(yáng)性孔數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，采用常規(guī)的線性回歸分?jǐn)M合直 線，通過(guò)常規(guī)線性方程的計(jì)算，以斜率為依據(jù)判定待測(cè)物致畸變強(qiáng)度。斜率越大，即相對(duì)致 突變能力越強(qiáng)。
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圖1顯示陽(yáng)性物濃度升高，陽(yáng)性結(jié)果孔數(shù)增多，這個(gè)現(xiàn)象在不同S9濃度下皆有一 致的結(jié)果，從三條直線的斜率得出我們的結(jié)論，斜率越高，致突變能力越強(qiáng)。圖2顯示采用待測(cè)物暴露細(xì)菌24小時(shí)之后，加入顯色劑繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后觀察 結(jié)果。對(duì)于不同的待測(cè)物依據(jù)time-course圖設(shè)置不同的反應(yīng)時(shí)間。圖3顯示不同菌濃度對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響，當(dāng)菌濃度取lOul/ml時(shí)，反應(yīng)結(jié)果比較 好，即便于區(qū)分不同陽(yáng)性物致突變強(qiáng)度情況。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，上述實(shí)驗(yàn)體系適合鼠傷寒沙門(mén)氏菌的TA97、TA98、TA100、TA102。
權(quán)利要求
一種水體致突變性檢測(cè)的Ames實(shí)驗(yàn)微量波動(dòng)法，在現(xiàn)有微量波動(dòng)法檢測(cè)方法基礎(chǔ)上改進(jìn)而成，其特征在于a.生長(zhǎng)培養(yǎng)液生物素0.8ug/ml，組氨酸0.2ug/ul，葡萄糖16mg/ml，溶于Vogel-Bonner緩沖液；b.溴甲酚紫(BCP)0.15g溴甲酚紫溶于30ml Vogel-Bonner緩沖液，制得5ug/ml的溴甲酚紫指示劑，微孔濾膜過(guò)濾除菌備用；c.反應(yīng)體系中細(xì)菌濃度10ul/ml，S9濃度為40ul/ml；d.采用待測(cè)物暴露細(xì)菌24小時(shí)，加入顯色劑繼續(xù)培養(yǎng)48或72小時(shí)后觀察結(jié)果，即陽(yáng)性孔數(shù)；e.以濃度為橫坐標(biāo)，陽(yáng)性孔數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，采用線性回歸分?jǐn)M合直線，通過(guò)線性方程的計(jì)算，以斜率為依據(jù)判定待測(cè)物致畸變強(qiáng)度，斜率越大，即相對(duì)致突變能力越強(qiáng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水體致突變性檢測(cè)的Ames實(shí)驗(yàn)微量波動(dòng)法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法是在現(xiàn)有微量波動(dòng)法檢測(cè)方法基礎(chǔ)上的改進(jìn)。本發(fā)明方法在TA97、TA98、TA100，TA102系列菌株的最佳反應(yīng)條件下，采用鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA98菌株為測(cè)試菌株，二氨基芴為陽(yáng)性物，通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析體系中不同菌液濃度、不同S9濃度，不同陽(yáng)性物濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了該方法的最佳反應(yīng)劑量，并通過(guò)對(duì)TA97，TA100，TA102菌株反應(yīng)情況分析，驗(yàn)證了反應(yīng)體系的通用性。本發(fā)明的方法用于水質(zhì)及食品等的致突變性檢測(cè)，具有快速、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101851659SQ20101015411
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者倪紅梅, 夭建華, 楊葉昆, 米其利, 胡明陽(yáng), 魏云林 申請(qǐng)人:云南煙草科學(xué)研究院