專利名稱：：通過重組瑞氏木霉以誘導型方式高效表達和生產t4溶菌酶的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及基因工程領域，特別是涉及一種在瑞氏木霉中以誘導型方式表達和生產T4溶菌酶重組蛋白的方法。
背景技術：
：溶菌酶(Lysozyme，EC3.2.17)是指一類廣泛存在于自然界中且對多種革蘭氏陽性和陰性病原細菌、真菌以及某些病毒具有殺滅或抑制作用的水解酶類，1922年由英國細菌學家Fleming首次發(fā)現。該水解酶的主要殺菌方式是破壞細菌細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的0-1，4糖苷鍵，造成胞壁破裂和內溶物滲出，由此導致細菌崩潰和死亡，因此，溶菌酶又被稱為N-乙酰胞壁酸酶。在自然界中，溶菌酶的來源是十分廣泛的，大致可分為動物、植物和微生物來源的溶菌酶等幾類。動物來源的溶菌酶一般存在于人和哺乳動物的多種組織和分泌物中，如存在于眼淚、唾液、肝、腎、淋巴組織以及蛋清中等。木瓜、蕪菁和蘿卜等植物中也能分離到溶菌酶，它們被認為在生物肌體的第一道防御屏障中起重要作用。目前已在多種微生物體內發(fā)現溶菌酶的存在，如球孢鏈霉菌、丙酮丁酸梭菌以及多種噬菌體等。T4溶菌酶來源于侵染大腸桿菌的T4噬菌體，由T4噬菌體gpe基因所編碼(ArisakaF，etal.，2003)，基因全長495個堿基，編碼164個氨基酸，分子量18700Da。當噬菌體顆粒在宿主細胞內包裝完成后，在T4溶菌酶的作用下導致宿主_大腸桿菌細胞裂解。迄今為止，T4溶菌酶已經有30多年的研究歷史，該酶及其多種突變體的晶體結構已經得到解析。T4溶菌酶由兩個結構域所組成位于N端的a/0結構域和位于C端的a螺旋結構域。研究發(fā)現，T4溶菌酶的殺菌作用主要表現在兩個方面一是該酶具有N-乙酰胞壁酸酶活性，二是位于該酶C端帶正電荷的a螺旋域能夠與細菌或真菌帶負電荷的細胞膜結合，從而干擾宿主細胞正常的生理代謝。位于T4溶菌酶C端的a螺旋結構域主要有4個，分別是a1(115-122)、a2(126-134)、a3(137-141)和a4(143-155)。人工合成的a2-a3和a4短肽沒有N_乙酰胞壁酸酶活性，但仍表現抗細菌或真菌的生物活性。同樣將T4溶菌酶加熱變性后，發(fā)現其N-乙酰胞壁酸酶生物活性雖然喪失，但仍保留較強的殺菌能力。研究顯示，對T4溶菌酶進行結構改造和修飾能夠提高其殺菌活性和熱穩(wěn)定性，例如蛋白N端帶有6組氨酸標簽結構(6XHis-Tag)的T4溶菌酶的殺菌活性為天然T4溶菌酶的2倍；此外，若將N端第6位氨基酸由疏水的甲硫氨酸M變成帶正電的賴氨酸K后，抗菌活性可提高4倍，但蛋白分子的穩(wěn)定性下降，推測其殺菌活性提高的原因可能是由于C端自由度增強，從而使a螺旋結構域能更有效地與細胞膜靶標結合。T4溶菌酶除了能夠殺滅多種病原細菌外，對某些病原真菌也具有抑制作用。T4溶菌酶雖然不能穿過真菌分生孢子的細胞膜，但經該酶處理后的真菌分生孢子不再膨大和發(fā)芽。T4溶菌酶對土豆原生質體外膜也具有一定的破壞作用，但研究證實對人和哺乳動物的細胞無毒害作用，因此，T4溶菌酶在醫(yī)藥、食品和飼料等工業(yè)領域都具有極大的應用潛力。從T4噬菌體感染的大腸桿菌細胞中提取T4溶菌酶，生產工藝不僅繁瑣、產量低，而且難以工業(yè)化。近幾年來，隨著分子生物學和基因重組技術的迅猛發(fā)展，構建基因工程菌株如酵母和大腸桿菌等表達和生產外源重組蛋白的方法越來越受到科技工作者和工業(yè)領域專家的青睞，而絲狀真菌作為外源蛋白表達的新宿主則同樣具有許多優(yōu)點，如1)外源蛋白基因也能夠整合到絲狀真菌基因組中而可獲得穩(wěn)定遺傳的轉化子；2)受誘導物緊密調控的強啟動子能夠啟動下游外源蛋白基因的高效表達，且能夠將重組外源蛋白分泌到胞外，從而有利于后期的純化工作；3)作為真核表達系統(tǒng)能夠對外源重組蛋白進行翻譯后加工和修飾，包括二硫鍵的生成和糖基化等；4)菌體和其代謝產物對人體和哺乳動物無毒副作用等；5)工業(yè)發(fā)酵技術成熟，方便重組外源蛋白的工業(yè)化生產等。本發(fā)明中所使用的瑞氏木霉(Trichodermareesei)是一種無害的腐生性絲狀真菌，工業(yè)上常應用于纖維二糖水解酶的生產，其產量最高可達40g/L(姜天一等，2007)。纖維素酶系中的1,4-0-纖維二糖水解酶l(l，4-beta-D-glucancellobiohydrolase)基因CBH1的啟動子是一個極強的誘導型啟動子，該啟動子可被乳糖、麥秸粉和纖維素等底物誘導，但能夠被葡萄糖所阻遏。同時，它也可作為外源基因整合到木霉基因組上的同源核苷酸序列。瑞氏木霉的轉化方法主要有電融合法和原生質體轉化法等，重組子的篩選主要是通過采用抗生素抗性作為選擇標志基因，最常用的是潮霉素以及G418抗性基因。瑞氏木霉作為一種新的外源蛋白基因表達系統(tǒng)其操作技術還不夠成熟，目前僅有零星成功的報道(見表1)。表1瑞氏木霉表達的外源重組蛋白名稱來源分子量(kDa)啟動子宿主表達量參考文獻乙烯合成酶Pseudomonassyringaepv.glycinea40CbhlT.virideLiTaoetal.,2008木聚糖酶Acrophialophoranainiana19CbhlT.reesei172mg/LBrunoC,etal.,2007酯酶Melanocarpusalbomyces74CbhlT.reeseiHannaK.，etal.,2005抗真菌蛋白Aspergi11usgiganteusMDH188946CbhlT.viride徐軍等，2003大麥內肽酶B大麥30CbhlT.reesei500mg/LRitvaS.，etal.，1997在本發(fā)明之前，還沒有采用密碼子得到優(yōu)化、人工合成的T4溶菌酶基因在瑞氏木霉中以誘導型方式表達該外源蛋白的報道，還沒有人使用瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因CBH1的啟動子作為同源序列將T4溶菌酶基因整合到瑞氏木霉基因組中的報道，更沒有人在瑞氏木霉中進行T4溶菌酶重組蛋白的高密度發(fā)酵生產。
發(fā)明內容本發(fā)明的第一個目的是要提供一種密碼子得到優(yōu)化、人工合成的T4溶菌酶基因，其能夠在瑞氏木霉中得到穩(wěn)定和高效表達。本發(fā)明的第二個目的是使用一個同源核苷酸整合序列，使攜帶有T4溶菌酶外源基因以及篩選標記等重要表達元件的質粒載體能夠被整合到瑞氏木霉基因組中，并得到穩(wěn)定遺傳的重組瑞氏木霉工程菌株。本發(fā)明的第三個目的是要提供一種在瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因啟動子啟動下穩(wěn)定地高效表達T4溶菌酶基因的瑞氏木霉重組菌。本發(fā)明的第四個目的是提供最適的重組瑞氏木霉生長和表達條件以及目標蛋白快速的純化方法。為達到上述目的，本發(fā)明首先提供一種編碼T4溶菌酶蛋白的基因，其是按照瑞氏木霉偏愛的密碼子優(yōu)化過的、編碼或至少部分編碼T4溶菌酶蛋白的基因。其中所述的T4溶菌酶蛋白一級結構為SEQIDN0.1所示的氨基酸序列。根據一個優(yōu)選的實施方案，所述基因具有或至少部分具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。然后所述基因被置于瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因啟動子操縱之下，整合到瑞氏木霉基因組中，隨著重組木霉菌體的生長，T4溶菌酶基因能夠以誘導型方式得到穩(wěn)定地高效表達。根據一個優(yōu)選的實施方案，瑞氏木霉的纖維二糖水解酶1基因的啟動子和終止子DNA序列被先后克隆出來并被插入到一個新的T4溶菌酶木霉表達質粒載體中，借助該啟動子或終止子DNA序列與瑞氏木霉基因組之間發(fā)生的同源重組，可將受瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因啟動子調控的T4溶菌酶基因及其它重要的表達元件同時整合到瑞氏木霉基因組中，而得到重組瑞氏木霉工程菌株，其在纖維素的誘導下能夠穩(wěn)定和高效地表達T4溶菌酶重組蛋白，并最終將其分泌到胞外。具體的，首先是編碼T4溶菌酶的基因被按照瑞氏木霉所偏愛的密碼子完全人工合成出來，然后通過PCR擴增技術，在其5’端上游區(qū)域添加瑞氏木霉纖維二糖水解酶1分泌信號肽的核苷酸編碼序列以及瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因的啟動子，在其3’端下游區(qū)域添加瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因的終止子序列，由此形成一個新的外源基因讀碼框。按照一個優(yōu)選的實施方案，T4溶菌酶基因首先被置于一個誘導型啟動子調控之下，然后被插入到一個瑞氏木霉表達質粒載體上。在該表達質粒載體上，該誘導型啟動子位于纖維二糖水解酶1分泌信號肽核苷酸編碼序列與T4溶菌酶核苷酸編碼序列所形成的融合基因的上游，它操縱所謂的融合蛋白基因在瑞氏木霉中的穩(wěn)定和高效地表達。同時，該啟動子核苷酸序列在表達質粒載體整合到瑞氏木霉基因組的過程中還起到了同源重組序列的作用。在該表達質粒載體經完全線性化處理后，可通過電融合法或原生質體等方法被導入到瑞氏木霉細胞中，進而通過同源重組穩(wěn)定整合到瑞氏木霉染色體基因組上，此重組瑞氏木霉在發(fā)酵培養(yǎng)過程中表達的T4溶菌酶重組蛋白在纖維二糖水解酶1分泌信號肽的引導下得以分泌到胞外的培養(yǎng)基中。本發(fā)明所指的重組蛋白可以是T4溶菌酶蛋白的全部，然而，在某些具體實施方案中，所表達的外源基因也可能只是該天然蛋白的一部分。有時，T4溶菌酶重組蛋白可與另外一個具有不同生物學功能的蛋白基因以獨立或融合方式同時在一個木霉細胞內表達，其目的是為了方便提純或提高其生物活性。蛋白的融合可以通過蛋白翻譯后加工、共價結合的方式，或者通過DNA重組技術使基因在翻譯表達前就相互拼接在一起，而這兩種技術是本領域技術人員早已熟知的技術。這樣，本發(fā)明較優(yōu)選的實施方案是1)按照瑞氏木霉所偏愛的密碼子，進行T4溶菌酶基因的人工合成；2)瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因啟動子及纖維二糖水解酶1分泌信號肽核苷酸編碼序列的克隆；3)纖維二糖水解酶1基因終止子DNA的克??；4)構建一個質粒表達載體，其中含有編碼T4溶菌酶重組蛋白的基因或其衍生物的基因(包括基因密碼子被優(yōu)化、改變或與其它基因相融合等)，該基因首先與瑞氏木霉纖維二糖水解酶1分泌信號肽核苷酸編碼序列相互拼接形成融合基因，然后被置于瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因啟動子控制之下，在該融合基因下游添加有纖維二糖水解酶1終止子DNA序列，同時質粒表達載體中還包含有用于外源基因整合到瑞氏木霉基因組的同源重組序列，該序列可以是瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因啟動子或其他同源序列；5)通過電融合法或其他方法，將上述線性化后的質粒表達載體DNA轉化瑞氏木霉原生質體中，并將轉化后的瑞氏木霉原生質體涂布于含有0.5mg/mLG418的HM固體平板培養(yǎng)基上生長，能夠在此培養(yǎng)基上生長的木霉單菌落就是含有外源基因的木霉重組子。更進一步，本發(fā)明提供了有關重組重組瑞氏木霉最適的生長培養(yǎng)條件和外源蛋白表達條件，如培養(yǎng)基的成分、接種量、PH值、溶氧量和培養(yǎng)時間等，由此使該重組木霉工程菌的生長量和重組蛋白的分泌量都盡可能地達到最大化。通過離心除菌、中空纖維過濾、離子交換層析等操作從發(fā)酵液中可得到高純度的T4溶菌酶重組蛋白，為以后該酶的工業(yè)化生產、低成本發(fā)酵和快速純化奠定基礎。具體包括以下三個階段1)菌體培養(yǎng)階段，以10%的接種量接種瑞氏木霉工程菌后，經過72小時的培養(yǎng)，木霉菌體濕重將達到3540g/L左右；2)誘導表達階段，加入纖維素，誘導木霉細胞高效表達T4溶菌酶重組蛋白并將其分泌到培養(yǎng)基中，維持一定的PH值和溶氧量；3)蛋白純化，發(fā)酵液經過離心和三次不同規(guī)格的濾膜過濾處理，在經過一次離子交換層析，T4溶菌酶蛋白的純度可達99%以上。最優(yōu)選的，采用本發(fā)明的工程菌株發(fā)酵生產重組蛋白的方法包括(1)種子液制備首先將菌絲接種于PDA培養(yǎng)基上，2728°C培養(yǎng)67天，再將孢子溶于無菌水中，以12%體積比接種于液體匪培養(yǎng)基中，2728°C振蕩培養(yǎng)(375380轉/分)7296小時；以其作為高密度發(fā)酵的種子液；(2)菌體培養(yǎng)在發(fā)酵罐中盛放適量MM基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，按810%的體積比接種步驟(1)的木霉種子液，2728°C通氣攪拌(轉速自始至終維持在375380轉/分)培養(yǎng)7296小時左右，pH維持在5.56左右；(3)蛋白誘導表達在接種后的第46天，往上述培養(yǎng)基中流加溶解在匪培養(yǎng)基中50wt%的纖維素，使培養(yǎng)基纖維素濃度維持在23wt%左右，溶氧量大于20%，溫度維持在2728°C，pH維持在5.56左右，在這種條件下繼續(xù)振蕩(轉速自始至終維持在375380轉/分)誘導培養(yǎng)34天。在上述過程中用到的匪培養(yǎng)基配方為每升含葡萄糖20g、(NH4)2S045g、KH2P0415g、MgS047H200.6g、CaCl20.6g、FeS047H200.005g、MnS04H200.0016g、ZnS047H200.0014g、CoCl20.002g,pH5.5。發(fā)酵產品中T4溶菌酶重組蛋白的純度直接關系到該重組蛋白的應用范圍及所生產相關產品成本的高低，按照一個優(yōu)先的實施方案，為了快速純化大量的T4溶菌酶重組蛋白，可以首先將瑞氏木霉發(fā)酵液上清液使用不同截流分子量的過濾裝置以及離子交換層析等進行預處理，在純化過程中的每一個環(huán)節(jié)，都可使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，通過上述方法可獲得純度達到99%的重組蛋白。6本發(fā)明在詳細介紹瑞氏木霉表達系統(tǒng)時僅提到了瑞氏木霉菌株QM9414，然而，正如本領域技術人員所早已熟知的木霉表達系統(tǒng)那樣，許多種木霉表達系統(tǒng)都可以利用本發(fā)明所提供的方法進行遺傳轉化、表達和生產。因此，所有這些木霉表達系統(tǒng)都應包括在本發(fā)明的權利要求范圍之內。就像下面實例中所要詳細描述的那樣，本發(fā)明描述的瑞氏木霉轉化方法中所用的質粒載體是一個整合型的質粒表達系統(tǒng)，按照一個優(yōu)先的實施方案，本發(fā)明所使用的質粒表達載體是一個得到改造后的PPIC9K，其原先的A0X1誘導型啟動子被瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因誘導型啟動子所取代，同時質粒表達載體中還包含有用于外源基因整合到酵母基因組的同源重組序列，該序列可以是瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因誘導型啟動子、終止子序列或其它同源序列。本發(fā)明極大地提高了T4溶菌酶重組蛋白在瑞氏木霉細胞中生物產量的方法，該重組蛋白已知在天然狀態(tài)下具有很強的抑菌或殺菌作用；或更確切地說，本發(fā)明所指的T4溶菌酶重組蛋白與源自T4噬菌體gpe基因所編碼的蛋白或其它常規(guī)表達系統(tǒng)生產的該重組蛋白相類似，作為抑菌或殺菌劑可以廣泛地應用到醫(yī)療、食品、飼料和科研等領域。采用本發(fā)明所述的方法，可有效地將密碼子優(yōu)化的T4溶菌酶基因通過瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因啟動子或終止子序列以同源重組的方式整合到瑞氏木霉基因組中，獲得的瑞氏木霉工程菌株能夠以誘導型方式式穩(wěn)定和高效地表達T4溶菌酶重組蛋白，同時提供了該重組蛋白的發(fā)酵和純化工藝，適用于規(guī)?；aT4溶菌酶重組蛋白。圖1為T4溶菌酶基因密碼子優(yōu)化和改造前后對比，N代表密碼子優(yōu)化和改造前的基因序列；M代表密碼子優(yōu)化和改造后的基因序列，兩序列間有縱線的表示核苷酸堿基未發(fā)生改變；圖2為誘導型木霉高效表達載體T4-CBH9K的構建過程；圖3為木霉轉化重組子的PCR擴增鑒定1為DNA標準分子量；29為9個木霉轉化子的T4溶菌酶基因擴增結果；CK+為T4溶菌酶基因陽性對照；CK-為T4溶菌酶基因陰性對照；圖4為SDS-PAGE電泳檢測T4溶菌酶重組蛋白表達情況M為標準分子量蛋白(BluePlusProteinmarker1294KDa，北京TransGenBiotech公司產品)；CK-為陰性對照，CBH9K轉化的(不含T4溶菌酶基因)重組木霉菌株誘導培養(yǎng)120小時發(fā)酵液上清；1為TR-T4誘導前培養(yǎng)72小時的發(fā)酵上清液；24分別為TR-T4誘導培養(yǎng)24、48及72小時后的發(fā)酵上清液；圖5為重組T4溶菌酶活性測定橫坐標為不同稀釋濃度的重組T4溶菌酶純品(單位為mg/mL)，縱坐標為0D350nm光吸收值，T41ysozyme為自木霉工程菌TR-T4發(fā)酵液中制備的T4溶菌酶純品的活性測定結果，CK-為CBK9K(空載體)轉化木霉菌發(fā)酵上清液提取物不同稀釋濃度的活性測定結果。具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1密碼子優(yōu)化后的T4溶菌酶基因的人工合成T4溶菌酶基因來源于T4噬菌體，其密碼子與原核生物較接近，而瑞氏木霉屬于真核生物，因此它們在基因密碼子偏好方面存在著一定的差異，而這種差異很可能會影響到T4溶菌酶基因及其轉錄產物在瑞氏木霉細胞中的穩(wěn)定性和表達效率。為提高T4溶菌酶重組蛋白的生物產量，根據業(yè)已公布的T4溶菌酶基因的DNA核苷酸序列和氨基酸序列(GenBank:NY000866)，在不改變其氨基酸序列的前提下(見SEQIDNO.1)，按照瑞氏木霉所偏愛的密碼子(見CodonUsageDatabase:Hypocreajecorina)，人工設計和合成了新的T4溶菌酶成熟蛋白的DNA編碼序列。密碼子優(yōu)化后的T4溶菌酶成熟蛋白基因與改造前相比，改變了其中的159個核苷酸堿基，總共涉及到53個密碼子，而G+C的含量由原來的36.6%變?yōu)?8.8%(見SEQIDNO.2)?；蚋脑烨昂髮Ρ纫姼綀D1(上述基因拼接和合成工作由上海博亞生物技術公司代為完成)。實施例2瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因啟動子_分泌信號肽和終止子核苷酸序列的克隆1、瑞氏木霉基因組的提取將瑞氏木霉菌株QM9414(該菌株來自中國農業(yè)大學)接種在匪[每升含葡萄糖20g、(NH4)2S045g、KH2P0415g,MgS04'7H200.6g,CaCl20.6g、FeS04.7H200.005g、MnS04.H200.0016g、ZnS047H200.0014g、CoCl20.002g,2%(w/v)瓊脂粉，pH5.5]固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)45天，從平板上挑取少量菌絲體轉移到離心管中，用生理鹽水洗2次，再加入少量玻璃珠和500ii1LSTES緩沖液[200mMTris*HC1(pH8.5),250mMNaCl,25mMEDTA,2%SDS]，在渦旋振蕩器上振蕩3X40s后，65°C反應lOmin，冰浴5min。再加入200yL10M乙酸銨冰浴5min后，12000rpm離心lOmin。取上清，加入200uL10M乙酸銨再次冰浴5min，12000rpm離心lOmin。將上清液用異丙醇_20°C沉淀20min。12000rpm離心lOmin，沉淀用70%乙醇洗滌兩次，烘干，用10iiL水溶解，加入適量RNaseA，37°C反應30min后，_20°C備用。2、瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因啟動子-信號肽和終止子核苷酸序列的克隆根據已知的瑞氏木霉纖維二糖水解酶基因啟動子-分泌信號肽(GenBank:D86235和E00389)和終止子序列(GenBank:E00389)，分別設計了primerl、primer2、primer3和primer44個引物，其中引物Primerl序列為(見SEQIDNO.3)5‘-ACAGATCTAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATC-3‘，Primer2為(見SEQIDNO.4)5'-CTCGAAGATGTTCATAGCACGAGCTGTGGCCAAGAAGGC-3‘，Primer3為(見SEQIDNO.5)5'-TACAAGAACTTGTAAAGGTCACCTTCTCCAACATCAAGTTCG-3‘，Primer4為(見SEQIDNO.6)5'-ACGTCGACCACGAAGAGCGGCGATTCTACGGG-3'。引物中下劃波浪線部分表示限制性內切酶酶切位點，下劃橫線部分是與人工合成的T4溶菌酶基因兩末端前15個核苷酸堿基序列分別呈堿基互補的部分。以Primerl和Primer2為引物，以瑞氏木霉菌株QM9414基因組DNA為模板，經PCR擴增，擴增得到瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因啟動子-分泌信號肽核苷酸編碼序列(Pcbhl-sig)(注纖維二糖水解酶1分泌信號肽長度為17氨基酸殘基，由51個核苷酸堿基所編碼)，為方便后續(xù)表達載體的構建，在Primerl中，添加了BglII限制性內切酶酶切位點(見Primerl中的下劃波浪線部分)；在Primer2中，添加了與T4溶菌酶核苷酸編碼序列5'端前15個核苷酸堿基呈堿基互補的DNA序列(見Primerf中有下劃橫線的部分)；PCR擴增條件為94°C預變性5分鐘，94°C變性40秒，55°C退火40秒，72°C延伸1.5分鐘，30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。同樣地，以Primer3和Primer4為引物，以瑞氏木霉菌株QM9414基因組DNA為模板，經PCR擴增，獲得了瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因終止子序列(Tcbhl)；為方便后續(xù)表達載體的構建，在Primerf中，添加了與T4溶菌酶核苷酸編碼序列3'端前15個核苷酸堿基呈堿基互補的DNA序列(見Primerf中有下劃橫線的部分)；在Primer4中，添加了SalI限制性內切酶酶切位點(見Primer4中的下劃波浪線部分)。PCR擴增條件為94°C預變性5分鐘，94°C變性40秒，55°C退火40秒，72°C延伸45秒，30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。實施例3:T4溶菌酶瑞氏木霉基因讀碼框的拼接將上述密碼子優(yōu)化的T4溶菌酶基因(人工序列)、Pcbhl-sig以及Tcbhl的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠回收試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司，方法見該產品說明)回收目的DNA片段，按照111的比例，將Pcbhl-sig、T4溶菌酶基因和Tcbhl三種DNA片段(凝膠回收產物)混合，以此為模板，進行PCR再擴增，所用的兩端引物分別為上述的primer1和primer4,PCR擴增條件為94°C預變性5分鐘，94°C變性40秒，55°C退火40秒，72°C延伸2分鐘，30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。將上述全長的PCR產物直接插入到pEASY-Tl(購自北京全式金生物技術有限公司，操作方法見該產品說明書)質粒中的T位點內，按照該公司所提供的方法，得到含有外源DNA片段插入的中間質粒載體T4-T(含T4溶菌酶瑞氏木霉基因讀碼框，其順序為纖維二糖水解酶1基因啟動子_纖維二糖水解酶1分泌信號肽編碼序列_密碼子優(yōu)化后的T4溶菌酶基因-纖維二糖水解酶1基因終止子序列)的細菌克隆，然后，通過核苷酸測序分析，確定T4溶菌酶瑞氏木霉基因讀碼框中的DNA序列是正確和完整的(DNA測序由北京標凱科技有限公司完成)。實施例4瑞氏木霉表達載體T4-CBH9K的構建用限制性內切酶BglII和SalI進行雙酶切，將連接在中間質粒載體T4_T內的T4溶菌酶瑞氏木霉基因讀碼框切下來，利用瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段。用相同的限制性內切酶處理質粒PPIC9K，利用瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段。將上述兩個回收的DNA片段混合后并用連接酶連接在一起便得到瑞氏木霉表達載體T4-CBH9K(見附圖2)，然后用上述質粒載體轉化大腸桿菌細胞DH5a(購自美國GIBC0公司)以方便進行該質粒的復制和保存。質粒載體pPIC9K購自美國Invitrogen公司，它是一個酵母誘導型表達質粒載體，它含有一個高效的誘導型啟動子-醇氧化酶啟動子(A0X1)，在甲醇的誘導下，可調控下游插入外源基因的高效表達。實施例5線性化T4-CBH9K質粒DNA的制備首先用堿裂解法(參見分子克隆試驗指南)從大腸桿菌細胞DH5a中提取T4-CBH9K質粒DNA，然后用12倍過量的限制性內切酶NdeI酶切，使之完全線性化，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否完全。然后用酚和氯仿分別抽提上述酶切產物，乙醇沉淀，棄上清，收集沉淀，經冷凍干燥后，將沉淀重新溶解在無菌的去離子水中，_20°C保存?zhèn)溆?。實施?瑞氏木霉原生質體的遺傳轉化將在PDA培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，加水到1L)斜面上培養(yǎng)7天左右的瑞氏木霉QM9414的分生孢子用生理鹽水洗下。在PDA平板培養(yǎng)基上放置一張無菌玻璃紙，將瑞氏木霉分生孢子懸液(濃度約為107個/mL)涂布于培養(yǎng)基上，28°C培9養(yǎng)18h左右。將20mg/mL溶壁酶(購自廣東省微生物研究所)、20mg/mL蝸牛酶和10mg/mL纖維素酶混合，完全溶解于1.2M山梨醇IOOmM磷酸鉀緩沖液(pH5.6)中，再將平板中玻璃紙上的幼嫩菌絲轉移到其中，28°C水浴1.5h2h。在此過程中不時鏡檢，觀察原生質體的生成情況。通過6層擦鏡紙過濾，將原生質體與未被消化的菌絲體分離開，并用1.2M山梨醇IOmMTris·HCl(pH7.5)洗滌2次。6000轉/分鐘離心10分鐘，收集原生質體，并用IM山梨IOmMTris·HCI(pH7.5)洗滌2次，最后重懸于IM山梨醇IOmMCaC12-IOmMTris-HCl(ρΗ7·5)中，使原生質體濃度為5xl07_5xl08/mL。將線性重組質粒(210μg)與制備好的瑞氏木霉原生質體(約200μL)混合，加入200μL60%PEG400050mMCaCl2IOmMTris·HCl(pH7.5)，冰浴30min,然后室溫溫浴20min,再加入2mL60%PEG400050mMCaCl2lOmmol/LTris·HCl(pH7.5)，繼續(xù)于室溫放置5min，最后加入4mLIM山梨醇10mmol/LCaCl2lOmmol/LTris'HCl(pH7.5)，混勻，將上述轉化液涂布在含有G418濃度為0.5mg/mL的MH[每升含dextrose20g,(NH4)2SO45g,KH2PO415g,MgSO4·7H200.6g,CaCl20.6g,FeSO4·7H200.005g,MnSO4·H2OO.0016g,ZnSO4·7H200.0014g,CoCl20.002g,sorbitol182.18g,pH5.5]平板上，28°C培養(yǎng)45天至木霉轉化子長出。實施例7重組瑞氏木霉菌株的篩選將MH培養(yǎng)基上生長的G418抗性轉化子分別接種在匪培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)45天后，從平板上分別挑取少量菌絲體轉移到不同的離心管中，用生理鹽水洗2次，再加入少量玻璃珠和500μLSTES緩沖液[200mMTris·HCl(pH8.5)，250mMNaCl,25mMEDTA,2%SDS]，在振蕩器上振蕩3X40s后，65°C反應10分鐘，冰浴5分鐘。再加入200μL10Μ乙酸銨溶液，冰浴5分鐘后，12000轉/分離心10分鐘，取上清，加入200μL10Μ乙酸銨溶液，再次冰浴5分鐘，12000轉/分離心10分鐘。取上清液并用異丙醇_20°C沉淀20分鐘，然后離心，沉淀用70%乙醇洗滌兩次，風干后，用10μL水溶解，加入適量RNaseA，37V反應30分鐘后，備用。以上述提取的瑞氏木霉基因組DNA為模板，以Pl(見SEQIDN0.7)(5'-AAATGAACATCTTCGAGAAGTTGAGG-3，)和P2(見SEQIDN0.8)(5'-AATTACAAGTTCTTGTAGGCGTCCC-3，)為引物，通過PCR，擴增495bp的T4溶菌酶基因。反應條件為95°C預變性5min，94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸40s，共30個循環(huán)，72°C延伸lOmin，選出有陽性條帶的克隆(見附圖3中的泳道7)。將有陽性條帶的木霉菌絲再次接種在PDA斜面上，28°C培養(yǎng)一周左右，令其大量產生分生孢子。先用生理鹽水將分生孢子洗下來，然后用12層擦鏡紙過濾，以除去多余的菌絲。將木霉分生孢子按照100個孢子/皿均勻的涂布在薄的PDA培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)IOh左右，在超凈臺內用顯微鏡10倍物鏡觀察平板培養(yǎng)基上的孢子萌發(fā)情況，用無菌刀片將視野內獨立的且萌發(fā)的分生孢子連同培養(yǎng)基一同切下。轉入含有0.4mg/mLG418的PDA斜面上，28°C培養(yǎng)一周左右，當試管內有大量菌絲產生時，將其挑出一部分，快速提取基因組，進行PCR擴增驗證是否仍含有T4溶菌酶基因，擴增條件同上。經過上述單孢分離和PCR檢測后的仍為陽性的克隆被確認為成功的木霉轉化子，并被命名為TR-T4。實施例8重組木霉工程菌的高密度發(fā)酵1、種子液的制備將工程菌株TR-T4的菌絲接種于多個PDA固體斜面培養(yǎng)基中，2728°C培養(yǎng)67天，待分生孢子長成綠色后，刮下孢子并懸浮于無菌水中，以12%接種量接種于500mL匪液體培養(yǎng)基中，2728°C避光震蕩(375380轉/分)培養(yǎng)4872h，以其作為高密度發(fā)酵的種子液。2、重組木霉在5L發(fā)酵罐中的高密度發(fā)酵本發(fā)酵過程可以分為以下兩個階段1)菌體培養(yǎng)階段在5L發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術有限責任公司)中盛放了3.5LMM基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，按10%的比例接種此前制備好的木霉種子液，2728°C通氣攪拌(轉速自始至終維持在375380轉/分)培養(yǎng)7296小時左右，pH維持在5.56左右。在該培養(yǎng)過程中，隨著木霉菌體的生長，培養(yǎng)基中的溶氧量將由100%逐漸降低，當培養(yǎng)基中的碳源基本消耗完后，溶氧量將再度升高至80%以上，此時菌體的濕重將達3540g/L。2)誘導表達階段(72144h)在接種第四天后，通過蠕動泵流加50%纖維素懸浮液(用MM培養(yǎng)基配制)，使其工作濃度始終維持在23%左右，溶氧量始終大于20%，2728°C通氣攪拌培養(yǎng)至接種后144166小時，PH維持在5.56左右。每隔24小時取數毫升發(fā)酵液經5000rpm4°C下離心10分鐘，取30uL發(fā)酵液上清液進行SDS-PAGE檢測，發(fā)現有肉眼可觀察到的一條蛋白帶，分子量約為19KDa，與推測中的T4溶菌酶重組蛋白的分子量相吻合。此外，從PAGE電泳圖看，在加入纖維素誘導培養(yǎng)72小時后，重組蛋白的表達量達到最高峰(見附圖4)。實施例9重組蛋白的純化待一個發(fā)酵周期全部結束之后，留取400mL發(fā)酵液作為種子液(接種量為10%)直接進行下一輪的發(fā)酵過程。類似的操作累計進行3輪，在每輪發(fā)酵過程中，均對菌體的生長量和T4溶菌酶重組蛋白的表達量進行了測定。另外，在每輪發(fā)酵過程完全結束后，還取少許菌液涂布于PDA固體平板上，并從中任意挑取10個木霉單菌落，快速提取其基因組DNA,進行PCR檢測，結果發(fā)現，菌體的生物量、生長速度以及重組蛋白的表達量在各輪發(fā)酵過程中基本保持穩(wěn)定，另外，PCR的檢測結果也證實重組木霉具有很好的遺傳穩(wěn)定性(見表2)。表2TR-T4菌株的遺傳穩(wěn)定性和外源蛋白表達穩(wěn)定性的測定<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>除留存的種子液外，其余的發(fā)酵液用于T4溶菌酶重組蛋白的純化。發(fā)酵液經5000rpm4°C離心10分鐘，留取上清。發(fā)酵液上清首先用截流分子量為50KDa的中空纖維濾柱(天津膜天膜工程技術有限公司，產品型號M0F-503，使用方法見該公司說明)過濾，收集透過液，澄清的透過液再用截流分子量為IOKDa的納濾膜(上海朗極化工科技有限公司，產品編號2426538，使用方法見該公司說明)處理，保留回流液，終體積約為700mL。將此回流液進行脫鹽處理，向700mL回流液中加入6.3L蒸餾水，即將回流液稀釋10倍，然后將稀釋液再次通過上述IOKDa的納濾膜處理，此時得到的回流液中鹽離子濃度也相應稀釋10倍，如此重復操作5次，即回流液中鹽離子濃度稀釋IO5倍，最終得到700mL回流液，將此回流液冷凍干燥后，可得到初步提純(純度大60%左右)的重組蛋白凍干粉。該蛋白凍干粉樣品可通過離子交換層析得到進一步的純化，以滿足不同的生產需求。所使用的陽離子離子交換樹脂為CM-Sephadex-C25(美國GE公司產品)。按照該公司產品說明，對樹脂進行預處理，然后進行裝柱(裝柱方法見產品說明，層析儀為上海滬西分析儀器廠有限公司產品-型號MA99-3)，具體操作方法如下1)蛋白凍干粉加入5倍體積的蒸餾水進行稀釋，然后用丙醋酸將該稀釋液pH值調至5.55.8。2)樣品上柱(注若凍干粉樣品為2g+500mL蒸餾水時，使用1.5x50cm的層析柱，樹脂床體積高度為40cm)，流速3mL/分鐘。用紫外蛋白檢測儀及記錄儀記錄洗脫液流出過程。3)洗柱，待樣品快全部進入樹脂后，用0.IM磷酸鹽緩沖液含ICT3MMgSO4(pH6.5)進行洗柱，流速3mL/分鐘，至0D280nm吸光值為零，約需緩沖液為56倍柱體積。4)洗脫，用0.IM磷酸鹽緩沖液含KT3MMgSOdPO.5MNaCl(pH6.5)進行目標蛋白洗脫，流速3mL/分鐘，用紫外蛋白檢測儀監(jiān)視蛋白流出情況并收集最大蛋白洗脫部分(目的蛋白峰一般出現在加入洗脫液后不久)，收集含目的蛋白的洗脫液。5)將洗脫液移置透析袋中，對蒸餾水進行透析過夜，期間更換蒸餾水數次，目的是為了去除其中所含的NaCl。6)透析液通過冷凍干燥，可得到目標蛋白干粉，蛋白純度可達99%(SDS-PAGE電泳圖經LabWork軟件分析，美國UVP公司產品)。以上，室溫下可長期保存。視使用目的不同，可加工成各種劑型，如食品添加劑，針劑等。實施例9:T4溶菌酶重組蛋白生物活性的檢測利用比色法進行溶菌活性比較，具體操作如下①底物制備從-72°C超低溫冰箱中取出冷凍保藏的小球菌(MicrococcusLysodeikticus)(購自于中國普通微生物菌種保藏中心，菌種編號1.634)，用接種針挑取少許菌液后，在LB(5g酵母提取物，IOg胰蛋白胨，IOgNaCl,20gagar，加水至1L，pH7.0)固體平板培養(yǎng)基上劃線，37°C倒置培養(yǎng)過夜。挑取小球菌細胞培養(yǎng)單菌落，接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，次日全部轉接于IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至細胞濃度OD6tltlnm值為1.602。將培養(yǎng)液轉移至IOOmL離心管中，冰浴后5000rpm4°C離心10分鐘，收集沉淀。用0.05MTris-HCl(pH7.4)緩沖液50mL懸浮和洗滌細胞，同上離心后，收集沉淀。將細胞再次懸浮于IOmL相同的Tris-HCl緩沖液中，并轉移置至干燥瓶中，置于_20°C冷凍1個星期(冷凍貯存對增強細胞敏感度是必需的)，然后再進行冷凍干燥。細胞干粉在密閉條件下可置于干燥器中室溫下長期保存。如果細胞干粉對T4溶菌酶不敏感，還可將細胞干粉置于37°C保存以便增強細胞的敏感度。取小球菌凍干粉40mg，重新懸浮于IOOmL0.2M的磷酸鹽緩沖液(5.54gNa2HPO4·12Η20，0·704gNaH2PO4·2H20，加蒸餾水至IOOmL,ρΗ7·4)，其OD35tlnm值為1.0左右(若將40mg小球菌凍干粉重新懸浮于50mL的磷酸緩沖液中，其OD35tl值為1.6左右)，備用。②底物孵育取上述制備的T4溶菌酶重組蛋白純品若干毫克，分別稀釋成不同的工作濃度后各取300uL，分別與上述制備好的2.7mL小球菌底物，陰性對照為蒸餾水。將各試管置于37°C溫箱中孵育Ih后，在350nm波長下測定溶液的吸光值(用2.7ml0.2M的磷酸鹽緩沖液加入300μL蒸餾水來調零)，測定結果見表3表3Τ4溶菌酶重組蛋白溶菌活性的檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注表中數字為三次試驗結果的平均值本發(fā)明首次按照瑞氏木霉所偏愛的密碼子，人工合成了一個全新的T4溶菌酶基因，并與瑞氏木霉纖維二糖水解酶1分泌信號肽(17aa)的編碼序列融合；克隆了瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因的啟動子及該基因的終止子序列；并利用上述的各種元件，在質粒PPIC9K的基礎上重新構建了一個全新的、誘導型的和分泌型的瑞氏木霉高效表達載體；在將T4溶菌酶基因導入瑞氏木霉細胞中后，通過抗性篩選、活性檢測等方法，獲得了能夠穩(wěn)定和高效表達T4溶菌酶的重組瑞氏木霉工程菌株，再經高密度發(fā)酵、重組蛋白純化等一系列操作，最終制備的重組T4溶菌酶蛋白純品具生物活性，可廣泛應用于醫(yī)療、食品、飼料以及科研等領域。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。參考文獻1、ArisakaF.,etal.,Theinternationaljournalofbiochemistry&cellbiology,2003,35(1):16_212、CellittiJ.,etal.,ProteinSci.，2007，16(5):842_513、姜天一和朱平，生物技術通訊，2007，18(6)1050-10524、LiTao，etal.，ApplMicrobiolBiotechnol.，2008，80:573_5785、BrunoC.，etal.，Biotechnol.Lett.,2007,29:1195_12016>HannaK.,etal.BiotechnologyandBioengineering,2006,94:407_4157、徐軍等，生物化學與生物物理學報2003，35(5):454_4588>RitvaS.,etal.,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1997,63(12)4938-4940權利要求一種編碼T4溶菌酶蛋白的基因，其特征在于，其是按照瑞氏木霉偏愛的密碼子優(yōu)化過的、編碼或至少部分編碼T4溶菌酶蛋白的基因。2.如權利要求1所述的基因，其特征在于，所述的T4溶菌酶蛋白一級結構為SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。3.如權利要求1或2所述的基因，其特征在于，其具有或至少部分具有SEQIDN0.2所示的核苷酸序列。4.權利要求1-3任一項所述的基因用于構建高效表達和生產T4溶菌酶的重組瑞氏木毒o5.一種通過重組瑞氏木霉以誘導型方式高效表達和生產T4溶菌酶的方法，包括T4溶菌酶外源基因的人工合成、高效表達載體的構建、高表達木霉重組子的篩選、重組瑞氏木霉工程菌的發(fā)酵以及外源重組蛋白的誘導表達和純化，其特征在于所述T4溶菌酶外源基因為權利要求1-3任一項所述的基因；構建高效表達載體時采用瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因啟動子。6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，在構建高效表達載體時，用瑞氏木霉纖維二糖水解酶1基因啟動子或終止子序列作為同源序列將T4溶菌酶基因整合到瑞氏木霉基因組內。7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，在構建高效表達載體時，采用的起始載體為PPIC9K。8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述T4溶菌酶外源基因的5’端前添加了瑞氏木霉纖維二糖水解酶1分泌信號肽的編碼序列。9.一種重組T4溶菌酶蛋白的表達質粒載體，其特征在于其為質粒圖譜如附圖2所示的載體T4-CBH9K。10.一種表達重組T4溶菌酶蛋白的工程菌株，其特征在于，包含權利要求9所述的表達質粒載體。11.根據權利要求10所述的工程菌株，其特征在于，宿主細胞是瑞氏木霉菌株QM9414或其它能夠表達外源蛋白的瑞氏木霉菌株。12.采用權利要求10或11所述的工程菌株發(fā)酵生產重組蛋白的方法，包括(1)種子液制備首先將菌絲接種于PDA培養(yǎng)基上，2728°C培養(yǎng)67天，再將孢子溶于無菌水中，以12%體積比接種于液體匪培養(yǎng)基中，2728°C振蕩培養(yǎng)7296小時，作為高密度發(fā)酵的種子液；(2)菌體培養(yǎng)向匪培養(yǎng)基中按810%的比例接種步驟(1)的木霉種子液，2728°C通氣攪拌培養(yǎng)7296小時，pH維持在5.56；(3)蛋白誘導表達菌體培養(yǎng)7296小時后，流加溶解在MM培養(yǎng)基中50wt%的纖維素，使培養(yǎng)基纖維素濃度維持在23wt%，溶氧量大于20%，溫度維持在2728°C，pH維持在5.56，繼續(xù)振蕩誘導培養(yǎng)34天；在上述過程中用到的匪培養(yǎng)基配方為每升含葡萄糖20g、(NH4)2S045g、KH2P0415g、MgS047H200.6g、CaCl20.6g、FeS047H200.005g、MnS04H200.0016g、ZnS047H200.0014g、CoCl20.002g,pH5.5。全文摘要本發(fā)明公開了一種在瑞氏木霉中以誘導型方式表達和生產T4溶菌酶重組蛋白的方法，其中包括1)使用密碼子得到優(yōu)化、人工合成的T4溶菌酶基因以提高其在瑞氏木霉工程菌中的生物產量；2)采用瑞氏木霉來源的纖維二糖水解酶基因啟動子或終止子序列作為外源質粒載體整合到瑞氏木霉基因組中的同源序列；3)采用瑞氏木霉纖維二糖水解酶基因啟動子調控T4溶菌酶外源基因在瑞氏木霉中以誘導型方式高效表達；4)特定的瑞氏木霉工程菌發(fā)酵培養(yǎng)生長條件以提高T4溶菌酶重組蛋白的生物產量以及快速提純該重組外源蛋白的方法，而由此方法制備的T4溶菌酶重組蛋白純品具有生物活性，可廣泛應用于醫(yī)療、食品、飼料以及科研等領域。文檔編號C12N1/15GK101831452SQ20101015845公開日2010年9月15日申請日期2010年4月22日優(yōu)先權日2010年4月22日發(fā)明者劉德虎,李剛強,王楠申請人:中國農業(yè)科學院生物技術研究所