專利名稱：一種高效介導dc基因轉移的重組腺病毒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術和基因治療領域，具體為一種高效介導DC基因轉移的重組 腺病毒。
背景技術：
自1973年Steinman和Cohn首次報道樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)以來，人 們對DC的認識不斷深入。目前認為DC是人體內最重要，抗原遞呈能力最強，體內唯一能活 化靜息T淋巴細胞的抗原遞呈細胞，是機體免疫應答的始動者，它具有攝取、加工抗原，以 主要組織相容性復合物(MHC) I、II類肽復合物的形式遞呈抗原，促進T、B淋巴細胞增殖的 能力，在天然免疫和獲得性免疫中都發(fā)揮著極其重要的作用。研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與患者體內的T淋巴細胞功能缺陷有關，特別是晚期 腫瘤患者，其體內往往存在體液免疫和細胞免疫功能的普遍低下，且其低下程度與其臨床 分期密切相關。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，導致免疫功能低下的根本原因在于機體對成熟DC的功 能下調。體外實驗證實即使由晚期腫瘤患者體內分離出的淋巴細胞對多種外界刺激仍然保 持著很好的反應能力。因此，通過體外培養(yǎng)DC，制備DC瘤苗免疫荷瘤宿主，有望成為腫瘤的 理想療法?；蛐揎椕庖呒毎悄壳澳[瘤治療研究領域的熱點之一，其具體策略是通過基因 轉移技術將目的基因導入免疫細胞，然后將表達目的基因的免疫細胞輸入患者體內，從而 提高免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的識別或殺傷能力?；蛐揎桪C介導的腫瘤治療成為當今腫瘤 生物治療領域中備受關注的焦點之一。有效的基因治療依賴于外源基因高效、穩(wěn)定的表達。腫瘤抗原基因導入DC的方 法一般有兩大類一是以腺病毒、逆轉錄病毒、痘病毒和腺病毒相關病毒等為載體的病毒載 體方法；二是DNA脂質體復合物、磷酸鈣沉淀、電穿孔等非病毒載體方法。非病毒載體方法 轉染的優(yōu)勢在于插入片段大小不受限制；免疫原性低；生產簡便。其缺點是外源基因的轉 染效率一般很低。病毒載體介導方法，以其高轉染率和良好的靶向性成為腫瘤基因治療中 應用最廣泛的方法。利用病毒載體將帶有腫瘤抗原的編碼基因轉染DC制備的疫苗，由于可 以在DC細胞內加工和持續(xù)表達相應特異性抗原，誘導產生特異性抗腫瘤免疫應答而備受 關注。其中最常用的包括逆轉錄病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)和腺相關病毒 (adeno-associated virus, AAV)等載體。逆轉錄病毒可將轉染的基因整合到染色體上，因此可以保證轉基因的長期表達， 但這種整合是隨機的，可能導致細胞突變而誘發(fā)癌癥；逆轉錄病毒只感染分裂細胞；用逆 轉錄病毒載體介導外源基因轉染DC的效率只有10% 30%，因此，介導腫瘤基因治療存在 一定的局限性。在法國進行逆轉錄病毒為載體的人類基因治療臨床研究出現(xiàn)了誘發(fā)血液系 統(tǒng)惡性腫瘤的嚴重問題。腺病毒是眾多的病毒載體基因轉移方式中最常見的，其優(yōu)點在于安全，有效；腺 病毒可以通過上調DC細胞表面的MHC及共刺激分子表達來促進其成熟；插入的外源片段大
3小可達37kb ；腺病毒轉染后的DC可以保持正常的表型特征和功能；體內回輸在肝臟短暫停 留后移行到脾臟并持續(xù)表達外源基因，血清中不產生抗Ad抗體。美國Genzyme公司和麻省 總醫(yī)院MGH的學者也探索了腺病毒介導的gplOO基因轉染的小鼠骨髓來源DC的性質，并通 過小鼠體內實驗證明gplOO基因修飾的DC體內免疫后可誘導出gplOO特異性CTL。國內章 衛(wèi)平等也報道了腺病毒介導的GM-CSF基因修飾的DC與腫瘤細胞的融合疫苗體內免疫激活 效果的研究結果。腺病毒進入細胞主要由纖維頂球與細胞表面受體的相互作用所介導，所以傳統(tǒng)的 5型腺病毒對DC的感染效率比較低。因此，對其親嗜性的修飾對于基于DC的基因治療的發(fā) 展無疑起著重要作用。AdEasy腺病毒制備系統(tǒng)是實驗室普遍使用的腺病毒包裝系統(tǒng)，我們 基于此系統(tǒng)對5型腺病毒纖維基因進行修飾，將AdEasy-1載體中5型腺病毒的纖維頂球和 柄部替換為lip型腺病毒的相應部分。通過這種方法改構腺病毒，不僅可以提高重組腺病 毒對DC的感染效率，而且還可以實現(xiàn)纖維基因與目的基因在不同的載體同時進行操作。綜上所述，制備一種能夠高效感染DC的重組腺病毒，為腫瘤的基因治療提供一種 特異、高效的方法，具有重大的理論和現(xiàn)實意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是在于建立一種能夠高效介導DC基因轉移的腺病毒制備體系，為 基于DC的靶向基因治療提供一種新的策略。我們的發(fā)明是以腺病毒載體系統(tǒng)AdEasy為基礎，改造其骨架質粒AdEasy-1中的 纖維基因，將其中編碼5型腺病毒纖維基因桿部和頂球部的序列替換為lip型腺病毒的相 應序列。Adllp為B族腺病毒，其可以通過高效結合造血細胞表面⑶46分子而感染造血系 統(tǒng)來源細胞。帶有目的基因的穿梭質粒與骨架質粒AdEasy-1/Fllp重組最終制備的腺病毒 將含有Adllp的纖維頂球，具有Adllp的靶向性。選擇GFP作為報告基因觀察改造的腺病 毒載體(AdEasy-1/Fllp-GFP)對DC細胞的感染效率，同時還觀察了改構腺病毒對DC生物 學特性的影響。具體為1、構建攜帶嵌合基因的腺病毒載體本發(fā)明重組腺病毒能否高效感染DC細胞，關鍵在于該病毒與細胞表面受體的結 合能力。由于介導AdEasy-1型腺病毒進入細胞的表面受體為CAR，而DC細胞CAR表達較 低；介導Adllp型腺病毒進入細胞的表面受體為⑶46，DC細胞⑶46表達率非常高，達99% 以上。因此，我們將pAdEasy-1的纖維基因替換為Ad5型腺病毒纖維尾部與Adllp纖維桿 部和頂球部的嵌合基因，成功構建pAdEasy-l/Fl lp。2、pAdEasy-l/Fllp_GFP 質粒的構建及鑒定為驗證本發(fā)明重組腺病毒對DC的感染效率，我們選用綠色熒光蛋白作為示蹤蛋 白，構建攜帶GFP的pAdEasy-1/Fllp-GFP質粒。3、制備重組腺病毒 AdEasy-1/Fllp-GFP 重組腺病毒AdEasy-1/Fllp-GFP，攜帶GFP基因，方便觀察其對DC細胞的感染效率。4、對照重組腺病毒的制備；
為了評價AdEasy-1/Fllp-GFP對DC細胞的感染效率，我們制備了對照腺病毒，為 AdEasy-1/GFP。5、重組腺病毒AdEasy-1/Fllp-GFP對DC感染效率的檢測將AdEasy-1/Fllp-GFP和對照病毒AdEasy-1/GFP以不同感染滴度感染DC細胞， 24h后流式細胞術檢測綠色熒光蛋白GFP的表達。6、重組腺病毒AdEasy-1/Fllp-GFP對DC細胞表型的影響將重組腺病毒感染DC細胞24h后，流式細胞術檢測DC細胞表面分子的表達。7、重組腺病毒AdEasy-1/Fllp-GFP對DC細胞凋亡的影響本發(fā)明采用Armexin V_PE或PI染色法，利用流式細胞術檢測DC細胞凋亡與死亡。8、重組腺病毒AdEasy-1/Fllp-GFP對混合淋巴細胞反應中DC對T細胞的刺激作 用的影響本發(fā)明利用尼龍棉柱法分離人外周血⑶3+細胞。采用3H_TdR摻入法檢測混合淋 巴細胞反應。本發(fā)明的創(chuàng)新點在于對5型腺病毒的纖維頂球進行改造，使之能夠高效感染DC細 胞，操作簡單。


附圖lpAdEasy-1/Fllp的構建示意圖 PCR擴增合成嵌合基因中Agel和Mfel位點之間的DNA序列，替換pFiber5中Agel 與Mf el之間編碼AdEasy-1纖維基因的片段，得到含有嵌合基因的新質粒pAdEasy-l/Fl lp。附圖2骨架質粒pAdEasy-l/F lip的酶切鑒定M為A /HindiII Marker ； 1_6為不同克隆的Xbal I和Hindlll雙酶切產物。骨 架質粒全長為8872bp，酶切產物長度為2399bp和6463bp，其中克隆5為非目的克隆。附圖3AdEasy-l/Fllp_GFP的構建示意圖1表示pShuttle-cmv經Pmel酶切，并電轉BJ5183感受態(tài)細胞，與AdEasy-1/ Fllp-GFP 同源重組，得到 AdEasy-1/Fllp-GFP ；2 表示 AdEasy-1/Fllp-GFP 經 PacI 酶切線 性化；3表示線性化AdEasy-1/Fllp-GFP轉染HEK293細胞，包裝產生重組腺病毒。附圖4重組腺病毒AdEasy-1/Fllp-GFP的鑒定采用PCR法鑒定；1、質粒AdEasy-1/Fllp為模板擴增Adllp纖維基因陽性對照； 2、AdEasy-1/Fllp-GFP基因組DNA為模板擴增Adllp纖維基因；3、AdEasy-1/GFP基因組 DNA為模板擴增Adllp纖維基因；4、質粒AdEasy-1為模板擴增Ad5纖維基因陽性對照；5、 AdEasy-1/GFP基因組DNA為模板擴增Ad5纖維基因；6、AdEasy-l/Fllp_GFP基因組DNA為模 板擴增Ad5纖維基因；7、AdEasy-l/GFP基因組DNA為模板擴增GFP ；8、AdEasy-l/Fllp_GFP 基因組DNA為模板擴增GFP ；M、DL2000Marker附圖5經GM-CSF和IL-4誘導的成熟DC細胞附圖6重組腺病毒Ad5_GFP和Ad5Fllp-GFP對DC感染效率的檢測重組腺病毒感染DC細胞后，流式細胞術檢測GFP蛋白的表達情況。橫坐標代表重 組腺病毒的不同感染滴度，縱坐標代表GFP+細胞的比例。1代表0M0I，2代表50M0I感染， 3代表100M0I感染，4代表200M0I感染，5代表300M0I感染，6代表400M0I感染。
附圖7DC細胞表面⑶46表達情況流式檢測結果附圖8重組腺病毒對DC細胞表型的影響利用流式細胞術檢測重組腺病毒AdEasy-1/Fllp-GFP感染后DC細胞表面標志的 改變。Con代表對照組；G200M代表AdEasy_l/GFP200M0I感染細胞；P200M代表AdEasy-1/ Fllp-GFP 200M0I感染細胞。1代表⑶14，2代表⑶80，3代表⑶86，4代表HLA-DR，5代表 CDla，6 代表 CD83。附圖9重組腺病毒對DC細胞凋亡的影響通過Armexin V_PE或PI染色法，利用流式細胞術檢測DC細胞凋亡與死亡。Con 代表對照組；G200M 代表 AdEasy-l/GFP 200M0I 感染細胞；P200M 代表 AdEasy-l/Fl lp-GFP 200M0I感染細胞。1代表Annexin V，2代表PI。附圖10重組腺病毒對混合淋巴細胞反應中DC對T細胞的刺激作用的影響采用3H_TdR摻入法檢測混合淋巴細胞反應。Con代表對照組；G200M代表 AdEasy-l/GFP 200M0I 感染細胞；P200M 代表 AdEasy-l/Fllp-GFP 200M0I 感染細胞。橫坐 標代表DC與同種異體T細胞的比例，縱坐標代表每分鐘脈沖值(CPM值)。
具體實施例方式實施例1經纖維基因改造的骨架質粒AdEasy-1/Fllp的構建采用EcoRI酶切AdEasy-1骨架質粒，得到大片段和小片段，小片段環(huán)化形成 質粒pFiber5。PCR方式人工合成分F llp，取代pFiber5中的部分序列，得到重組質粒 pFiber5/llp。EcoRI線性化pFiber5/llp后，與EcoRI酶切AdEasy-1得到的大片段連接， 得到改造的骨架質粒AdEasy-l/Fllp(如附圖1所示)。具體為(l)pFiber5 質粒的構建限制性內切酶EcoRI酶切pAdEasy-1，得到長度分別為23825bp和9625bp的兩個 片段。其中小片段(9625bp)序列中包含纖維基因、AdEasy-1左臂同源區(qū)、pBR322復制起始 區(qū)和氨芐抗性基因的開放讀碼框，將其自連制備成小質粒，經酶切鑒定正確，該質粒命名為 pFiber5。(2)Flip相關序列的合成根據(jù)GeneBank中Adllp-fiber的基因序列(GI =33465830)自行設計的22條引物， 見序列表序列1 序列22，采用重疊延伸PCR方法，人工合成flip基因序列。具體為第 一輪分別擴增得到222bp，255bp，122bp，127bp，121bp和288bp，共6條條帶；第二輪將1 3號產物合成得到527bp條帶，將4 6號產物合成得到443bp條帶；第三輪最終得到全長 F lip序列，其大小為984bp。Flip的全序列見序列表序列23。(3)質粒 pFiber5/llp 的構建將合成的F1 lp的DNA序列，經酶切連接替換pFiber5中的部分序列。具體為AgeI 和Mfel雙酶切pFiber5質粒，回收大片段，并將其與Flip片段連接得到目的質粒，經酶切、 PCR和測序鑒定正確，將該質粒命名為pFiber5/llp。該質粒的全序列見序列表序列24。(4)經纖維基因改造的骨架質粒AdEasy-1/Fllp的構建用EcoRI酶切pFiber5/llp，去磷酸化，與AdEasy-1的長度為23825bp片段相連， 經氨芐青霉素篩選得到骨架質粒AdEasy-1/Fllp。經酶切鑒定正確(如附圖2所示)。
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實施例2穿梭質粒pShuttle-cmv-GFP的構建其方法是以pEGFP-Cl質粒為模板，擴增得到GFP基因，將其通過酶切、連接的方法 克隆到穿梭質粒pShuttle-cmv上。具體為(1)目的基因GFP的擴增根據(jù)pEGFP-Cl 的序列(B. D. Clontech, Palo Alto, CA, USA)設計引物，見序列表 序列25 序列26。以pEGFP-Cl為模板，PCR擴增得到GFP基因。(2)pShuttle-cmv_GFP 的構建Bglll和EcoRV分別酶切穿梭質粒pShuttle-cmv和目的基因GFP，連接，并采用 Kana+篩選得到攜帶GFP的穿梭質粒pShuttle-cmv-GFP，經酶切、PCR和測序鑒定正確。實施例3重組腺病毒Ad5Fl lp-GFP和Ad5_GFP的制備其方法是Pmel酶切穿梭質粒pshuttle-cmv-GFP，電轉BJ5183感受態(tài)細胞，與 Ad5Fllp或AdEasy-1同源重組獲得重組腺病毒質粒Ad5Fllp_GFP和Ad5_GFP(如附圖3所 示)。PacI酶切重組腺病毒質粒，并將其轉染HEK293細胞制備病毒。鑒定正確后，進行擴 增、純化和滴度測定(如附圖4所示)。(1)重組腺病毒質粒的產生將穿梭質粒pshuttle-cmv-GFP進行Pmel酶切，并去磷酸化，以“200Q，2. 5KV, 25 u F”的條件電擊轉化BJ5183-AdEasy-l (購自 Stratagene 公司)或者 BJ5183_AdEasy-l/ Flip感受態(tài)細胞(自行制備)同源重組，Kana+篩選得到腺病毒質粒AdEasy-1/Fllp-GFP和 AdEasy-l/GFP。PacI酶切鑒定正確后進行重組腺病毒的制備。(2)重組腺病毒的制備鑒定正確的重組腺病毒質粒pAdEasy-l/Fl lp-GFP和pAdEasy-1/GFP，經PacI酶切 和酚氯仿抽提純化，轉染包裝細胞HEK293(保藏號C12-7-14)，8天噬斑形成，lid細胞完全 病變。收集細胞及上清，反復凍溶3次后離心收集上清。制備得到的重組腺病毒能夠表達 GFP蛋白。(3)重組腺病毒的鑒定病毒上清感染HEK293細胞，48 72h出現(xiàn)細胞病變。收集細胞，熒光顯微鏡觀察 或者流式細胞儀檢測，可以觀察到綠色熒光蛋白的表達。以上結果表明我們成功制備了重 組腺病毒AdEasy-l/Fl lp-GFP及對照腺病毒AdEasy-1/GFP。(4)重組腺病毒的擴增、純化及滴度測定重組腺病毒感染HEK293細胞后進行病毒擴增，收集病變細胞。氯化銫密度梯度法 純化后于_80°C保存在含10%甘油的Hank’ s液中備用。用紫外分光光度計法和有限稀釋 法分別測定重組腺病毒AdEasy-1/GFP和AdEasy-1/Fllp-GFP的顆粒滴度(viral particle units permilliliter, vp/ml)，純度(0D260nm/280nm)禾口感染滴度(infection unitsper milliliter, IU/ml)，這些指標均符合實驗需要，結果見表1。表1重組腺病毒AdEasy-1/GFP和AdEasy-l/Fl lp-GFP滴度測定結果
權利要求
1. 一種用于DC高效基因轉移的重組腺病毒載體，其特征在于以AdEasy-I載體系統(tǒng)為 基礎，將AdEasy-I載體中編碼5型腺病毒纖維頂球和柄部的DNA序列替換為Ilp型腺病毒 的相應部分。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組腺病毒載體，其特征在于Flip具有序列表中序列23所 述的核苷酸序列。
3.根據(jù)權利要求1所述的重組腺病毒載體，其特征在于其包括序列表中序列24所述的 核苷酸序列。
4.根據(jù)權利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于該腺病毒載體的構建方法是將攜帶 目的基因的穿梭質粒和改構的腺病毒骨架質粒AdEasy-1/FllP在細菌內同源重組獲得重 組腺病毒質粒；PacI線性化后轉染到293細胞制備得到重組腺病毒。
5.一種重組腺病毒，其特征在于蛋白序列由權利要求1-4所述的腺病毒載體所編碼。
6.權利要求1-5任一項所述的重組腺病毒在DC生物治療中的應用。
全文摘要
一種高效介導DC基因轉移的重組腺病毒，該發(fā)明涉及生物技術和基因治療領域的一種高效介導DC基因轉移的重組腺病毒載體系統(tǒng)的建立(摘要附圖1)，及其對DC感染效率的驗證以及對DC生物學特性影響的檢測。該重組腺病毒可以高效感染DC細胞，進而介導示蹤基因GFP在DC細胞內高效表達；該重組腺病毒本身不會影響DC的細胞表型、細胞凋亡以及DC對T細胞的刺激活性。
文檔編號C12N15/861GK102002513SQ201010154620
公開日2011年4月6日 申請日期2010年4月26日 優(yōu)先權日2010年4月26日
發(fā)明者吳祖澤, 楊月峰, 王 華, 王立生, 胡澤斌, 魯茁壯 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所