專利名稱：病毒檢測方法和用于使病毒核酸游離的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在同一溶液中從可能含有選自B型肝炎病毒、C型肝炎病毒和人 類免疫缺陷病毒中的至少1種病毒的生物學(xué)樣品中特異性地分離病毒核酸然后進(jìn)行檢測 的方法，以及在該方法中使用的用于使病毒核酸游離的組合物。
背景技術(shù)：
以往，為了檢測病毒而分離核酸的方法因各個(gè)病毒而不同(例如，參見專利文獻(xiàn) 1)。為了同時(shí)檢測B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)等 多種病毒，在同一溶液中使核酸從各自病毒中游離出來的操作是必須的。但是，HBV的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜(以下，也合稱為“膜”)比其它病毒堅(jiān)固，因此為了 將HBV膜溶解而將核酸分離，必須使用苛刻的條件，例如添加高濃度改性劑、在高溫或堿性 環(huán)境下進(jìn)行等。另一方面，C型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒的膜在物理化學(xué)方面脆弱，因此上述 HBV膜的溶解條件過于苛刻。另外，由C型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒中分離出的核酸為 核糖核酸(RNA)，因此在上述HBV膜的溶解條件下游離的RNA分子被分解而形成短的片段， 結(jié)果妨礙基因的檢測。對使HBV膜與HCV膜、HIV膜的溶解條件相同的方法正在研究中，一般探討利用蛋 白質(zhì)分解酶的酶法。但是，在利用蛋白質(zhì)分解酶的酶法中，在用后續(xù)的基因擴(kuò)增反應(yīng)檢測游 離的病毒核酸時(shí)，蛋白質(zhì)分解酶將作用于基因擴(kuò)增反應(yīng)的酶分解，因此存在無法檢測核酸 的可能。即，存在這樣的致命缺陷溶解病毒的膜所必須的蛋白質(zhì)分解酶在后續(xù)的核酸檢測 反應(yīng)中變?yōu)樽璧K物質(zhì)。另一方面，還提出在病毒溶出后，用熱、堿使蛋白質(zhì)分解酶失活，然后進(jìn)入后續(xù)反 應(yīng)的方法。但是，如果用熱或堿等物理化學(xué)的方法使這些蛋白質(zhì)分解酶失活，則已經(jīng)游離的 C型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒的RNA也同時(shí)分解，結(jié)果存在無法檢查病毒基因的問題。如上所述，將B型肝炎病毒的膜溶解而使病毒核酸游離，同時(shí)將C型肝炎病毒、人 類免疫缺陷病毒的膜溶解而使病毒核酸游離，使用這些病毒核酸進(jìn)行基因檢查的技術(shù)現(xiàn)在 尚未確立。專利文獻(xiàn)1 日本特表2005-505289號公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種同時(shí)且簡便地從可能含有選自B型肝炎病毒、C型肝 炎病毒和人類免疫缺陷病毒中的至少1種病毒的生物學(xué)樣品中特異性地分離出病毒核酸 進(jìn)行檢測的方法，以及在該方法中使用的用于使病毒核酸游離的組合物。本發(fā)明是為解決上述課題的至少一部分而作出的發(fā)明，能夠以下述方式或適用例 加以實(shí)現(xiàn)。[適用例1]
本發(fā)明的病毒檢測方法的一個(gè)方式為 在同一溶液中從可能含有至少1種病毒的生物學(xué)樣品中特異性地分離出病毒核 酸后進(jìn)行檢測的方法，其包含以下工序(a)將所述生物學(xué)樣品和用于使病毒核酸游離的組合物混合的工序，(b)在所述工序(a)的混合物中，添加能夠與所述病毒核酸的至少一部分序列雜 交、且至少一方的末端被生物素化的寡核苷酸的工序，(c)在所述工序(b)的混合物中，添加固相載體的工序，所述固相載體表面固定有 抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素，(d)從所述工序(C)的混合物中將所述固相載體分離的工序，(e)使用所述固相載體的水分散液用核酸擴(kuò)增法檢測所述病毒核酸的工序；所述組合物含有選自硫氰酸胍、鹽酸胍和碘化鈉中的至少一種離液劑，陰離子性 表面活性劑和還原劑；所述工序(a)的混合物中的所述陰離子性表面活性劑的濃度為2. 5 質(zhì)量％ 30質(zhì)量％。[適用例2]在適用例1中，檢測的病毒可以為選自B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV) 和人類免疫缺陷病毒(HIV)中的至少一種。[適用例3]在適用例1或適用例2中，所述工序(e)可以進(jìn)一步包含向所述工序(d)得到的 固相載體添加溶出液、將所述病毒核酸溶出的工序。[適用例4]在適用例1或2中，所述工序(e)可以包含使用所述工序(d)得到的固相載體，不分離病毒核酸，而用 核酸擴(kuò)增法檢測每個(gè)固相載體的工序。[適用例5]本發(fā)明所的病毒檢測方法的一個(gè)方式為在同一溶液中從可能含有至少1種病毒的生物學(xué)樣品中特異性地分離出病毒核 酸后進(jìn)行檢測的方法，其包含以下工序(f)將所述生物學(xué)樣品和用于使病毒核酸游離的組合物混合，制備混合物的工 序；(g)在所述工序(f)的混合物中，添加固相載體并進(jìn)行分散的工序，所述固相載體 表面結(jié)合有與所述病毒核酸的至少一部分序列雜交的寡核苷酸；(h)從所述工序(g)的混合物中將所述固相載體分離，用洗凈緩沖液使所述固相 載體再分散，得到所述固相載體的水分散液的工序；和(i)使用所述固相載體的水分散液，用核酸擴(kuò)增法檢測所述病毒核酸的工序。所述組合物含有選自硫氰酸胍、鹽酸胍和碘化鈉中的至少一種離液劑，陰離子性 表面活性劑和還原劑；所述工序(f)的混合物中的所述陰離子性表面活性劑的濃度可以為 5質(zhì)量％ 30質(zhì)量％。[適用例6]在適用例5中，檢測的病毒可以為選自B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)中的至少一種。[適用例7]在適用例5或適用例6中，所述工序⑴可以進(jìn)一步包含在所述工序(h)得到的 固相載體的水分散液中添加溶出液，將所述病毒核酸溶出的工序。[適用例8]在適用例5或適用例6中，所述工序⑴可以包含使用所述工序(h)得到的固相 載體的水分散液，不分離病毒核酸，而用核酸擴(kuò)增法檢測每個(gè)固相載體的工序。[適用例9]在適用例1 適用例8的任一例中，所述固相載體可以為具有0. 5 ii m 15 ii m的 平均粒徑，且能夠用重力或離心力進(jìn)行固液分離的粒子。[適用例10]在適用例1 適用例8的任一例中，所述固相載體可以為具有0. 5 ii m 15 ii m的 平均粒徑、且能夠用電磁力進(jìn)行固液分離的粒子。[適用例11]本發(fā)明的用于使病毒核酸游離的組合物，含有選自硫氰酸胍、鹽酸胍和碘化鈉中 的至少一種的離液劑，陰離子性表面活性劑，和還原劑；所述陰離子性表面活性劑的濃度為 2. 5質(zhì)量％ 30質(zhì)量％。[適用例12]在適用例11中，所述陰離子性表面活性劑可以包含選自烯基琥珀酸二鉀、N-十二 烷基肌氨酸鈉、烷基醚羧酸鹽、烷酰基谷氨酸鹽和聚氧乙烯烷基醚磷酸鉀中的至少1種。[適用例13]在適用例11或適用例12中，所述還原劑可以包含選自2-巰基乙醇、硫甘油、二硫 蘇糖醇、2-巰基乙胺鹽酸鹽、三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽、巰基乙酸和2-巰基丙酸中的至少 1種。根據(jù)上述的病毒檢測方法，可以同時(shí)且簡便地在同一溶液中從可能含有選自B型 肝炎病毒、C型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒中的至少1種病毒的生物學(xué)樣品中特異性地 分離出病毒核酸，檢測病毒。
具體實(shí)施例方式以下，對于本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，進(jìn)行詳細(xì)說明。1.病毒的檢測方法1. 1第一實(shí)施方式本發(fā)明第1實(shí)施方式的病毒檢測方法為，在同一溶液中從可能含有選自B型肝炎 病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)中的至少1種的病毒的生物學(xué) 樣品中特異性地分離病毒核酸，然后進(jìn)行檢測的方法，其包含以下工序(a)將所述生物學(xué)樣品和用于使病毒核酸游離的組合物混合，制備混合物的工 序；(b)在所述工序(a)的混合物中，添加能夠與所述病毒核酸的至少一部分序列雜 交、且至少一方的末端被生物素化的寡核苷酸，將該混合物升降溫的工序；
(c)在所述工序(b)的混合物中，添加表面固定有抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素的固相載體并進(jìn)行分散的工序；(d)從所述工序(C)的混合物中將所述固相載體分離，用洗凈緩沖液使所述固相 載體再分散，得到所述固相載體的水分散液的工序；和(e)使用所述固相載體的水分散液、用核酸擴(kuò)增法檢測所述病毒核酸的工序。所述組合物含有選自硫氰酸胍、鹽酸胍和碘化鈉中的至少一種的離液劑，陰離子 性表面活性劑和還原劑。根據(jù)本發(fā)明的病毒檢測方法，可以在同一溶液中從可能含有選自B型肝炎病毒、 C型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒中的至少1種的病毒的生物學(xué)樣品中特異性地分離病毒 核酸，檢測病毒。在本發(fā)明中，“生物學(xué)樣品”是指，動植物組織、細(xì)胞裂解液、血液、血漿、血清、尿、 唾液等各種體液，培養(yǎng)細(xì)胞裂解液等，可以列舉可能存在病毒的物質(zhì)。這樣的樣品可以是采 取后原樣的狀態(tài)，也可以是用緩沖液等稀釋的狀態(tài)。以下，對各工序進(jìn)行詳細(xì)說明。1. 1. 1.工序(a)本工序?yàn)閷⑸鲜錾飳W(xué)樣品與用于使病毒核酸游離的組合物混合，制備混合物， 由上述生物學(xué)樣品中所含的病毒使核酸游離的工序。以下，對在本工序中使用的用于使病毒核酸游離的組合物(以下，也簡稱為“組合 物”)進(jìn)行說明。用于本工序的組合物通過與可能含有選自B型肝炎病毒、C型肝炎病毒和人類免 疫缺陷病毒中的至少1種病毒的生物學(xué)樣品混合，能夠?qū)⒉《灸と芙馐共《竞怂嵊坞x于溶 液中。上述組合物為至少含有離液劑、陰離子性表面活性劑和還原劑的水溶液。上述組合物含有選自硫氰酸胍、鹽酸胍和碘化鈉中的至少一種作為上述離液 齊U。離液劑的含量為，在使用硫氰酸胍時(shí)，作為與上述生物學(xué)樣品混合后的濃度，優(yōu)選為 0. 5M 6. 0M，更優(yōu)選為0. 8M 5. 5M，特別優(yōu)選為1. OM 5. OM0在使用鹽酸胍時(shí)的含量為， 作為與上述生物學(xué)樣品混合后的濃度，優(yōu)選為0. 5M 8. 0M,更優(yōu)選為1. OM 7. 5M，特別優(yōu) 選為1. 5M 7. 0M。在使用碘化鈉時(shí)的含量為，作為與上述生物學(xué)樣品混合后的濃度，優(yōu)選 為3. OM 8. 0M,更優(yōu)選為4. OM 7. 5M，特別優(yōu)選為5. OM 7. 0M。如果離液劑含量在上 述范圍內(nèi)，則可以可靠地溶解HBV、HCV和HIV的膜，且由HCV和HIV游離出來的病毒RNA不 會被分解。如果離液劑含量低于上述下限，則存在無法使HBV膜完全溶解，或者由HCV、HIV 游離出來的RNA被分解RNA的酶RNase分解的可能。另一方面，如果離液劑含量超過上述 上限，則用于使病毒核酸游離的組合物的制備變得困難，即使能夠制備用于使病毒核酸游 離的組合物其粘性也變高，難以準(zhǔn)確稱量，因此不實(shí)用，不優(yōu)選。此外，尿素作為離液劑是眾 所周知的，但由于具有阻礙在后述工序(b)中要分離的病毒核酸的雜交的作用，因此不適 用于本發(fā)明。作為上述陰離子性表面活性劑，優(yōu)選一般具有作為親水性基團(tuán)的磺酸基、羧基、磷 酸基等的物質(zhì)。作為具有磺酸基的物質(zhì)，例如可以列舉十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鹽 等。作為具有羧基的物質(zhì)，例如可以列舉烯基琥珀酸二鉀、烷基醚羧酸鹽、烷?；劝彼猁}、N_十二烷基肌氨酸鈉等。作為具有磷酸基的物質(zhì)，例如可以列舉聚氧乙烯烷基醚磷酸鉀等。 這些陰離子性表面活性劑可以單獨(dú)使用1種或?qū)?種以上組合使用。陰離子性表面活性劑適合作為上述組合物中的成分的理由是，可以列舉對病毒膜 的乳液形成能力高，容易滲透病毒膜。而且，通過使用陰離子性表面活性劑，可期待其對寡 核苷酸與病毒核酸的雜交反應(yīng)有促進(jìn)效果。陰離子性表面活性劑的含量以與上述生物學(xué)樣品混合后的濃度計(jì)，為2. 5質(zhì) 量％ 30質(zhì)量％。如果陰離子性表面活性劑的含量在上述范圍內(nèi)，則會得到溶解作為目標(biāo) 的3種病毒(HBV、HCV、HIV)的膜、有助于病毒核酸游離的效果。如果陰離子性表面活性劑 的含量低于上述范圍，則存在無法將病毒膜乳液化、使其溶解的情況。如果陰離子性表面活 性劑的含量超過上述范圍，則用于使病毒核酸游離的組合物的粘性增高，難以準(zhǔn)確地稱量， 因此在實(shí)用上不優(yōu)選。作為上述還原劑，列舉2-巰基乙醇、硫甘油、二硫蘇糖醇、2-巰基乙胺鹽酸鹽、三 (2-羧基乙基)膦鹽酸鹽、巰基乙酸和2-巰基丙酸，可以單獨(dú)使用1種或?qū)?種以上組合使 用。如果添加上述例示的還原劑，則可以使病毒膜或病毒蛋白質(zhì)中的-S-S-鍵解離，形成2 個(gè)-SH鍵。由此，病毒蛋白質(zhì)的超級結(jié)構(gòu)被分解，通過上述組合物病毒蛋白質(zhì)變得更容易變 性。還原劑的含量以與上述生物學(xué)樣品混合后的濃度計(jì)，優(yōu)選為0. 05質(zhì)量％ 20質(zhì) 量％，更優(yōu)選為0. 01質(zhì)量％ 10質(zhì)量％。如果還原劑的含量少于上述范圍，則上述還原作 用不足，不優(yōu)選。另一方面，如果還原劑的含量超過上述范圍，則實(shí)際效果不變，未發(fā)現(xiàn)更好 的效果，因此不優(yōu)選。在上述組合物中，根據(jù)需要還可以添加乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合劑。有時(shí)在生 物學(xué)樣品中會混入有分解RNA的稱為RNase的酶，通過溶解HCV或HIV的膜而得到的RNA 會被該RNAase分解。此時(shí)，由于多種RNAase表現(xiàn)出鎂依賴性，因此能夠通過添加螯合劑來 抑制RNA的分解。螯合劑的含量優(yōu)選為0M 1M。如果超過1M，實(shí)際效果不變，未發(fā)現(xiàn)更好 的效果，因此不優(yōu)選。上述組合物的pH優(yōu)選為5. 0 10. 0，更優(yōu)選為6. 0 9. 0。上述組合物的pH調(diào) 節(jié)可以通過使用通常在生化領(lǐng)域使用的Good’ s緩沖液而容易地實(shí)現(xiàn)。作為Good’ s緩沖 液，例如列舉三羥甲基氨基甲烷緩沖液等。以上說明的用于使病毒核酸游離的組合物不僅可以用于本工序，還可以用于其它 用途，只要該用途的目的是從可能含有選自B型肝炎病毒、C型肝炎病毒和人類免疫缺陷病 毒中的至少1種病毒的生物學(xué)樣品中將上述病毒的膜溶解并使病毒核酸游離即可。1. 1. 2.工序(b)本工序?yàn)樵谏鲜龉ば?a)的混合物中，添加能夠與所述病毒核酸的至少一部分序 列雜交，且至少一方的末端被生物素化的寡核苷酸(以下，也簡稱為“寡核苷酸”)，將該混 合物升降溫的工序。寡核苷酸的添加量優(yōu)選為0. 5pmol 400pmol，更優(yōu)選為5pmol lOOpmol。如果 寡核苷酸的添加量少于上述范圍，則雜交的量不足，不優(yōu)選。另一方面，如果寡核苷酸的添 加量超過上述范圍，則存在無法用抗生物素蛋白粒子捕捉的情況。將上述工序(a)的混合物與寡核苷酸混合后，將該混合物升溫進(jìn)行溫育，由此病毒膜的溶解加速。溫育的時(shí)間優(yōu)選為5 60分鐘，更優(yōu)選為10 30分鐘。溫育的溫度優(yōu) 選為30 85°C，更優(yōu)選為50 80°C。另外，為了使加熱均勻，根據(jù)需要也可以在加熱時(shí)緩 慢攪拌或振動。而且，在降溫到室溫時(shí)病毒核酸和寡核苷酸會雜交，將抗生物素蛋白導(dǎo)入核酸。1. 1. 3.工序(C) 本工序?yàn)?，在上述工?b)的混合物中，添加與生物素特異性反應(yīng)的表面固定有 抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素的固相載體并進(jìn)行分散的工序。通過抗生物素蛋白-生物 素反應(yīng)，特異性地捕捉病毒核酸是本發(fā)明的特征之一。由此，在后續(xù)的核酸擴(kuò)增法中不會被 其它夾雜核酸影響，能夠高效率地使目的病毒核酸擴(kuò)增。作為表面固定有抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素的固相載體，列舉以下示例的抗 生物素蛋白磁性粒子?？梢栽诒竟ば蚴褂玫目股锼氐鞍状判粤Ｗ拥钠骄絻?yōu)選為0. 1 μ m 20 μ m， 更優(yōu)選為0. 3 17 μ m，特別優(yōu)選為0. 5 μ m 10 μ m。如果抗生物素蛋白磁性粒子的平均 粒徑小于上述范圍，則存在粒子的分離純化需要長時(shí)間的情況。另一方面，如果超過上述范 圍，則表面積減小，病毒核酸的捕捉量不足，因此不優(yōu)選。此外，在本發(fā)明中，平均粒徑是指， 使用以動態(tài)光散射法為測定原理的粒徑分布測定裝置進(jìn)行測定的值?？股锼氐鞍状判粤Ｗ訛閼?yīng)答外部磁場的粒子，該粒子的固液分離操作可以通過 外部磁石進(jìn)行。因此，固液分離操作不只可以使用離心分離或自然沉淀這樣的手動方法，還 可以用裝備了磁石的市售自動儀器進(jìn)行。另外，優(yōu)選抗生物素蛋白磁性粒子為不具有剩余磁化的超常磁性。對于超常磁性 的抗生物素蛋白磁性粒子，如果施加外部磁場，則受磁場的影響而在磁場方向移動，但如果 屏蔽外部磁場，則由于失去剩余磁化，因此能夠不受抗生物素蛋白磁性粒子之間的影響，彼 此不凝聚地獨(dú)自運(yùn)動。由此，超常磁性的抗生物素蛋白磁性粒子具有以下優(yōu)點(diǎn)磁性分離后 的抗生物素蛋白磁性粒子的再分散容易實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的捕捉病毒核酸的過程中，通過使 用所述超常磁性的磁性粒子，容易洗落目的病毒核酸以外的不需要成分、夾雜物，以高效率 進(jìn)行后續(xù)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，可以捕捉數(shù)分子左右的極微量的病毒核酸并進(jìn)行分離、檢測。在本工序中可使用的抗生物素蛋白磁性粒子對將捕捉病毒核酸的操作自動化或 裝置化是有用的，但也可以用手動法進(jìn)行捕捉病毒核酸的操作。在手動法中，可以代替磁性 分離而利用離心分離或自然沉淀進(jìn)行分離，也可用非磁性粒子代替磁性粒子。1.1.4.工序(d)本工序?yàn)閺纳鲜龉ば?C)的混合物中將上述固相載體分離的工序。首先，通過工序(C)將含有捕捉病毒核酸的固相載體的混合物分離為固相載體和 其它液體，只回收捕捉病毒核酸的固相載體。由此，將混合物中的樣品所含的血清、血漿中 的蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)等成分或夾雜物除去。固相載體和其它液體的分離可以通過將混合物在 磁力架上靜置，磁性吸引固相載體來進(jìn)行固液分離，也可以用數(shù)千轉(zhuǎn)/分鐘左右的低速離 心分離進(jìn)行。在如上所述得到的固相載體的表面，除了目的病毒核酸之外，還含有游離的金屬 離子和蛋白質(zhì)，其它夾雜物。這些物質(zhì)在核酸檢測法中存在抑制核酸擴(kuò)增的情況。因此，在 本工序中，優(yōu)選用不引起核酸解離的洗凈緩沖液將固相載體洗凈。
洗凈緩沖液例如優(yōu)選以0. 5M 2. 0M左右的濃度含有NaCl、KCl等鹽。添加這種程 度的鹽具有將上述夾雜物中通過靜電相互作用而在固相載體表面吸附的成分除去的效果。 但鹽濃度低于0. 5M時(shí)，存在在固相載體表面配對并捕捉的病毒核酸會解離而失去，病毒核 酸的分離效率降低的情況。核酸的Watson-Crick堿基配對為在2根單鏈核酸中起作用的 堿基間的氫鍵產(chǎn)生的引力，與構(gòu)成核酸骨架的磷酸二酯基的陰離子性磷酸基間起作用的靜 電斥力的平衡中，堿基間的氫鍵產(chǎn)生的引力占優(yōu)勢時(shí)形成的。溶液的鹽濃度高時(shí)，溶液中的 鹽中和磷酸基間的靜電排斥，由此堿基間的氫鍵產(chǎn)生的引力占優(yōu)勢，促進(jìn)Watson-Crick堿 基配對的形成。在本發(fā)明中，室溫附近的溫度條件的情況、鹽濃度低于0. 5M的情況使磷酸 基間的靜電排斥占優(yōu)勢，寡核苷酸和病毒核酸的配對進(jìn)行解離，利用核酸配對的病毒核酸 的捕捉效率降低，結(jié)果存在病毒核酸的分離效率降低的情況。另一方面，在鹽濃度比2. 0M 高時(shí)，堿基間的氫鍵產(chǎn)生的引力占優(yōu)勢，寡核苷酸和病毒核酸的配對穩(wěn)定，但在除去洗凈緩 沖液之后，未除盡而微量殘留并進(jìn)入隨后工序的鹽使作為隨后工序(e)的任意工序的病毒 核酸的溶出工序的效率降低，因而不優(yōu)選。另外，洗凈緩沖液例如優(yōu)選以0. 01質(zhì)量％ 2. 0質(zhì)量％的濃度含有Triton X-100,Tween20等表面活性劑。添加這種程度的表面活性劑具有將上述夾雜物中通過疏水 性相互作用在磁性粒子表面吸附的成分除去的效果。洗凈緩沖液的pH優(yōu)選為5. 0 10. 0，更優(yōu)選為6. 0 9. 0。在本工序中還優(yōu)選，在用洗凈緩沖液洗凈固相載體之后，用洗凈緩沖液或后述的 溶出液將上述分離的固相載體再次分散，制成上述固相載體的水分散液。1. 1. 5.工序(e)本工序?yàn)橛煤怂釘U(kuò)增法檢測在工序(d)分離的病毒核酸的工序。在被捕捉于固相 載體的病毒核酸可以就按被捕捉于固相載體表面的(即，固相載體的水分散液)狀態(tài)進(jìn)入 PCR等核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系，進(jìn)行核酸擴(kuò)增。另一方面，也可以將被捕捉于上述磁性粒子表面的病毒核酸從磁性粒子中溶出， 然后用核酸擴(kuò)增法進(jìn)行檢測。經(jīng)過溶出工序，可以將病毒核酸作為水溶液回收，因此可以應(yīng) 對使用病毒核酸之類的應(yīng)用。這些方法可以根據(jù)使用的核酸擴(kuò)增裝置的種類、使用目的進(jìn)行適當(dāng)區(qū)分使用。一 般的，以就按被捕捉于磁性粒子表面的狀態(tài)進(jìn)入核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系的方法更為簡便。但是， 在使用實(shí)時(shí)熒光檢測裝置時(shí)，存在一部分機(jī)型中熒光信號被固相載體遮蔽或吸收，病毒核 酸的檢測效率降低的可能。將病毒核酸由固相載體溶出進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法具有增加病毒 核酸的溶出工序這一缺點(diǎn)，同時(shí)具有可靠消除PCR反應(yīng)的阻礙因素這一優(yōu)點(diǎn)。以下，對由固相載體將病毒核酸溶出的方法進(jìn)行說明。作為使病毒核酸由固相載體溶出時(shí)的溶出液，可以使用蒸餾水或堿性水溶液等的 能夠?qū)⑴鋵Φ牟《竞怂峤怆x的物質(zhì)。此外，還可以使用DEPC水、超純水等對后續(xù)的PCR酶 反應(yīng)不產(chǎn)生不良影響的物質(zhì)代替蒸餾水。在本發(fā)明中，添加蒸餾水以使固相載體的水分散 液的鹽濃度降低，由此能夠使與寡核苷酸配對的病毒核酸解離。此時(shí)，作為溶出液，優(yōu)選蒸 餾水，但作為不妨礙與寡核苷酸配對的病毒核酸的解離的范圍，還可以添加0. 2M以下濃度 的NaCl、KCl等鹽。另外，作為同樣不妨礙解離的范圍，還可以添加0. 2M以下濃度的三羥甲 基氨基甲烷等具有緩沖作用的鹽。此時(shí)，溶出液的PH優(yōu)選為5. 0 9. 0，更優(yōu)選為6. 0
108. 5。另外，為使固相載體的凝聚或?qū)υ嚬艿热萜鞯母街鵀樽钚∠薅?，還可以添加微量的表 面活性劑。具體地，可以添加0.01 0.5質(zhì)量％的Triton系、Briji系、Tween、NP40等的 表面活性劑。作為溶出液還可以使用堿性水溶液。堿性水溶液具有雙鏈核酸的變性作用，能夠 使核酸解離為單鏈。作為這樣的堿性水溶液，可以使用氫氧化鈉或氫氧化鉀的水溶液等。作 為氫氧化鈉或氫氧化鉀的濃度，優(yōu)選為30mM以下。在使用比30mM更濃的堿時(shí)，會導(dǎo)致核酸、 特別是病毒RNA的水解，病毒核酸的分離效率降低。將堿性水溶液用作溶出液時(shí)，與將蒸餾 水用作溶出液同樣，作為不妨礙核酸解離的范圍，也可以預(yù)先加入0. 2M以下濃度的NaCl、 KC1等鹽。為了將病毒核酸溶出，優(yōu)選在磁性粒子中加入溶出液然后溫育1分鐘 20分鐘左 右，在溫育中還可以攪拌樣品。作為溶出液，在使用蒸餾水時(shí)，作為促進(jìn)病毒核酸溶出的方 法，進(jìn)行加熱也是有效的。作為加熱方法，可以采用以下任意的方法使用預(yù)先加熱過(例 如70°C)的溶出液的方法、或在與固相載體混合后進(jìn)行加熱的方法。將堿性水溶液用作溶 出液時(shí)，存在加熱導(dǎo)致病毒核酸水解而喪失的可能性，必須注意加熱。另外，為了可靠地將病毒核酸溶出，將該溶出工序重復(fù)進(jìn)行2 3次也是有效的。在將堿性水溶液用作溶出液時(shí)，根據(jù)需要，還可以增加在核酸溶液回收后添加酸 性水溶液或具有緩沖作用的水溶液、中和PH的工序。通過以上得到的病毒核酸溶液可以用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)。作為核酸擴(kuò)增法， 沒有特別限定，但例如可以使用羅氏公司的PCR(Polymerase chainreaction)法、 Gen-Probe 公司的 TMA (Transcription mediatedamplif ication-hybridizatio n protection assay)法、雅培公司的 LCR(Ligase chain reaction)法、榮石if 化 學(xué)社的 LAMP(Loop-mediatedisothermal amplification of DNA)法、寶酒造社的 ICAN(Isothermal andchimeric primer-initiated amplification of nucleic acid)夕去寸。本發(fā)明的病毒檢測方法主要可以用于輸血血液或血液制劑的病毒篩選。本發(fā)明的 病毒檢測方法可以在人工操作中進(jìn)行，但多數(shù)是在用于集中處理大量的樣品的專用裝置中 使用。本發(fā)明的病毒檢測方法和用于使病毒核酸游離的組合物也可以適用于人工操作及自 動儀器操作的任意的方法。1.2.第二實(shí)施方式本發(fā)明的第2實(shí)施方式的病毒檢測方法為，在同一溶液中從可能含有選自B型肝 炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)中的至少1種病毒的生物學(xué) 樣品中特異性地分離病毒核酸，然后進(jìn)行檢測的方法，其包含以下工序(f)將所述生物學(xué)樣品和用于使病毒核酸游離的組合物混合，制備混合物的工序，(g)在所述工序(f)的混合物中，添加固相載體并進(jìn)行分散的工序，所述固相載體 使與所述病毒核酸的至少一部分序列雜交的寡核苷酸結(jié)合于表面，(h)由所述工序(g)的混合物將所述固相載體分離，用洗凈緩沖液使所述固相載 體再分散，得到所述固相載體的水分散液的工序，和(i)使用所述固相載體的水分散液，用核酸擴(kuò)增法檢測所述病毒核酸的工序；所述組合物含有選自硫氰酸胍、鹽酸胍和碘化鈉中的至少一種的離液劑，陰離子性表面活性劑和還原劑。以下，對各工序進(jìn)行詳細(xì)說明。1.2.1.工序江)本工序?yàn)閷⑸鲜錾飳W(xué)樣品和用于使病毒核酸游離的組合物混合，制備混合物的 工序，與第1實(shí)施方式中的工序(a)相同。1.2.2.工序(8)本工序?yàn)樵谒龉ば?f)的混合物中，添加固相載體并進(jìn)行分散的工序，所述固 相載體使與上述病毒核酸的至少一部分序列雜交的寡核苷酸結(jié)合于表面。特異性地捕捉病 毒核酸是本發(fā)明的特征之一。由此，在后續(xù)的核酸擴(kuò)增法中不被其它夾雜核酸影響，能夠高 效率地使目的病毒核酸擴(kuò)增。作為在本工序中可使用的固相載體，列舉以下示例的探針結(jié)合磁性粒子。作為在本工序中可使用的探針結(jié)合前的磁性粒子的平均粒徑，優(yōu)選為0. lym 20 u m,更優(yōu)選為0. 3 ii m 17 ii m，特別優(yōu)選為0. 5 y m 10 y m。如果磁性粒子的平均粒徑 低于上述范圍，則存在粒子的分離純化需要長時(shí)間的情況。另一方面，如果超過上述范圍， 則表面積減小，病毒核酸的捕捉量不足，因此不優(yōu)選。此外，在本發(fā)明中，平均粒徑是指，使 用以動態(tài)光散射為測定原理的粒徑分布測定裝置進(jìn)行測定的值。在本工序中可使用的磁性粒子為應(yīng)答外部磁場的粒子，該粒子的固液分離操作可 以通過外部磁石進(jìn)行。因此，固液分離操作不只可以使用離心分離或自然沉淀這樣的手動 方法，還可以用裝備了磁石的市售自動儀器進(jìn)行。在本工序中可使用的磁性粒子優(yōu)選為不具有剩余磁化的超常磁性。對于超常磁 性的磁性粒子，如果施加外部磁場，則受磁場的影響而在磁場方向移動，但如果屏蔽外部磁 場，則失去剩余磁化，因此能夠不受磁性粒子之間的影響，彼此不凝聚地獨(dú)自運(yùn)動。由此，超 常磁性的磁性粒子具有以下優(yōu)點(diǎn)磁性分離后的磁性粒子的再分散容易實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的 捕捉病毒核酸的過程中，通過使用所述超常磁性的磁性粒子，容易洗落目的病毒核酸以外 的不需要成分或夾雜物，以高效率進(jìn)行后續(xù)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，可以捕捉數(shù)分子左右的極微 量的病毒核酸而進(jìn)行分離、檢測。在本工序中可使用的磁性粒子的含有率由用裝備磁石的自動裝置進(jìn)行操作的觀 點(diǎn)來看，優(yōu)選為20質(zhì)量％ 70質(zhì)量％，更優(yōu)選為30質(zhì)量％ 60質(zhì)量％。如果磁性粒子的 含有率不足上述范圍，則通常對于外部磁場的磁性應(yīng)答性減弱，難于使用，因此不優(yōu)選。另 一方面，如果磁性粒子的含有率超過上述范圍，則磁性粒子的比重過大，在反應(yīng)途中產(chǎn)生自 然沉淀，因此不優(yōu)選。作為在本工序中可使用的磁性粒子的材質(zhì)，優(yōu)選選自Fe203和Fe304中的至少一種。 這些材質(zhì)不僅對外部磁場的磁性應(yīng)答性強(qiáng)，還可以抑制剩余磁化?？稍诒竟ば蛑惺褂玫拇判粤Ｗ佑捎煤怂釘U(kuò)增法檢測捕捉的病毒核酸的觀點(diǎn)來看， 優(yōu)選不阻礙核酸擴(kuò)增酶的作用。因此，能夠在磁性粒子的表面形成聚合物覆層而不使磁性 粒子表面露出。作為構(gòu)成該聚合物覆層的聚合物，例如列舉乙烯基類聚合物。另外，通過適 當(dāng)調(diào)節(jié)上述磁性粒子和上述聚合物成分的配合比例，可以控制磁性粒子的比重。此外，對于磁性體和聚合物在粒子內(nèi)部的分布，沒有特別限定，兩者可以均勻分 布，也可以是在聚合物核上形成磁性體殼的形狀。
在可在本工序中使用的磁性粒子中，為了捕捉病毒核酸，必須使寡核苷酸結(jié)合于 該粒子的表面。因此，優(yōu)選在該粒子表面導(dǎo)入可與寡核苷酸反應(yīng)的官能團(tuán)。作為這樣的官 能團(tuán)，例如列舉羧基、氨基、對甲苯磺?；h(huán)氧基等。這些官能團(tuán)可以在上述聚合物覆層的 聚合階段導(dǎo)入，或者也可以在上述聚合物覆層的聚合反應(yīng)完成后再次用聚合物將該粒子表 面包覆時(shí)導(dǎo)入。在上述聚合物覆層的聚合階段進(jìn)行導(dǎo)入時(shí)，例如可以使用丙烯酸、甲基丙烯 酸、衣康酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-羥甲基丙烯酰胺、N-羥甲基甲基丙烯酰胺、鄰苯二 甲酸二烯丙酯、丙烯酸烯丙酯、甲基丙烯酸烯丙酯等構(gòu)成乙烯基類聚合物的乙烯基單體與 可共聚單體的共聚物。作為形成聚合物覆層時(shí)的導(dǎo)入方法，可以使用通常的有機(jī)化學(xué)合成 法來導(dǎo)入。可在本工序中使用的磁性粒子對將捕捉病毒核酸的操作自動化或裝置化是有用 的，但也可以用手動法進(jìn)行捕捉病毒核酸的操作。在手動法中，可以代替磁性分離而利用離 心分離或自然沉淀進(jìn)行分離，也可用非磁性粒子代替磁性粒子。在本工序中可使用的探針結(jié)合磁性粒子是指，將用于捕捉病毒核酸的探針結(jié)合于 上述磁性粒子的表面而得到的產(chǎn)物?！疤结槨笔侵?，含有與由病毒游離的目的核酸的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的寡核苷酸?！半s交”是指，通過Watson-Crick堿基配對，目的核酸與寡核苷酸互補(bǔ)地形成復(fù)合 體。雜交的序列并非必須具有完全互補(bǔ)的關(guān)系。例如，即使在堿基序列中小于約10%的序 列不一致的情況下，也可以形成穩(wěn)定的復(fù)合體?！疤禺愋缘夭蹲讲《竞怂帷辈⒉槐硎臼构押塑账?00%—致，而是表示在捕捉條件 中能夠與磁性粒子探針形成穩(wěn)定的復(fù)合體的程度。作為使寡核苷酸結(jié)合于上述磁性粒子的表面的方法，列舉使導(dǎo)入至磁性粒子表 面的官能團(tuán)與寡核苷酸的官能團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而固定的方法。例如有以下方法使用 ￡0〇(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽)等偶聯(lián)劑，使以氨基修飾過單側(cè) 末端(例如3’末端)的寡核苷酸探針與表面具有羧基的磁性粒子反應(yīng)的方法。另外，還有以下方法首先使抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素在磁性粒子上固定 然后使其與生物素化的探針結(jié)合。所述方法具有以下優(yōu)點(diǎn)在一次化學(xué)反應(yīng)中能夠使抗生 物素蛋白在磁性粒子上固定，然后不影響探針序列地將探針小心地固定。作為使生物素化 的探針與抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素化的磁性粒子結(jié)合的方法，有以下方法在水溶 液中，使以抗生物素蛋白基團(tuán)修飾單側(cè)末端(例如3’末端)的寡核苷酸探針與將抗生物素 蛋白或抗生蛋白鏈菌素分子在表面固定化的磁性粒子反應(yīng)。根據(jù)現(xiàn)有的方法，為了使病毒核酸與結(jié)合至磁性粒子的表面的寡核苷酸雜交，在 工序(g)中，必須進(jìn)一步添加雜交用的結(jié)合液。根據(jù)本發(fā)明，在工序(f)中使用的用于使病 毒核酸游離的組合物即使在工序(g)中也能直接用于與病毒核酸的雜交反應(yīng)。即，上述組 合物不僅具有使核酸由病毒游離的作用，而且同時(shí)具備促進(jìn)病毒核酸與結(jié)合至磁性粒子的 表面的寡核苷酸的雜交的作用。在磁性粒子上被固定的探針量相對于lmg磁性粒子，優(yōu)選為lpmol 500pmol， 更優(yōu)選為5pmol 200pmol。如果不足上述范圍，則目的病毒核酸的捕捉率降低因此不優(yōu) 選。如果超過上述范圍，則目的病毒核酸的捕捉率不變，不能期望更好的效果，因此不優(yōu)選。
13磁性粒子上的探針固定量可以這樣得到用吸光光度計(jì)測定與磁性粒子反應(yīng)后的探針殘留 量，由探針添加量和探針殘留量的差求出。另外，探針量還可以通過以下求出測定與用熒 光、放射性同位素等標(biāo)記的互補(bǔ)鏈寡核苷酸雜交而捕捉的物質(zhì)。此外，在本發(fā)明中，可以將 這些HBV、HCV、HIV捕捉用探針粒子事先以一定比例混合然后進(jìn)行使用。當(dāng)然，根據(jù)目的，例 如在只檢測HBV時(shí)，可以只使用將捕捉HBV的探針固定化的磁性粒子。1.2.3.工序00本工序?yàn)橛缮鲜龉ば?g)的混合物將固相載體分離的工序，與第1實(shí)施方式中的 工序(d)相同。1.2.4.工序⑴本工序?yàn)槭褂蒙鲜龉滔噍d體的水分散液，用核酸擴(kuò)增法檢測上述病毒核酸的工 序，與第1實(shí)施方式中的工序(e)相同。以上，以B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)為 例對病毒檢測方法進(jìn)行詳細(xì)說明，但也可以用于流感病毒、肺炎病毒、風(fēng)疹病毒、麻疹病毒 等其它病毒。2.實(shí)施例以下，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限定。2. 1. HBV、HCV、HIV探針結(jié)合磁性粒子的制備取結(jié)合了抗生蛋白鏈菌素的磁性粒子Magnosphere M300/Str印tavidin(JSR株 式會社制)的1質(zhì)量％分散液500 u L于試管中，于磁力架上進(jìn)行磁性分離，除去上清液。 以含有 0. 5mM EDTA 和 1. 0M NaCl 的 5mM 的 Tris-HCl (pH7. 4)洗凈 3 次后，在 500 u L 的含 有0. 5mM EDTA和1. 0M NaCl的5mM的Tris-HCl (pH7. 4)緩沖液中分散，分別加入5 ii L下 述HBV、HCV、HIV病毒核酸捕捉DNA探針的100 u M溶液，在室溫下攪拌30分鐘。各病毒捕 捉用探針DNA使用將向Operon Biotechnologies公司特別訂購的定制DNA進(jìn)行HPLC純化 后得到的探針DNA。之后，以磁力架進(jìn)行磁性分離，除去上清液。以含有0. 5mM EDTA和1. 0M NaCl的 5mM的Tris-HCl (pH7. 4)洗凈5次后，在50 y L的5mM Tris-HCl緩沖液中分散，得到捕捉各 病毒的磁性粒子(以下，分別簡稱為HBV-粒子、HCV-粒子、HIV-粒子)分散液(10質(zhì)量％)。 由添加前的寡核苷酸探針溶液的吸光度A260與反應(yīng)后磁性粒子上清液的吸光度A260，測 得相對于每lmg磁性粒子，HBV探針為50pmol、HCV探針為60pmol、HIV探針為40pmol。[HBV捕捉探針序列]:S'-TCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTT T T T C T-生物素3，(以下，稱為“序列1，，)[HCV捕捉探針序列]5'-GTGAAGACAGTAGTTCCTCACAGGGGAGTGATCT A-生物素3’(以下，稱為“序列2”)[HIV捕捉探針序列]5'-TTATGTCCAGAATGCTGGTAGGGCTATACATTCT T A C-生物素3’(以下，稱為“序列3”)上述HCV探針序列使用了對現(xiàn)有專利文獻(xiàn)日本特開平10-1493號公報(bào)中記載的序列作了部分修改的序列。上述HIV 探針序列為現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)“Tano，H. et. al. Journal ofClinical Microbiology, Sept. 1995，p. 2489-2491” 中記載的序列。2.2.用于使病毒核酸游離的組合物的制備作為用于使病毒核酸游離的組合物，將各試劑混合，使其濃度為下表1 表2記載 的濃度，用蒸餾水溶解。用注射管式過濾器(0. 45 um)將該組合物過濾，遮光保存直至使用 時(shí)為止。此外，各試劑的添加順序沒有特別限定。另外，對于難溶于蒸餾水的成分，升溫到 50°C緩慢地進(jìn)行溶解。[表1] [表 2]
2.3.實(shí)施例和比較例2. 3.1.實(shí)施例 1由含有HBV (亞型C)、HCV (亞型Ib)和HIV (亞型B)的血漿分別混合特定量，用病 毒陰性血漿進(jìn)行稀釋，由此制備分別以103IU/mL含有各病毒的樣品、以102IU/mL含有各病 毒的樣品、以10IU/mL含有各病毒的樣品。此外，為了確認(rèn)配制的各病毒濃度，與由NIBSC 公司購入的WHO標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)并列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用修正過濃度偏差的樣品。分別取這些樣品 和病毒陰性血漿各250 μ L至試管中，等容量加入上述“2. 2.用于使病毒核酸游離的組合物 的制備”中制備的“組合物Α” 250 μ L(以上為工序(a))。接著，加入上述序列1、上述序列2、上述序列3的寡核苷酸的各自配制為IOpmol/ μ L的溶液5μ L，在75°C加熱12分鐘后，冷卻至25°C (以上為工序(b))。接著，在各試管中加入Magnosphere M300/Str印tavidin (JSR株式會社制)4質(zhì) 量％的粒子分散液50μ L，在25°C溫育10分鐘，由此通過抗生物素蛋白_生物素反應(yīng)將由 樣品游離的源自病毒的核酸捕捉到粒子上(以上為工序(c))。接著，在磁力架上設(shè)置試管，將樣品中的粒子進(jìn)行磁性分離，除去液體。之后，以 250 μ L的IOmM Tris-HCl (ρΗ7) /0. 7Μ NaCl洗凈液將粒子洗凈1次，再次利用磁性將粒子分 離，之后除去上述洗凈液(以上為工序(d))。在該磁性粒子中，加入80 μ L的蒸餾水作為溶出液并進(jìn)行分散，在75°C加熱2分鐘 然后恢復(fù)至室溫，使雜交至磁性粒子的核酸在分散液中溶出。從該分散液中將磁性粒子固 液分離，各取20 μ L加入3個(gè)試管中，分別實(shí)施HBV、HCV和HIV檢測用實(shí)時(shí)PCR，驗(yàn)證是否 回收到各病毒核酸(以上為工序(e))。此外，在HBV、HCV、HIV病毒的檢測中，分別使用ROCHE-DIAGNOSTICS公司制COBAS TaqmanHBV “自動”、COBAS TaqmanHCV “自動”、COBASTaqmanHIV-Ι “自動”試劑，進(jìn)行檢測和判定。實(shí)時(shí)PCR的試劑配制、PCR擴(kuò)增條件、PCR裝置條件設(shè)定、分析方法、判斷標(biāo)準(zhǔn)依照產(chǎn)
品手冊°[表 3] 如表3所示，通過使用實(shí)施例1的病毒檢測方法，能夠在同一溶液中分離出HBV、 HCV、HIV病毒核酸，通過實(shí)時(shí)PCR檢測法可以對它們進(jìn)行檢測。HBV、HCV和HIV的檢測靈敏 度非常高，即使在分別以102IU/mL的非常低的濃度含有各病毒的樣品中，也能以100%的準(zhǔn) 確率檢測出3種病毒。另外，使用全血樣品取代血漿樣品，用與上述相同的方法進(jìn)行病毒溶解、核酸捕捉 和檢測。其結(jié)果如表4所示。在使用全血樣品時(shí)，與使用血漿樣品的情況相比檢測靈敏度 稍稍降低。在全血樣品的情況下，考慮到血球容量占到全血的大約一半，實(shí)質(zhì)上可用于檢查 的樣品與血漿樣品相比約為一半。即確認(rèn)，即使在全血樣品的情況下，也可以無障礙地同時(shí) 檢測出低至103IU/mL的3種病毒。[表4] 此外，使用血清樣品時(shí)的結(jié)果由于與血漿樣品相同，因此省略數(shù)據(jù)。2. 3. 2.實(shí)施例 2由含有HBV (樣品C)、HCV (樣品lb)和HIV (樣品B)的血漿分別混合特定量，用病 毒陰性血漿進(jìn)行稀釋，由此制備分別以103IU/mL含有各病毒的樣品、以102IU/mL含有各病 毒的樣品、以10IU/mL含有各病毒的樣品。此外，為了確認(rèn)配制的各病毒濃度，與由NIBSC 公司購入的WHO標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)并列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用修正過濃度偏差的樣品。分別取這些樣品 和病毒陰性血漿各250 u L至試管中，等容量加入上述“2. 2.用于使病毒核酸游離的組合物 的制備”中制備的“組合物A”250ii L，在75°C加熱12分鐘(以上為工序(f))。各取上述“2. l.HBV、HCV、HIV探針結(jié)合磁性粒子的制備”中制備的10質(zhì)量％的 HBV-粒子分散液、HCV-粒子分散液、HIV-粒子分散液5 u L，將合計(jì)15 y L加入各試管中， 在25°C下溫育10分鐘，由此將由樣品游離的源自病毒的核酸捕捉到粒子上(以上為工序
17(g))。接著，在磁力架上設(shè)置試管，將樣品中的粒子進(jìn)行磁性分離，除去液體。之后，以 250 ii L的10mM Tris-HCl (pH7) /O. 7M NaCl洗凈液將粒子洗凈1次，再次利用磁性將粒子分 離，之后除去上述洗凈液(以上為工序(h))。在該磁性粒子中，加入80 y L的蒸餾水作為溶出液并進(jìn)行分散，在75°C加熱2分 鐘，然后恢復(fù)至室溫，使雜交至磁性粒子的核酸在分散液中溶出。從該分散液中將磁性粒子 固液分離，各取20 y L加入到3個(gè)試管中，分別實(shí)施HBV、HCV和HIV檢測用實(shí)時(shí)PCR，驗(yàn)證 是否回收到各病毒核酸(以上為工序(i))。此外，在HBV、HCV、HIV病毒的檢測中，分別使用ROCHE-DIAGNOSTICS公司制C0BAS TaqmanHBV “自動”、COBAS TaqmanHCV “自動”、COBASTaqmanHIV-1 “自動”試劑，進(jìn)行檢測和 判定。PCR試劑配制、PCR擴(kuò)增條件、PCR裝置條件設(shè)定、分析方法、判斷標(biāo)準(zhǔn)依照產(chǎn)品手冊。對各個(gè)樣品進(jìn)行5次測定，判定為陽性的次數(shù)歸納在表3中。[表 5] 如表3所示，通過使用實(shí)施例2的病毒檢測方法，能夠在同一溶液中分離出HBV、 HCV、HIV病毒核酸，通過實(shí)時(shí)PCR檢測法可以對它們進(jìn)行檢測。HBV、HCV和HIV的檢測靈敏 度非常高，即使在分別以102IU/mL的非常低的濃度含有各病毒的樣品中，也能以100%的準(zhǔn) 確率檢測出3種病毒。另外，使用全血樣品取代血漿樣品，用與上述相同的方法進(jìn)行病毒溶解、核酸捕獲 和檢測。其結(jié)果如表6所示。在使用全血樣品時(shí)，與使用血漿樣品的情況相比檢測靈敏度 稍稍降低。在全血樣品的情況下，考慮到血球容量占到全血的大約一半，實(shí)質(zhì)上可用于檢查 的樣品與血漿樣品相比約為一半。即確認(rèn)，即使在全血樣品的情況下，也可以無障礙地同時(shí) 檢測出低至103IU/mL的3種病毒。[表 6] 此外，使用血清樣品時(shí)的結(jié)果由于與血漿樣品相同，因此省略數(shù)據(jù)。
2. 3. 3.實(shí)施例3 實(shí)施例8除了在上述“2.3.1.實(shí)施例1”的工序(a)中，用表1所述的組合物B G代替 “組合物A”以外，實(shí)施與使用上述“2. 3.1.實(shí)施例1”的血漿樣品的情況相同的工序。對各 個(gè)樣品進(jìn)行5次測定，判定為陽性的次數(shù)歸納在表7 表12中。[表7] [表 8] [表 9] [表 10] [表 11]
[表 12] 如表7 表12所示，通過使用實(shí)施例3 實(shí)施例8的病毒檢測方法，能夠在同一溶 液中分離出HBV、HCV、HIV病毒核酸，通過實(shí)時(shí)PCR檢測法可以對它們進(jìn)行檢測。HBV、HCV和 HIV的檢測靈敏度非常高，即使在分別以102IU/mL的非常低的濃度含有各病毒的樣品中，也 能以100%的準(zhǔn)確率檢測出3種病毒。2. 3. 4.實(shí)施例9 實(shí)施例14除了在上述“2.3.2.實(shí)施例2”的工序(f)中，用表1所述的組合物B G代替 “組合物A”以外，實(shí)施與使用上述“2. 3. 2.實(shí)施例2”的血漿樣品的情況相同的工序。對各 個(gè)樣品進(jìn)行5次測定，判定為陽性的次數(shù)歸納在表13 表18中。[表13] [表14] [表15] [表16] [表 17] [表18] 如表13 表18所示，通過使用實(shí)施例9 實(shí)施例14的病毒檢測方法，能夠在同 一溶液中分離出HBV、HCV、HIV病毒核酸，通過實(shí)時(shí)PCR檢測法可以對它們進(jìn)行檢測。HBV、 HCV和HIV的檢測靈敏度非常高，即使在分別以102IU/mL的非常低的濃度含有各病毒的樣 品中，也能以100%的準(zhǔn)確率檢測出3種病毒。2. 3. 4.比較例1 比較例5除了在上述“2.3. 1.實(shí)施例1”的工序(a)中，用表2所述的組合物H L代替 “組合物A”以外，實(shí)施與使用上述“2. 3.1.實(shí)施例1”的血漿樣品的情況相同的工序。對各 個(gè)樣品進(jìn)行5次測定，判定為陽性的次數(shù)歸納在表19 表23中。[表19] [表 20] [表 21] [表 22]
[表 23] 如表19 表23所示，在比較例1 比較例5的病毒檢測方法中，在任一個(gè)濃度中 也無法檢測出HBV、HCV和HIV。2. 3. 5.比較例6 比較例10除了在上述“2.3.2.實(shí)施例2”的工序(f)中，用表2所述的組合物H L代替 “組合物A”以外，實(shí)施與使用上述“2. 3. 2.實(shí)施例2”的血漿樣品的情況相同的工序。對各 個(gè)樣品進(jìn)行5次測定，判定為陽性的次數(shù)歸納在表24 表28中。[表 24] [表 25] [表 26]
[表 27] [表 28] 如表24 表28所示，在比較例6 比較例10的病毒檢測方法中，在任一個(gè)濃度 中也無法檢測出HBV、HCV和HIV。2. 3. 5.實(shí)施例 15對上述“2. 3. 3.實(shí)施例10”的工序(h)和工序⑴進(jìn)行如下改變。在磁力架上設(shè)置試管，將樣品中的粒子進(jìn)行磁性分離，除去液體。之后，以250 y L 的10mM Tris-HCl (pH7)/0. 7M NaCl洗凈液將粒子洗凈1次(以上為工序(h))。省略從由工序(h)得到的磁性粒子中使核酸溶出的工序，將工序(h)得到的磁性 粒子直接分散在50yL PCR反應(yīng)的混合物中，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)(以上為工序(i))。對各個(gè)樣品進(jìn)行5次測定，判定為陽性的次數(shù)歸納在表29中。[表29]
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如表29所示，即使在將工序(h)回收的磁性粒子直接分散在50 ii L的PCR反應(yīng)混 合物中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)時(shí)，也可以以高靈敏度檢測HBV、HCV和HIV。即使在分別以10IU/ mL的非常低的濃度含有各病毒的樣品中，也能以80 100%的準(zhǔn)確率檢測出3種病毒。2. 3. 6.實(shí)施例 16對上述“2. 3. 3.實(shí)施例10”的工序⑴進(jìn)行如下改變。在工序(h)得到的磁性粒子中，加入40 ii L的20mM的氫氧化鈉水溶液作為溶出液 并進(jìn)行分散，在75°C加熱2分鐘，然后恢復(fù)至室溫，使雜交至磁性粒子的核酸在分散液中溶 出。從該分散液中將磁性粒子固液分離，回收溶出液。用40yL的20mM鹽酸水溶液將回收 的溶出液中和后，各取20 u L，加入到3個(gè)試管，分別用于HBV、HCV和HIV檢測用實(shí)時(shí)PCR， 驗(yàn)證是否回收到各病毒核酸(以上為工序(i))。對各個(gè)樣品進(jìn)行5次測定，判定為陽性的次數(shù)歸納在表30中。[表30] 2. 3. 7.實(shí)施例 17使用“30mM氫氧化鈉水溶液”代替在上述“2. 3. 6.實(shí)施例16”中用作溶出液的 "20mM氫氧化鈉水溶液”。回收的溶出液用40 ii L的30mM鹽酸水溶液中和。對各個(gè)樣品進(jìn)行5次測定，判定為陽性的次數(shù)歸納在表31中。[表31] 2. 3. 8.參考例 1
使用“40mM氫氧化鈉水溶液”代替在上述“2. 3. 6.實(shí)施例16”中用作溶出液的 "20mM氫氧化鈉水溶液”?；厥盏娜艹鲆河?0 ii L的40mM鹽酸水溶液中和。對各個(gè)樣品進(jìn)行5次測定，判定為陽性的次數(shù)歸納在表32中。[表32] 2. 3. 9.參考例 2使用“50mM氫氧化鈉水溶液”代替在上述“2. 3. 6.實(shí)施例16”中用作溶出液的 "20mM氫氧化鈉水溶液”?；厥盏娜艹鲆河?0 ii L的50mM鹽酸水溶液中和。對各個(gè)樣品進(jìn)行5次測定，判定為陽性的次數(shù)歸納在表33中。[表33] 如表30 表31所示，使用20mM或30mM氫氧化鈉水溶液作為溶出液時(shí)，能夠高靈 敏度地檢測HBV、HCV和HIV。即使在分別以10IU/mL的非常低的濃度含有各病毒的樣品中， 也能以80 100%的準(zhǔn)確率檢測出3種病毒。另一方面，如表32 表33所示，可知在使用40mM或50mM氫氧化鈉水溶液時(shí)，雖 然能夠高靈敏度地檢測HBV，但HCV和HIV的檢測率顯著降低。
權(quán)利要求
一種病毒檢測方法，是在同一溶液中從可能含有至少1種病毒的生物學(xué)樣品中特異性地分離病毒核酸后進(jìn)行檢測的方法，其中，包含以下工序(a)將所述生物學(xué)樣品和用于使病毒核酸游離的組合物混合的工序，(b)在所述工序(a)的混合物中，添加能夠與所述病毒核酸的至少一部分序列雜交、且至少一方的末端被生物素化的寡核苷酸的工序，(c)在所述工序(b)的混合物中，添加固相載體的工序，所述固相載體表面固定有抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素，(d)從所述工序(c)的混合物中將所述固相載體分離的工序，和(e)使用所述固相載體、用核酸擴(kuò)增法檢測所述病毒核酸的工序；所述組合物含有選自硫氰酸胍、鹽酸胍和碘化鈉中的至少一種離液劑，陰離子性表面活性劑和還原劑，所述工序(a)的混合物中的所述陰離子性表面活性劑的濃度為2.5質(zhì)量％～30質(zhì)量％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒檢測方法，其中，檢測對象病毒為選自B型肝炎病毒 HBV、C型肝炎病毒HCV和人類免疫缺陷病毒HIV中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒檢測方法，其中，所述工序(e)進(jìn)一步包含向所述工序 (d)得到的固相載體添加溶出液，將所述病毒核酸溶出的工序。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒檢測方法，其中，所述工序(e)包含使用所述工序(d)得 到的固相載體，不分離病毒核酸，而用核酸擴(kuò)增法檢測每個(gè)固相載體的工序。
5.一種病毒檢測方法，是在同一溶液中從可能含有至少1種病毒的生物學(xué)樣品中特異 性地分離病毒核酸后進(jìn)行檢測的方法，其中，包含以下工序(f)將所述生物學(xué)樣品和用于使病毒核酸游離的組合物混合的工序，(g)在所述工序(f)的混合物中，添加固相載體的工序，所述固相載體表面結(jié)合有與所 述病毒核酸的至少一部分序列雜交的寡核苷酸，(h)由所述工序(g)的混合物將所述固相載體分離的工序，和(i)使用所述固相載體、用核酸擴(kuò)增法檢測所述病毒核酸的工序；所述組合物含有選自硫氰酸胍、鹽酸胍和碘化鈉中的至少一種離液劑、陰離子性表面 活性劑和還原劑，所述工序(f)的混合物中的所述陰離子性表面活性劑的濃度為2.5質(zhì)量％ 30質(zhì)量％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的病毒檢測方法，其中，檢測對象病毒為選自B型肝炎病毒 HBV、C型肝炎病毒HCV和人類免疫缺陷病毒HIV中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的病毒檢測方法，其中，所述工序(i)進(jìn)一步包含在所述工序 (h)得到的固相載體的水分散液中添加溶出液，將所述病毒核酸溶出的工序。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的病毒檢測方法，其中，所述工序(i)包含使用所述工序(h)得 到的固相載體，不分離病毒核酸，而用核酸擴(kuò)增法檢測每個(gè)固相載體的工序。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的病毒檢測方法，其中，所述固相載體為具有0.5 y m 15um的平均粒徑、且能夠用重力或離心力進(jìn)行固液分離的粒子。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的病毒檢測方法，其中，所述固相載體為具有0.5 y m 15um的平均粒徑、且能夠用電磁力進(jìn)行固液分離的粒子。
11.一種用于使病毒核酸游離的組合物，含有選自硫氰酸胍、鹽酸胍和碘化鈉的至少 一種離液劑，陰離子性表面活性劑，和還原劑，所述陰離子性表面活性劑的濃度為2. 5 30重量％。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用于使病毒核酸游離的組合物，其中，所述陰離子性表面 活性劑包含選自烯基琥珀酸二鉀、N-十二烷基肌氨酸鈉、烷基醚羧酸鹽、烷?；劝彼猁}和 聚氧乙烯烷基醚磷酸鉀中的至少1種。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用于使病毒核酸游離的組合物，其中，所述還原劑包含選 自2-巰基乙醇、硫甘油、二硫蘇糖醇、2-巰基乙胺鹽酸鹽、三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽、巰基 乙酸和2-巰基丙酸中的至少1種。
全文摘要
本發(fā)明提供一種病毒檢測方法，是在同一溶液中由可能含有至少1種病毒的生物學(xué)樣品同時(shí)且簡便地特異性地分離病毒核酸后進(jìn)行檢測的方法，以及在該方法中使用的用于使病毒核酸游離的組合物。本發(fā)明涉及的病毒檢測方法的特征在于，其包含(a)將生物學(xué)樣品與用于使病毒核酸游離的組合物混合而制備混合物的工序，和其它工序(b)～(e)，所述用于使病毒核酸游離的組合物的特征在于，包含選自硫氰酸胍、鹽酸胍和碘化鈉中的至少一種的離液劑，陰離子性表面活性劑和還原劑。最適合于可能含有選自B型肝炎病毒、C型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒中的1種以上的病毒的生物學(xué)樣品的檢查。
文檔編號C12Q1/70GK101871017SQ201010159030
公開日2010年10月27日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月23日
發(fā)明者上野勝, 片寄聰, 范可君 申請人:Jsr株式會社