專利名稱：：一種與植物器官脫落相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種與植物器官脫落相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：對作物收割的基礎(chǔ)是果實不脫落，因此器官脫落可以說是人類在農(nóng)業(yè)發(fā)展史上所利用的第一個性狀。盡管作物的器官脫落性狀經(jīng)過了幾千年的選擇，但在某些具體作物如部分品種的油菜和棉花中，還存在由于過早脫落引起產(chǎn)量損失的問題。與植物的脫落過程相關(guān)的自然因素有衰老、光、干旱等環(huán)境脅迫。植物激素乙烯和生長素在脫落過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。根據(jù)離區(qū)細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)，擬南芥花器官脫落過程可以分為四個階段離區(qū)的分化形成，脫落信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，下游細(xì)胞壁水解酶活性激活和細(xì)胞分離，以及最后的脫落后離區(qū)形成保護(hù)層。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種蛋白及其編碼基因。本發(fā)明的基因來源于擬南芥，序列長741bp，編碼一個含有247個氨基酸的蛋白序列，分子量為27KD。本發(fā)明所提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物器官脫落相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。所述蛋白的編碼基因為如下1)、2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。為了使上述(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得至|J。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。擴(kuò)增上述任一所述基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對為一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述蛋白在調(diào)節(jié)植物器官脫落中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述編碼基因在調(diào)節(jié)植物器官脫落中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥；所述器官為花。本發(fā)明的另一個目的是提供一種使植物器官脫落期延遲的方法。本發(fā)明所提供的使植物器官脫落期延遲的方法，包括如下步驟向宿主植物中導(dǎo)入上述任一所述編碼基因，得到器官脫落期延遲于所述宿主植物的重組植物。上述方法中，所述宿主植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥；所述器官為花。實驗證明，將本發(fā)明的編碼基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化導(dǎo)入擬南芥植株中后，轉(zhuǎn)基因擬南芥中本發(fā)明基因及蛋白超表達(dá)，該超表達(dá)非常明顯地抑制了擬南芥器官脫落。此外，通過對本發(fā)明基因的亞細(xì)胞定位，表明本發(fā)明基因通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁間水解酶活性控制植物器官脫落過程。本發(fā)明基因可以控制植物器官脫落進(jìn)程而不引起其他生理活動的改變，在作物遺傳育種和品質(zhì)改良中有非常廣泛的應(yīng)用前景。圖1為AtD0F4.7基因在野生型和兩個獨(dú)立的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平。圖2為超表達(dá)AtD0F4.7植物的花器官脫落推遲。圖3為AtD0F4.7抑制PGAZAT啟動子的活性。圖4為轉(zhuǎn)基因植株與對照植株表型。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、基因的制備及確認(rèn)與功能一、基因的制備及確認(rèn)M-MLV兩步法RT-PCR試劑盒購自TaKaRa，產(chǎn)品目錄號為D2639S。PMD-18T_easy載體購自TaKaRa，產(chǎn)品目錄號為D101A。用M-MLV兩步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR，以野生型擬南芥花器官為實驗材料，提取其組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>70°C水浴保溫5min，水上放置2min，離心，將管內(nèi)液體收集至管底。在冰上依次加入以下試劑5XRTBuffer5.0μ150U/μ1RNasin0.5μ11mraol/1dNTPs5.0μ1200U/1M-MLVRT1.0μ1Total25.0μ1混勻，離心，將管內(nèi)液體收集至管底，在GeneAmp9700PCR儀中，進(jìn)行如下反應(yīng)370C90min,95°C5min。反應(yīng)完成后取出2μ1用于PCR擴(kuò)增。以此cDNA為模板，以下述引物1和2(在引物序列中引入EcoRl和BstEII酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用pfu酶擴(kuò)增。引物序列如下上游CTGGAATTCATGATGACGTCATCCCATCAG(序列3)，引入EcoRI酶切位點(diǎn)，下游GCGGGTAACCTTAGAGCAGAGCATTATTATTAGCA(序列4)，引入BstEII酶切位點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增得到的片段為752bp。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加PolyA尾巴后連接到PMD-lST-easy載體上，將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，Amp抗性篩選，得到陽性重組菌；提取陽性重組菌的質(zhì)粒，測序驗證，測序結(jié)果如序列表中序列2所示，將序列2所示基因命名為AtD0F4.7，該基因編碼的蛋白如序列表中序列1所示。二、基因的功能(一)轉(zhuǎn)基因擬南芥的構(gòu)建pCAMBIA1391質(zhì)粒(張勇，付紹紅，張汝全，牛應(yīng)澤.甘藍(lán)型油菜PEPC基因保守序列的克隆和種子特異性ihpRNA表達(dá)載體的構(gòu)建.2008.分子植物育種.第6卷，第4期，第775-780頁)(pCambia,Austria)(由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)。農(nóng)桿菌菌株GV3101(HolstersΜ,SilvaB,VanVlietF,GenetelloC,DeBlockΜ,DhaeseP,DepickerA,InzD,EnglerG,VillarroelR,VanMontaguM,SchellJ(1980)ThefunctionalorganizationofthenopalineA.tumefaciensplasmidpTiC58.Plasmid3=212-230)(由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)。將實驗一中得到的陽性質(zhì)粒用EcoRI/BstEII雙酶切，回收基因片段；用EcoRI/BstEII雙酶切pCAMBIA1391載體，回收載體大片段；將回收的載體大片段與基因片段連接，得到重組載體，記作pCAMBIA1391-35s::AtD0F4.7。將pCAMBIA1391-35s::AtD0F4.7質(zhì)粒通過CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，通過抗生素Rif和Kan篩選，得到陽性克隆，將陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定的引物為序列3和序列4。結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為750bp。表明構(gòu)建的重組農(nóng)桿菌正確。將陽性重組農(nóng)桿菌，用flowerdip法轉(zhuǎn)化擬南芥，收取TO代種子；將TO代種子播種，在添加25mg/LHyg的MS培養(yǎng)基上篩選抗性苗，獲得Tl代種子。選取Hyg抗性31分離的株系繁殖并收獲T3種子，選取表達(dá)水平不同的兩個株系用于后續(xù)研究，并命名為S107和S109。以轉(zhuǎn)入空載體pCAMBIA1391的擬南芥為對照。(二)轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定以4周齡的S107、S109和轉(zhuǎn)入空載體pCAMBIA1391的擬南芥的花器官為材料，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以110稀釋cDNA為模板，分別以下列引物為探針，按Takara公司定量PCR試劑盒體系擴(kuò)增，檢測溶解峰和擴(kuò)增效率后，以Actin2基因為內(nèi)參基因，ΔACt算法計算AtD0F4.7在轉(zhuǎn)基因植株中的超表達(dá)水平ACTIN2上游5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，ACTIN2下游5，-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，D0F47上游CTCGTGAGCTTGTAAGAAACCA(序列5)D0F47下游GAGGCAAGGTTGAAGTTAGGAT(序列6)程序如下，94°C5min，94°C5min，94°C10s，63°C10s，72°C20s，40個循環(huán)，溶解檢測從72°C到94°C。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示AtD0F4.7基因在轉(zhuǎn)入空載體pCAMBIA1391的擬南芥的花器官中表達(dá)量很低，而在轉(zhuǎn)基因S107、S109中表達(dá)量非常高，表明AtD0F4.7基因在轉(zhuǎn)基因株系中超表達(dá)，構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因株系正確。(三)轉(zhuǎn)基因植株的表型分析由于在模式植物擬南芥中，只有一個器官，也就是花器官具有脫落性狀，所以本實驗對不同位置的花器官的脫落狀況進(jìn)行具體的分析。這里，為了便于描述，將以剛剛張開的花為第一位，按花序順序依次向下排序命名不同位置的花或果實，具體與文獻(xiàn)(ButenkoMA,PattersonSE,GriniΡΕ,StenvikG-E,AmundsenSS,MandalA,AalenRB(2003)INFLORESCENCEDEFICIENTINABSCISSIONControlsFloralOrganAbscissioninArabidopsisandIdentifiesaNovelFamilyofPutativeLigandsinPlants.PlantCell152296-2307)中所述一致。結(jié)果如圖2所示和圖4(圖2中，A表示轉(zhuǎn)入空載體的擬南芥的花器官脫落狀況，B表示超表達(dá)植株的花器官脫離狀況；2、4、6、…20表示不同花位的器官脫落情況)。結(jié)果顯示對照組的花器官在第8位基本脫落了，但是在S107和S109中花器官的脫落基本觀察不到，甚至直到角果變黃成熟干燥后，花器官都不會自然脫落，表明超表達(dá)植株中花器官脫落明顯推遲了。圖4顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥與對照擬南芥表型無差異，說明轉(zhuǎn)入本發(fā)明基因，不改變植物其它的生理過程(如形態(tài))。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果均一致。三、AtD0F4.7通過抑制離區(qū)細(xì)胞壁水解酶活性調(diào)節(jié)脫落為了尋找AtD0F4.7影響脫落過程的可能線索，本實驗檢測目前已知的大多數(shù)脫落相關(guān)基因在S107和S109兩超表達(dá)植株中的表達(dá)情況。結(jié)果，大多數(shù)的脫落相關(guān)基因的表達(dá)并不受AtD0F4.7超表達(dá)的影響，只有一個多聚半乳糖醛酸酶基因PGAZAT的表達(dá)受到明顯的抑制。PGAZAT基因是目前已知的唯一的在擬南芥花器官脫落過程中起作用的細(xì)胞壁水解酶類基因，AtD0F4.7基因超表達(dá)可能通過了抑制PGAZAT的表達(dá)從而提高了脫落的難度。為了進(jìn)一步明確AtD0F4.7基因的作用，本實驗利用懸浮細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄因子——啟動子作用快速檢測體系，檢測了AtD0F4.7基因過表達(dá)對PGAZAT表達(dá)的作用。在只轉(zhuǎn)入輔助菌株P(guān)19和作用因子35s::AtD0F4.7的對照中，檢測不到⑶S活性，當(dāng)同時轉(zhuǎn)入作用因子35s::AtD0F4.7和報告子PromoterPGAZAT:GUS時，GUS的活性約為僅轉(zhuǎn)入報告子PromoterPGAZAT⑶S樣品的1/3，這說明AtD0F4.7可以明顯的抑制PGAZAT的表達(dá)。而轉(zhuǎn)入作用因子35s::AtD0F4.7并不影響作為陽性對照的報告子35s:⑶S樣品中的⑶S活性(圖3)。這進(jìn)一步說明AtD0F4.7對PGAZAT的表達(dá)是以特異的方式進(jìn)行的。權(quán)利要求一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物器官脫落相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因為如下1)、2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。4.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物對，其特征在于所述引物中一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。6.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒。7.權(quán)利要求1所述蛋白和/或權(quán)利要求2或3所述編碼基因在調(diào)節(jié)植物器官脫落中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥；所述器官為花。9.一種使植物器官脫落期延遲的方法，包括如下步驟向宿主植物中導(dǎo)入權(quán)利要求2或3所述編碼基因，得到器官脫落期延遲于所述宿主植物的重組植物。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述宿主植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥；所述器官為花。全文摘要本發(fā)明涉及一種與植物器官脫落相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且編碼所述蛋白的由a)衍生的蛋白質(zhì)。該基因及其作用機(jī)制可以廣泛的應(yīng)用于作物改良過程，特別是棉花和油菜的品質(zhì)改良中。本發(fā)明基因可以控制植物器官脫落進(jìn)程而不引起其他生理活動的改變，在作物遺傳育種和品質(zhì)改良中有非常廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號C12N15/63GK101805400SQ201010155878公開日2010年8月18日申請日期2010年4月21日優(yōu)先權(quán)日2010年4月21日發(fā)明者張秀清,王學(xué)臣,魏鵬程申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)