專利名稱：一種基底、基因芯片及其制備方法以及檢測(cè)靶標(biāo)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基底、基因芯片及其制備方法以及檢測(cè) 靶標(biāo)的方法。
背景技術(shù)：
基因芯片技術(shù)是一種被廣泛應(yīng)用于研究基因表達(dá)，蛋白質(zhì)與基因序列相互作用以 及單核苷酸多態(tài)性的高通量的分析方法。在基因芯片的應(yīng)用過(guò)程中，檢測(cè)的靈敏度和選擇 性是兩個(gè)非常重要的考察參數(shù)，所以，制作一種理想的，具有高的固定化效率，并且不與反 應(yīng)體系中的其他物質(zhì)進(jìn)行非特異性反應(yīng)的芯片基底成為了基因芯片技術(shù)的關(guān)鍵?；蛐酒苫缀桶袠?biāo)探針組成?；状笾路譃閮深?、表面修飾有醛基、環(huán)氧基 或羧基等官能團(tuán)的二維(2D)平板基底；2、在2D平板基底上涂覆聚丙烯酰胺凝膠使其表面 具有三維(3D)結(jié)構(gòu)的3D基底。相對(duì)于2D基底，3D基底具有高的固定化效率，能提供較多 的反應(yīng)位點(diǎn)與靶標(biāo)反應(yīng)，這樣就大大提高了芯片的檢測(cè)靈敏度，但是涂覆凝膠依然存在反 應(yīng)點(diǎn)少，與靶標(biāo)探針結(jié)合不完全，生物相容性和可降解性不好的缺點(diǎn)。樹(shù)枝狀大分子是一種特殊的聚合物，它不像鏈狀高聚物那樣會(huì)發(fā)生卷曲，因此能 夠提供很多末端基團(tuán)用于功能化反應(yīng)。此外，這種樹(shù)枝狀的分子還具有比較好的生物相容 性。鑒于它的這種優(yōu)良的性質(zhì)，很多的研究工作者已經(jīng)利用它來(lái)修飾基底，制作3D的基因 芯片。這種大分子修飾的3D基底不僅具有很高的固定化效率，而且在后面的一系列反應(yīng)和 洗滌過(guò)程中性能穩(wěn)定。目前，對(duì)表面修飾有樹(shù)枝狀大分子的3D基因芯片的檢測(cè)主要依賴傳統(tǒng)的熒光分 子染料檢測(cè)方法，但是熒光染料檢測(cè)方法不僅光穩(wěn)定性差，還必須使用高精度的儀器，檢測(cè) 過(guò)程步驟復(fù)雜，不易控制。在不斷尋求創(chuàng)新方法的過(guò)程中，本領(lǐng)域人員發(fā)現(xiàn)，金屬、半導(dǎo)體以 及磁納米粒子具有比較特殊的性質(zhì)，能夠取代熒光染料而用于基因檢測(cè)。尤其是金屬納米 粒子的共振光散射檢測(cè)法靈敏度更高，甚至能夠檢測(cè)單分子識(shí)別反應(yīng)。Mirkin研究小組將 金納米粒子應(yīng)用于芯片上來(lái)檢測(cè)靶標(biāo)，文中用金標(biāo)記的靶標(biāo)探針來(lái)識(shí)別靶標(biāo)，再用基于無(wú) 電導(dǎo)的銀沉積步驟來(lái)提高共振光散射信號(hào)。這種方法能夠靈敏的檢測(cè)靶標(biāo)而不用聚合酶鏈 反應(yīng)(PCR)等靶標(biāo)放大技術(shù)。此外，這種基于金納米粒子共振光散射的基因芯片的信號(hào)提 取可以直接使用普通的白光掃描儀，因此，能夠節(jié)省很多經(jīng)費(fèi)，但是Mirkin只報(bào)道了金納 米粒子應(yīng)用于2D基底或涂覆凝膠的3D基底制備的芯片，應(yīng)用于樹(shù)枝狀大分子修飾的芯片 還未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有的生物芯片檢測(cè)靈敏度和識(shí)別度欠佳的缺 陷，提供一種靈敏度和識(shí)別度更高的基因芯片和檢測(cè)靶標(biāo)的方法。為了解決以上問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于生物芯片的基底，由聚酰胺-胺型樹(shù) 枝狀大分子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合在固體支持物上形成，所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64個(gè)氨基末端的樹(shù)枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚酰 胺_胺型樹(shù)枝狀大分子經(jīng)醛基活化。優(yōu)選的，所述固體支持物為玻片。優(yōu)選的，所述生物芯片為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、糖芯片或組織芯片。本發(fā)明還提供了一種基因芯片，包括表面通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合了聚酰胺-胺型樹(shù)枝 狀大分子的固體支持物，以及通過(guò)共價(jià)鍵固定在所述聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大分子上的靶標(biāo) 探針；所述靶標(biāo)探針含有能與靶標(biāo)雜交的序列；所述聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大分子為以乙二 胺為中心放射出64個(gè)氨基末端的樹(shù)枝狀大分子，分子量為14214 14220;所述聚酰胺-胺 型樹(shù)枝狀大分子經(jīng)醛基活化。
優(yōu)選的，所述固體支持物為玻片。優(yōu)選的，所述玻片為二氧化硅玻片或有機(jī)硅玻片。優(yōu)選的，所述靶標(biāo)探針為3' -NH2修飾的DNA探針或RNA探針。本發(fā)明還提供了所述基因芯片的制備方法，包括以下步驟步驟1 將表面醛基化的固體支持物浸泡于聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子溶液中 IOh 14h得到與聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大分子共價(jià)結(jié)合的固體支持物；步驟2 用pH值為7 7. 4的戊二醛溶液將所述與聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子共 價(jià)結(jié)合的固體支持物活化；步驟3 取靶標(biāo)探針在步驟2所得固體支持物上點(diǎn)樣，得到基因芯片。本發(fā)明還提供了利用所述基因芯片進(jìn)行靶標(biāo)檢測(cè)的方法，包括以下步驟步驟1 使半徑為IOnm 13nm金納米粒子與二硫鍵修飾檢測(cè)探針?lè)磻?yīng)，制備與檢 測(cè)探針耦合的金納米粒子，所述檢測(cè)探針與靶標(biāo)雜交；步驟2 使固定于權(quán)利要求4所述基因芯片上的靶標(biāo)探針與可能含靶標(biāo)的待測(cè)樣 品反應(yīng)，洗滌后使所述基因芯片與步驟1所制備的與檢測(cè)探針耦合的金納米粒子反應(yīng)，所 述靶標(biāo)探針不與檢測(cè)探針雜交；步驟3 取0. 05 0. 09mol/L的硝酸銀溶液與0. 02 0. 05mol/L的對(duì)苯二酚溶 液按體積比1 1.5 1混合后，與經(jīng)步驟2處理后的基因芯片在室溫下反應(yīng)，洗滌后檢測(cè) 共振光散射信號(hào)。優(yōu)選的，所述靶標(biāo)為DNA序列或RNA序列。本發(fā)明提供了一種用于生物芯片的基底，由聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子通過(guò)共價(jià) 鍵結(jié)合在固體支持物上形成，所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64 個(gè)氨基末端的樹(shù)枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子經(jīng) 醛基活化。該基底可以用于基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、糖芯片和組織芯片的制備。本發(fā)明還提 供了一種基因芯片，包括表面通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合了聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子的固體支持 物，以及通過(guò)共價(jià)鍵固定在所述聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大分子上的靶標(biāo)探針；所述靶標(biāo)探針 含有能與靶標(biāo)雜交的序列；所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64個(gè) 氨基末端的樹(shù)枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子經(jīng)醛 基活化。本發(fā)明提供的基因芯片，使用聚酰胺_胺樹(shù)枝狀大分子修飾玻片，并將靶標(biāo)探針通 過(guò)共價(jià)鍵固定在所述樹(shù)枝狀大分子上，由于所述聚酰胺_胺樹(shù)枝狀大分子具有64個(gè)氨基末 端，與現(xiàn)有技術(shù)相比增加了反應(yīng)點(diǎn)，這樣就能夠連接更多的相同的靶標(biāo)探針，增加了基因芯片的靈敏度；也可以同時(shí)連接不同的靶標(biāo)探針，以增加基因芯片的檢測(cè)通量。本發(fā)明還提供了一種基因芯片的制備方法，包括步驟1 將表面醛基化的玻片浸泡于聚酰胺-胺型樹(shù)枝 狀大分子溶液中IOh 14h得到與聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子共價(jià)結(jié)合的玻片；步驟2 用 PH值為7 7. 4的戊二醛溶液將所述與聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子共價(jià)結(jié)合的玻片活化； 步驟3 取靶標(biāo)探針在步驟2所得玻片上點(diǎn)樣，得到基因芯片。由于使用的是聚酰胺-胺型 樹(shù)枝狀大分子，所以具有多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)，與靶標(biāo)探針和玻片的反應(yīng)及固化速率都很高，降低了 反應(yīng)條件，不需要大型的復(fù)雜的設(shè)備，節(jié)約了成本。本發(fā)明還提供了一種利用基因芯片檢測(cè) 靶標(biāo)的方法，包括步驟1 使半徑為IOnm 13nm金納米粒子與二硫鍵修飾檢測(cè)探針?lè)磻?yīng)， 制備與檢測(cè)探針耦合的金納米粒子，所述檢測(cè)探針與靶標(biāo)雜交；步驟2 使固定于權(quán)利要求 4所述基因芯片上的靶標(biāo)探針與可能含靶標(biāo)的待測(cè)樣品反應(yīng)，洗滌后使所述基因芯片與步 驟1所制備的與檢測(cè)探針耦合的金納米粒子反應(yīng)，所述靶標(biāo)探針不與檢測(cè)探針雜交；步驟 3 取0. 05 0. 09mol/L的硝酸銀溶液與0. 02 0. 05mol/L的對(duì)苯二酚溶液按體積比1 1.5 1混合后，與經(jīng)步驟2處理后的基因芯片在室溫下反應(yīng)，洗滌后檢測(cè)共振光散射信號(hào)。 本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，用檢測(cè)探針耦合的金納米粒子做為靶標(biāo)的標(biāo)記物。如果靶標(biāo)探針 與靶標(biāo)不能完全配對(duì)，靶標(biāo)探針序列與靶標(biāo)序列中的錯(cuò)位堿基越多，金納米粒子的共振光 散射信號(hào)就越弱，因此通過(guò)共振光散射信號(hào)的強(qiáng)弱以及靶標(biāo)探針的序列就可以判斷靶標(biāo)的 序列，與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明提供的靶標(biāo)檢測(cè)方法提高了識(shí)別度。靈敏度和準(zhǔn)確性。


圖1示本發(fā)明所述基底的制備過(guò)程；a為玻片通過(guò)醛基共價(jià)結(jié)合聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大分子的過(guò)程，b為用硼氫化鈉 除去希夫堿的過(guò)程，c為聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子與戊二醛反應(yīng)的過(guò)程。GA為戊二醛、 PAMAM為聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子；圖2示用本發(fā)明所述基因芯片進(jìn)行靶標(biāo)檢測(cè)的過(guò)程，其中a為通過(guò)醛基共價(jià)結(jié)合 聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子的玻片，P為靶標(biāo)探針，τ為靶標(biāo)，G為檢測(cè)探針耦合的金納米粒 子；圖3示共振光散射信號(hào)與靶標(biāo)探針P1濃度的關(guān)系，白色對(duì)應(yīng)于未通過(guò)醛基共價(jià) 結(jié)合聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子的玻片制作的基因芯片，黑色對(duì)應(yīng)通過(guò)醛基共價(jià)結(jié)合聚酰 胺-胺型樹(shù)枝狀大分子的玻片制備的基因芯片；圖4示不同基底制備的基因芯片的信噪比、質(zhì)量因子對(duì)比，其中，共振光散射強(qiáng)度 在3X IO4 4X IO4之間的正方形點(diǎn)對(duì)應(yīng)使用修飾有聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子的基底制 備的基因芯片上各個(gè)檢測(cè)點(diǎn)的共振光散射信號(hào)，而IX IO4 2X IO4之間的圓形點(diǎn)是未使用 聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大分子修飾的基底制備的基因芯片上各個(gè)檢測(cè)點(diǎn)的共振光散射信號(hào)， 0 IXIO4之間的正方形點(diǎn)和圓點(diǎn)為背景的共振光散射信號(hào)；圖5示共振光散射信號(hào)與靶標(biāo)T濃度的關(guān)系，圖中正方形點(diǎn)對(duì)應(yīng)于未使用聚酰 胺_胺型樹(shù)枝狀大分子修飾的基底制備的基因芯片上的共振光散射信號(hào)，圓點(diǎn)對(duì)應(yīng)于使用 聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大分子修飾的基底制備的基因芯片上的共振光散射信號(hào)；圖6示未使用聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子修飾的基底制備的基因芯片檢測(cè)靶標(biāo)序 列結(jié)果，圖中橫坐標(biāo)為5 μ mol/L的不同靶標(biāo)探針，縱坐標(biāo)為共振光散射相對(duì)強(qiáng)度，即以完全匹配的靶標(biāo)探針P1的信號(hào)為基準(zhǔn)，其他靶標(biāo)探針的信號(hào)與P1信號(hào)的比值；圖7示使用醛基共價(jià)結(jié)合聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子修飾的基底制備的基因芯片 檢測(cè)靶標(biāo)序列結(jié)果，圖中橫坐標(biāo)為5 μ mol/L的不同靶標(biāo)探針，縱坐標(biāo)為共振光散射相對(duì)強(qiáng) 度，即以完全匹配的探針P1的信號(hào)為基準(zhǔn)，其他探針的信號(hào)與P1信號(hào)的比值。
具體實(shí)施例方式為了進(jìn)一步了解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述，但 是應(yīng)當(dāng)理解，這些描述只是為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)而不是對(duì)本發(fā)明專利要求的 限制。本發(fā)明提供了一種用于生物芯片的基底，由聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子通過(guò)共價(jià) 鍵結(jié)合在固體支持物上形成，所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64 個(gè)氨基末端的樹(shù)枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子 經(jīng)醛基活化。按照本發(fā)明，利用醛基修飾的玻片(2D基底)與聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子 通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，得到聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大分子修飾的玻片(3D基底)，再通過(guò)所述聚酰 胺_胺樹(shù)枝狀大分子表面的氨基末端醛基化即可用于制備基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、糖芯片、 組織芯片等生物芯片。本發(fā)明提供的用于生物芯片的基底利用樹(shù)枝狀大分子的多氨基末端 增加了反應(yīng)點(diǎn)，使生物芯片靈敏度提高。本發(fā)明提供了一種使用所述基底的基因芯片，包括表面通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合了聚酰 胺_胺型樹(shù)枝狀大分子的固體支持物，以及通過(guò)共價(jià)鍵固定在所述聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大 分子上的靶標(biāo)探針；所述靶標(biāo)探針含有能與靶標(biāo)雜交的序列；所述聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大 分子為以乙二胺為中心放射出64個(gè)氨基末端的樹(shù)枝狀大分子，分子量為14214 14220 ； 所述聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大分子經(jīng)醛基活化。按照本發(fā)明，玻片優(yōu)選為本領(lǐng)域人員熟知的二氧化硅玻璃片或有機(jī)硅半導(dǎo)體玻 片，本發(fā)明不做限定，所述玻片的表面預(yù)先經(jīng)過(guò)了醛基修飾。聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大分子優(yōu) 選以乙二胺為中心的含有64個(gè)氨基末端的第四代聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子(PAMAM)，而 所述64個(gè)氨基末端形成了一個(gè)近似的圓球狀，增加了玻片的表面積與反應(yīng)點(diǎn)，能夠結(jié)合更 多的靶標(biāo)探針，使制備的基因芯片靈敏度更高，檢測(cè)更準(zhǔn)確，所述PAMAM與玻片上醛基的個(gè) 數(shù)比為1 2 4。所述靶標(biāo)探針為10 12個(gè)核苷酸組成的基因序列，是靶標(biāo)一部分序列的 互補(bǔ)鏈，用于和靶標(biāo)結(jié)合。本發(fā)明優(yōu)選使用西格瑪(SIGMA)公司生產(chǎn)的分子量為14214. 17 的 PAMAMjl^S 64. 7°C，在 25°C下，密度為 0. 813g/mL。本發(fā)明還提供了一種基因芯片的制備方法，包括步驟1 將表面醛基化的固體支持物浸泡于聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子溶液中 IOh 14h得到與聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大分子共價(jià)結(jié)合的固體支持物；步驟2 用pH值為7 7. 4的戊二醛溶液將所述與聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子共 價(jià)結(jié)合的固體支持物活化；步驟3 取靶標(biāo)探針在步驟2所得固體支持物上點(diǎn)樣，得到基因芯片。按照本發(fā)明，將醛基修飾的玻片放入25mL 35mL的第四代PAMAM甲醇溶液中，第 四代PAMAM的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)優(yōu)選為0. 05% 0. 15%，在輕微攪拌下，PAMAM上的氨基末端會(huì)與 玻片上的醛基反應(yīng)，將PAMAM通過(guò)共價(jià)結(jié)合在醛基修飾的玻片上，室溫反應(yīng)IOh 14h后，用25mL 35mL甲醇洗滌2 3次，每次2min 3min，目的是用甲醇除去未反應(yīng)的PAMAM， 洗滌結(jié)束后用N2吹干所述通過(guò)醛基共價(jià)結(jié)合有PAMAM的玻片。PAMAM與玻片的共價(jià)結(jié)合 過(guò)程中，PAMAM上的氨基末端和玻片上的醛基反應(yīng)后，會(huì)生成希夫堿，而希夫堿中含有不穩(wěn) 定的亞胺鍵，容易水解，通過(guò)硼氫化鈉還原亞胺鍵會(huì)變?yōu)檩^穩(wěn)定的仲胺，按照本發(fā)明，將上 述通過(guò)醛基共價(jià)結(jié)合PAMAM的玻片浸泡在體積為25mL 35mL，濃度為8mmol/L 12mmol/ L硼氫化鈉(NaBH4)溶液中，還原所述希夫堿。然后，將通過(guò)醛基共價(jià)結(jié)合PAMAM的玻片放 入25mL 35mL的戊二醛溶液中反應(yīng)3h 5h，使PAMAM上的未與玻片表面上醛基反應(yīng)的 氨基波段與戊二醛反應(yīng)。所述戊二醛溶液優(yōu)選包括2wt % 5wt %的戊二醛和95wt % 98wt%的磷酸鹽緩沖溶液，所述磷酸鹽緩沖液優(yōu)選為含有40mmol/L 60mmol/L的磷酸鹽、 0. 10mol/L 0. 20mol/L的氯化鈉的PBS溶液，添加磷酸鹽緩沖液的目的在于保持整個(gè)戊二 醛溶液的PH值為7 7. 4。所述反應(yīng)結(jié)束后用25mL 35mL上述磷酸鹽緩沖溶液洗滌所述 玻片2 3次，每次2min 3min，再優(yōu)選使用Milli-Q超純水洗滌所述玻片2 3次，每次 2min 3min，所有洗滌步驟結(jié)束后，優(yōu)選使用離心干燥器將所述通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合PAMAM的 玻片離心干燥后得到3D基底，并將所述基底在3°C 4°C下保存待用?；椎闹苽溥^(guò)程如 圖1所示。3D基底制備完成后，將點(diǎn)樣緩沖液與靶標(biāo)探針混合得到靶標(biāo)探針溶液。本發(fā)明 提供的靶標(biāo)探針末端均有一個(gè)氨基修飾，目的是為了能和PAMAM上的醛基反應(yīng)，將靶標(biāo) 探針鏈接到基底上。所述點(diǎn)樣緩沖液包括40mmol/L 50mmol/L檸檬酸三鈉，0. 4mol/ L 0. 5mol/L的氯化鈉，lmol/L 2mol/L甜菜堿，0. 004wt% 0. 006wt%十二烷基磺酸 鈉。取10 μ L 20 μ L所述樣品溶液于樣品板中，用Smartarrayer48點(diǎn)樣系統(tǒng)，在3D基 底上點(diǎn)樣。將點(diǎn)好樣的基底放入恒濕箱中，在20 30°C下恒溫反應(yīng)至少10小時(shí)，再升溫 90°C 100°C，反應(yīng)IOmin 20min。使得靶標(biāo)探針上的氨基與醛基反應(yīng)，將靶標(biāo)探針連接 在3D芯片基底上，反應(yīng)結(jié)束后用25mL 35mL洗液洗滌2 3次每次2min 3min，再用 Milli-Q超純水洗滌2 3次每次2min 3min以除去未被固定的靶標(biāo)探針。所述洗液優(yōu) 選包括15mmol/L 17mmol/L檸檬酸三鈉緩沖溶液，0. 15mol/L 0. 16mol/L的氯化鈉， 0.01wt% 0.03wt%十二烷基磺酸鈉。洗滌結(jié)束后得到基因芯片。按照本發(fā)明首先恒溫 反應(yīng)是為了時(shí)靶標(biāo)探針能夠均勻的與3D基底均勻結(jié)合，而升溫反應(yīng)是為了防止基底表面 通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合的的靶標(biāo)探針自雜交而降低基因芯片的檢測(cè)靈敏度。按照本發(fā)明優(yōu)選將制 備好的基因芯片放入封閉溶液中，在25 30°C下反應(yīng)Ih 1. 5h，目的是為了除去基因芯 片表面未反應(yīng)的活性醛基。所述封閉溶液為40mmol/L 60mmol/L磷酸鹽、0. 15mol/L 0. 2mol/L 氯化鈉、0. lmol/L 0. 2mol/L 乙醇胺的 PBS 溶液，pH = 7 7. 4。本發(fā)明還提供了一種靶標(biāo)的檢測(cè)方法，包括步驟1 使半徑為IOnm 13nm金納米粒子與二硫鍵修飾檢測(cè)探針?lè)磻?yīng)，制備與檢測(cè)探針耦合的金納米粒子，所述檢測(cè)探針與 靶標(biāo)雜交；步驟2 使固定于權(quán)利要求4所述基因芯片上的靶標(biāo)探針與可能含靶標(biāo)的待測(cè)樣品反應(yīng)，洗滌后使所述基因芯片與步驟1所制備的與檢測(cè)探針耦合的金納米粒子反應(yīng)，所 述靶標(biāo)探針不與檢測(cè)探針雜交；步驟3 取0. 05 0. 09mol/L的硝酸銀溶液與0. 02 0. 05mol/L的對(duì)苯二酚溶液按體積比1 1.5 1混合后，與經(jīng)步驟2處理后的基因芯片在室溫下反應(yīng)，洗滌后檢測(cè)共振光散射信號(hào)。按照本發(fā)明，優(yōu)選使用“Turkevich-Frens”方法制備金納米粒子GNPs，即用檸檬 酸三鈉還原氯金酸制備的金納米粒子，所述金納米粒子的直徑優(yōu)選為IOnm 13nm。按照 本發(fā)明，檢測(cè)探針耦合的金納米粒子優(yōu)選為將檢測(cè)探針通過(guò)共價(jià)鍵與金納米粒子GNPs耦 合得到檢測(cè)探針耦合的金納米粒子，所述檢測(cè)探針優(yōu)選為二硫鍵修飾的探針(SP)。在本發(fā) 明中首先將體積為20 μ L 30 μ L、濃度為30 μ mol/L 40 μ mol/L的SP水溶液與體積優(yōu) 選為450 μ L 550 μ L、濃度優(yōu)選為4nmol/L 8nmol/L的GNPs溶液混合，靜置過(guò)夜；然后 加入450 μ L 550 μ L磷酸鹽緩沖溶液，得到第一混合溶液。所述磷酸鹽緩沖溶液的ρΗ值 為7. 0 7. 4。所述磷酸鹽緩沖溶液中優(yōu)選含8mmol/L 12mmol/L磷酸鹽、0. lmol/L 0. 5mol/L氯化鈉的PB S溶液。將所述第一混合溶液靜置1. 5h 2. 5h后優(yōu)選使用真空離 心濃縮儀將第一混合液溶液濃縮至120 μ L 180 μ L得到第一濃縮液。然后再以8000 10000轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速，10 20min的時(shí)間離心第一濃縮液2 3次，除去游離在第一濃縮 液中未與金納米粒子耦合的檢測(cè)探針，將離心濃縮后得到的檢測(cè)探針耦合的金納米粒子溶 于雜交緩沖液中并保持檢測(cè)探針耦合的金納米粒子最終濃度為4nmol/L 6nmol/L。所述 雜交緩沖液優(yōu)選包括50mmol/L 70mmol/L檸檬酸三鈉，0. 5mol/L 0. 7mol/L的氯化鈉， 0. 05wt% 0. 15襯％十二烷基磺酸鈉。所述檢測(cè)探針耦合的金納米粒子為靶標(biāo)檢測(cè)中靶標(biāo) 的標(biāo)記物，如果靶標(biāo)探針與靶標(biāo)不能完全配對(duì)，那么檢測(cè)探針就無(wú)法與靶標(biāo)雜交，就無(wú)法檢 測(cè)到金納米粒子的共振光散射信號(hào)，靶標(biāo)探針序列與靶標(biāo)序列中的錯(cuò)位堿基越多，共振光 散射信號(hào)就越弱，因此通過(guò)共振光散射信號(hào)的強(qiáng)弱以及靶標(biāo)探針的序列就可以判斷靶標(biāo)的 序列。利用預(yù)先制備好的基因芯片以及檢測(cè)探針耦合的金納米粒子就可以用來(lái)檢測(cè)靶 標(biāo)的基因序列，檢測(cè)分為兩個(gè)階段，第一階段為靶標(biāo)與基因芯片的雜交反應(yīng)，然后所述靶標(biāo) 再與檢測(cè)探針耦合的金納米粒子進(jìn)行雜交反應(yīng)得到金納米粒子標(biāo)記的連接有靶標(biāo)的基因 芯片，第二階段為用銀粒子沉積在所述檢測(cè)探針耦合的金納米粒子上的金納米粒子的表 面，擴(kuò)大金納米粒子的半徑，增強(qiáng)了共振光散射信號(hào)強(qiáng)度，從而提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確 性。按照本發(fā)明，靶標(biāo)探針為靶標(biāo)互補(bǔ)鏈的一部分，而與金納米粒子耦合的檢測(cè)探針 為靶標(biāo)互補(bǔ)鏈的另一部分，當(dāng)把靶標(biāo)與靶標(biāo)探針雜交后，再用檢測(cè)探針耦合的金納米粒子 與靶標(biāo)雜交，且靶標(biāo)探針不與檢測(cè)探針雜交，通過(guò)金納米粒子特有的共振光散射性質(zhì)，可以 通過(guò)檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)判斷互補(bǔ)鏈與靶標(biāo)是否完全匹配。具體雜交步驟為指將靶標(biāo)溶解在雜交緩沖液中得到靶標(biāo)溶液，取15 μ L 25 μ L 的靶標(biāo)溶液與在所述封閉溶液中封閉好的基因芯片在25°C 35°C下反應(yīng)25min 35min。 所述雜交緩沖液優(yōu)選包括60mmol/L 70mmol/L檸檬酸三鈉溶液，0. 6mol/L 0. 8mmol/L 的氯化鈉溶液，0. lwt% 0. 2襯％十二烷基磺酸鈉。洗滌反應(yīng)后的芯片，所述洗滌包括用上 述雜交緩沖液在30°C下洗滌2 3次，每次2min 3min，再用所述洗液在室溫下洗滌2 3次，每次2min 3min，最后用Milli-Q超純水洗滌2 3次，每次2min 3min，洗滌結(jié)束 后，再離心干燥Imin 2min，讓芯片與之前制備好的檢測(cè)探針耦合的金納米粒子在30°C下 反應(yīng)30min，再對(duì)芯片進(jìn)行以上洗滌和干燥過(guò)程過(guò)程。按照本發(fā)明在芯片與檢測(cè)探針耦合的金納米粒子反應(yīng)完之后，用銀增強(qiáng)溶液在室溫下反應(yīng)6min lOmin，用水洗滌所述銀增強(qiáng)處理后的基因芯片2 3次，每次2min 3min，離心干燥Imin 2min。所述銀增強(qiáng)溶液優(yōu)選為體積比為1 1. 5 1的硝酸銀溶液 和對(duì)苯二酚溶液。最后，用微陣列掃描儀(Arraylt Spotffare Colorimetric Microarray Scanner)掃描所述銀增強(qiáng)后的基因芯片，提取共振光散射信號(hào)(RLS)。本發(fā)明中討論所用 的RLS信號(hào)值都是扣除背景以后的信號(hào)值，通過(guò)RLS信號(hào)的強(qiáng)弱可以判斷靶標(biāo)探針和靶標(biāo) 的匹配度進(jìn)而推斷出靶標(biāo)的序列信息。以下用具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)闡述本發(fā)明的方案實(shí)施例1按照以下步驟來(lái)制備檢測(cè)探針耦合的金納米粒子用Turkevich-Frens法制備直徑為13nm金納米粒子。將體積為25 μ L、濃度為 40 μ mol/L的SP水溶液與500 μ L、6nmol/L的GNPs溶液混合，靜置過(guò)夜，然后加入500 μ L 磷酸鹽緩沖溶液，得到第一混合溶液。所述磷酸鹽緩沖溶液的PH為7. 4，且所述磷酸鹽緩 沖溶液為含有l(wèi)Ommol/L磷酸鹽、0. 2mol/L氯化鈉的PBS溶液。將所述第一混合溶液靜置 2h后優(yōu)選使用真空離心濃縮儀將溶液濃縮至150 μ L得到濃縮液。然后再以9000rad/min 的轉(zhuǎn)速離心濃縮液3次每次15min，將離心濃縮后得到的檢測(cè)探針耦合的金納米粒子溶于 60mmol/L檸檬酸三鈉，0. 6mol/L的氯化鈉，0. Iwt %十二烷基磺酸鈉組成的雜交緩沖液中 并保持檢測(cè)探針耦合的金納米粒子溶液的最終濃度為5nmol/L。實(shí)施例2按照以下方法來(lái)制作3D基底將醛基修飾的玻片放入30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. Iwt%的第四代的PAMAM甲醇溶液中， 在攪拌下，室溫反應(yīng)12h后，用30mL甲醇洗滌3次，每次3min，再用N2吹干。用30mL，IOmmol/ L的硼氫化鈉(NaBH4)溶液還原上述反應(yīng)中生成的希夫堿。然后，將修飾有樹(shù)枝狀分子的基 底放入30mL的戊二醛溶液中反應(yīng)4小時(shí)，所述戊二醛溶液優(yōu)選包括5wt%的戊二醛和95% 的磷酸鹽緩沖溶液，所述磷酸鹽緩沖液為含有50mmol/L磷酸鹽、0. 15mol/L的氯化鈉的PBS 溶液，PH值為7. 4。用30mL上述磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，每次3min，用Milli-Q超純水 洗滌3次，每次3min，離心干燥Imin后得到PAMAM修飾的3D基底，將該3D基底保存于4°C 下待用。其具體制作過(guò)程參看圖1。實(shí)施例3PAMAM修飾的3D基底制備的基因芯片的反應(yīng)效率實(shí)驗(yàn)首先，按照實(shí)施例1，實(shí)施例2的方法得到檢測(cè)探針耦合的金納米粒子和PAMAM修 飾的3D基底；其次，用45mmol/L檸檬酸三鈉緩沖液，0.45mol/L的氯化鈉，1. 5mol/L甜菜堿， 0. 005wt %十二烷基磺酸鈉組成的點(diǎn)樣緩沖液分別配制濃度為20 μ mol/L、5 μ mol/L、 500nmol/L、50nmol/L、5nmol/L 的探針 P1 溶液，P1 的序列如 SEQ ID No. 1 所示。取 15 μ L 樣 品于樣品板中，用Smartarrayer48點(diǎn)樣系統(tǒng)，在普通的2D芯片基底上和修飾有PAMAM的3D 基底上點(diǎn)樣。將點(diǎn)好樣的芯片放入恒溫恒溫箱中反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)條件為T = 25°C，相對(duì) 濕度90%，再在100°C下反應(yīng)15min ；接下來(lái)，用30mL洗液3次，每次3min，再用Milli-Q超 純水3次，每次3min。最后，將芯片放入封閉溶液中，在30°C下反應(yīng)1小時(shí)得到基因芯片。
將靶標(biāo)溶于雜交緩沖液中得到靶標(biāo)溶液，取20 μ L的靶標(biāo)溶液與在所述封閉溶液中封閉好的基因芯片在30°C下反應(yīng)20min。所述雜交緩沖液包括60mmol/L檸檬酸三鈉， 0. 6mol/L的氯化鈉，0. 十二烷基磺酸鈉。洗滌反應(yīng)后的芯片，所述洗滌包括用上述雜 交緩沖液在30°C下洗滌3次，每次3min，再用15mmol/L檸檬酸三鈉，0. 15mol/L的氯化鈉， 0. 0Iwt %十二烷基磺酸鈉組成的洗液在室溫下洗滌3次，每次3min，最后用Mi 11 i_Q超純水 洗滌3次，每次3min，洗滌結(jié)束后，再離心干燥lmin，讓芯片與之前制備好的檢測(cè)探針耦合 的金納米粒子在30°C下反應(yīng)30min，再對(duì)芯片進(jìn)行以上洗滌和干燥過(guò)程過(guò)程。按照本發(fā)明在芯片與檢測(cè)探針耦合的金納米粒子反應(yīng)完之后，用體積比為1 1 的濃度為0. 08mol/L的硝酸銀溶液和濃度為0. 04mol/L的對(duì)苯二酚溶液組成的銀增強(qiáng)溶 液在室溫下與檢測(cè)探針耦合的金納米粒子標(biāo)記的基因芯片反應(yīng)8min，用水洗滌所述銀增 強(qiáng)處理后的基因芯片3次，每次3min，離心干燥lmin。所述銀增強(qiáng)溶液為體積比為1 1 的硝酸銀溶液和對(duì)苯二酚溶液。最后，用微陣列掃描儀(ArrayltSpotWare Colorimetric Microarray Scanner)掃描所述銀增強(qiáng)后的基因芯片，提取共振光散射信號(hào)(RLS)。本發(fā)明 中討論所用的RLS信號(hào)值都是扣除背景以后的信號(hào)值。芯片上的具體反應(yīng)過(guò)程參看圖2。按照以上實(shí)驗(yàn)步驟，我們得到的結(jié)果如圖3所示。圖3是在2D和3D基底上，共振光散射信號(hào)隨著探針P1 (與靶標(biāo)完全匹配)濃度的 變化而變化的圖像以及相應(yīng)的數(shù)據(jù)提取圖其中，白色對(duì)應(yīng)于2D基底，黑色對(duì)應(yīng)于3D基底。 實(shí)驗(yàn)中用到的探針 P1 的濃度分別為 20ymol/L、5ymol/L、500nmol/L、50nmol/L、5nmol/L ； 靶標(biāo)T的濃度為lOOnmol/L，檢測(cè)探針耦合的金納米粒子的濃度為5nmol/L。當(dāng)P1濃度大 于50nmol/L時(shí)得到最佳的信噪比值(3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差)，且當(dāng)P1濃度在50nmol/L-5 μ mol/ L之間時(shí)，共振光散射信號(hào)隨著濃度的增加而增強(qiáng)并在5 μ mol/L時(shí)基本達(dá)到飽和值。而在 同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，2D基底制備的基因芯片上的信號(hào)則相對(duì)較弱。這個(gè)結(jié)果表明樹(shù)枝狀 分子修飾的3D基底制備的基因芯片相對(duì)于普通的2D基底制備的基因芯片具有較高的反應(yīng) 效率。實(shí)施例4PAMAM修飾的3D基底制備的基因芯片的性能首先，按照的實(shí)施例1和實(shí)施例2方法得到檢測(cè)探針耦合的金納米粒子和PAMAM 修飾的3D基底；用實(shí)施例3的方法進(jìn)行點(diǎn)樣、雜交反應(yīng)和檢測(cè)標(biāo)靶并做了大于50組的實(shí)驗(yàn)作為對(duì) 比，其中靶標(biāo)探針P1的濃度為5 μ mol/L。芯片上的具體反應(yīng)過(guò)程參看圖2。按照以上實(shí)驗(yàn)步驟，我們得到的結(jié)果參看圖4我們通過(guò)對(duì)2D(圓點(diǎn))和3D (正方 形)兩種基底制備的基因芯片上的50個(gè)點(diǎn)的共振光散射信號(hào)，以及背景提取噪音信號(hào)的考 察即共振光散射在0 10000之間的正方形點(diǎn)和圓形點(diǎn)，分別計(jì)算了兩種基底的信噪比S/ N和質(zhì)量因子V。實(shí)驗(yàn)中用到的探針P1的濃度為5 μ mol/L，靶標(biāo)T的濃度為lOOnmol/L，檢 測(cè)探針耦合的金納米粒子的濃度為5nmol/L。圖中我們考察了 50個(gè)點(diǎn)的共振光散射信號(hào)以 及背景，分別計(jì)算了兩種基底的S/N值和Z’質(zhì)量因子，S/N值根據(jù)通過(guò)RSL檢測(cè)的共振光散射信號(hào)強(qiáng)度與背景噪音信號(hào)的比值，而ζ’是通過(guò)公式Z = 1-3σs+3σc/us－uc︳︳計(jì)算，其中μ。背景信號(hào)的平均值；σ。背景的信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差；μ s金納米粒子共振光散射信號(hào)的平均值；ο s金納米粒子共振光散射信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過(guò)計(jì)算得到3D基底制備的基因芯片的S/N為9.0，V為0. 87，而2D基底制備 的基因芯片S/N為5.72，Z’為0.57。S/N值越大，Z’值越趨向于1，芯片的質(zhì)量越好。所以通過(guò)以上的結(jié)果證明本發(fā)明提供的3D基底制備基因芯片的性能優(yōu)于2D基底 制備的基因芯片。實(shí)施例5本發(fā)明提供的基因芯片的檢測(cè)限和線性范圍首先，按照實(shí)施例1和實(shí)施例2的方法得到檢測(cè)探針耦合的金納米粒子和PAMAM 修飾的3D基底；按照實(shí)施例4的方法進(jìn)行點(diǎn)樣、雜交反應(yīng)和檢測(cè)靶標(biāo)，其中靶標(biāo)溶液的濃度分別 為 1 μ mol/L、100nmol/L、50nmol/L、10nmol/L、5nmol/L、lnmol/L、500pmol/L、100pmol/Lo芯片上的具體反應(yīng)過(guò)程參看圖2。按照以上實(shí)驗(yàn)步驟，我們得到的結(jié)果參看圖5。圖5為是在2D基底制備的基因芯片和3D基底制備的基因芯片上，共振光散射信 號(hào)隨著靶標(biāo)T濃度的變化而變化的圖像以及相應(yīng)的數(shù)據(jù)提取圖，其中，正方形對(duì)應(yīng)于2D基 底制備的基因芯片上的信號(hào)曲線，圓點(diǎn)對(duì)應(yīng)于3D基底上制備的基因芯片的信號(hào)曲線。圖 中橫坐標(biāo)為靶標(biāo)濃度取對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為共振光散射信號(hào)。實(shí)驗(yàn)中用到的探針P1的濃度為 5μΜ ；靴標(biāo) T 的濃度分別為 1 ymol/L、100nmol/L、50nmol/L、10nmol/L、5nmol/L、lnmol/L、 500pmol/LU00pmol/L ；檢測(cè)探針耦合的金納米粒子的濃度為5nmol/L。在3D基底制備的基因芯片上，此方法對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)限為lOOpmol/L，且當(dāng)濃度在 Inmol/L-lOOnmol/L之間時(shí)，共振光散射信號(hào)隨著濃度的增加而增強(qiáng)，在濃度為lOOnmol/L 時(shí)達(dá)到飽和。而對(duì)于2D基底制備的基因芯片，信號(hào)值明顯較低，且檢測(cè)限為lOnmol/L，即靈 敏度降低了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。實(shí)施例6本發(fā)明提供的檢測(cè)方法的選擇性。首先，按照實(shí)施例1和實(shí)施例2的方法得到檢測(cè)探針耦合的金納米粒子和PAMAM 修飾的3D基底；按照實(shí)施例4的方法進(jìn)行點(diǎn)樣、雜交反應(yīng)和檢測(cè)靶標(biāo)，其中使用了 10中不同的靶 標(biāo)探針溶液P1-Picit5芯片上的具體反應(yīng)過(guò)程參看圖2。實(shí)驗(yàn)中用到的10種靶標(biāo)探針P1 Pltl的序列如SEQ ID No. 1、No. 2Νο· 3、No. 4、 No. 5、No. 6、No. 7、No. 8、No. 9、No. 10 所示。靶標(biāo) T 的序列如 SEQ ID No. 11 所示。其中，只 有P1與靶標(biāo)完全匹配，P2 P7在不同位點(diǎn)各有一個(gè)錯(cuò)配堿基，P8 Pltl各有兩個(gè)錯(cuò)配堿基。按照以上實(shí)驗(yàn)步驟，我們得到的結(jié)果如圖6，圖7所示。圖中y軸代表共振光散射 的相對(duì)強(qiáng)度，即以完全匹配的探針P1的信號(hào)為基準(zhǔn)，其他探針的信號(hào)與P1信號(hào)的比值；X軸 代表相應(yīng)的靶標(biāo)探針?lè)N類。是對(duì)單核苷酸多態(tài)性考察。圖6是在2D基底上10種靶標(biāo)探針(P1-Pio)的共振光散射信號(hào)圖及相應(yīng)的數(shù)據(jù)提取圖，圖7是在3D基底上10種探針的共振光散射信號(hào)圖及相應(yīng)的數(shù)據(jù)提取圖。實(shí)驗(yàn)中用到的探針(P1-Pltl)的濃度均為5ymol/L，靶標(biāo) T的濃度為lOOnmol/L，檢測(cè)探針耦合的金納米粒子的濃度為5nmol/L。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證明(1)只有與靶標(biāo)相匹配的探針P1有強(qiáng)的共振光散射 信號(hào)；(2)具有一個(gè)錯(cuò)配堿基的寡聚物P2-P7有很弱的信號(hào)，且其信號(hào)值與堿基對(duì)的種類和 錯(cuò)配位點(diǎn)有關(guān)錯(cuò)配位點(diǎn)越靠近探針的固定端即3’端信號(hào)值越弱，且在同一錯(cuò)配位點(diǎn)處， 含有T:G堿基對(duì)的靶標(biāo)探針比含有T:C堿基對(duì)的信號(hào)要高；(3)具有兩個(gè)錯(cuò)配堿基的寡聚 物P8-Pltl沒(méi)有可檢測(cè)的共振光散射信號(hào)；(4)通過(guò)圖中柱狀數(shù)據(jù)的比較計(jì)算得出結(jié)論含有 一個(gè)錯(cuò)配堿基的靶標(biāo)探針與完全匹配的靶標(biāo)探針的散射光信號(hào)比值，2D基底制備的基因芯 片的比值在0-24. 3%之間，3D的基底制備的基因芯片比值在0-4. 2%之間，說(shuō)明3D基底制 備的基因芯片的選擇性明顯優(yōu)于2D基底制備的基因芯片。以上對(duì)本發(fā)明提供的一種靶標(biāo)的檢測(cè)方法及其檢測(cè)用基因芯片進(jìn)行了詳細(xì)的介 紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只 是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修 飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種用于生物芯片的基底，其特征在于，由聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合在固體支持物上形成，所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64個(gè)氨基末端的樹(shù)枝狀大分子，分子量為14214～14220；所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子經(jīng)醛基活化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基底，其特征在于，所述固體支持物為玻片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基底，其特征在于，所述生物芯片為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、 糖芯片或組織芯片。
4.一種基因芯片，包括表面通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合了聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子的固體支 持物，以及通過(guò)共價(jià)鍵固定在所述聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大分子上的靶標(biāo)探針；所述靶標(biāo)探 針含有能與靶標(biāo)雜交的序列；所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64 個(gè)氨基末端的樹(shù)枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子經(jīng)醛基活化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述固體支持物為玻片。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因芯片，其特征在于，所述玻片為二氧化硅玻片或有機(jī)硅 玻片。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述靶標(biāo)探針為3'-NH2修飾的DNA 探針或RNA探針。
8.權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述基因芯片的制備方法，包括以下步驟步驟1 將表面醛基化的固體支持物浸泡于聚酰胺_胺型樹(shù)枝狀大分子溶液中IOh 14h，得到與聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子共價(jià)結(jié)合的固體支持物；步驟2 用pH值為7 7. 4的戊二醛溶液將所述與聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子共價(jià)結(jié) 合的固體支持物活化；步驟3 取靶標(biāo)探針在步驟2所得固體支持物上點(diǎn)樣，得到基因芯片。
9.一種靶標(biāo)的檢測(cè)方法，包括以下步驟步驟1 使半徑為IOnm 13nm金納米粒子與二硫鍵修飾檢測(cè)探針?lè)磻?yīng)，制備與檢測(cè)探 針耦合的金納米粒子，所述檢測(cè)探針與靶標(biāo)雜交；步驟2 使固定于權(quán)利要求4所述基因芯片上的靶標(biāo)探針與可能含靶標(biāo)的待測(cè)樣品反 應(yīng)，洗滌后使所述基因芯片與步驟1所制備的與檢測(cè)探針耦合的金納米粒子反應(yīng)，所述靶 標(biāo)探針不與檢測(cè)探針雜交；步驟3 取0. 05 0. 09mol/L的硝酸銀溶液與0. 02 0. 05mol/L的對(duì)苯二酚溶液按 體積比1 1.5 1混合后，與經(jīng)步驟2處理后的基因芯片在室溫下反應(yīng)，洗滌后檢測(cè)共振 光散射信號(hào)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述靶標(biāo)為DNA序列或RNA序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種用于生物芯片的基底，由聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合在固體支持物上形成，所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64個(gè)氨基末端的樹(shù)枝狀大分子，分子量為14214～14220；所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子經(jīng)醛基活化。本發(fā)明提供的用于生物芯片的基底利用樹(shù)枝狀大分子的多氨基末端增加了反應(yīng)點(diǎn)，使生物芯片靈敏度提高。本發(fā)明還提供用所述基底制備的基因芯片、所述基因芯片的制備方法以及利用該基因芯片檢測(cè)靶標(biāo)的方法。
文檔編號(hào)C12M1/34GK101824477SQ20101015773
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2010年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者劉殿俊, 李小梅, 王振新 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所