專利名稱：：一種不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株及其疫苗的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株，還涉及一種由該菌株制備的豬霍亂沙門氏菌基因缺失疫苗，屬于動物細菌基因工程
技術領域：
。
背景技術：
：豬霍亂沙門氏菌、Salmonellacholeraesuis)是導致24月齡仔豬副傷寒的主要病原，豬被感染后易引起急性敗血癥、慢性壞死性腸炎、頑固性下痢等典型癥狀，還常會引起斷奶仔豬大批發(fā)病，如伴發(fā)或繼發(fā)感染其它疾病或治療不及時，死亡率較高，造成重大損失。動物生前感染沙門氏菌或其制品受到污染，人食用后，易引起食物中毒，因此該病原在公共衛(wèi)生學上也具有重要意義。豬霍亂沙門氏菌屬于沙門氏菌屬i^lmonellus)，為革蘭氏陰性桿菌，兼性厭氧，具周身鞭毛，能運動，不形成芽孢。其最適生長溫度為371，最適？!1為6.87.8。豬霍亂沙門氏菌對干燥、腐敗、日光等外界因素抵抗力較強，在745°C溫度范圍內(nèi)均能繁殖，冷凍或凍干后仍可存活。該菌在適合的有機物中可生存數(shù)周、數(shù)月甚至數(shù)年，但對消毒劑的抵抗力不強。豬霍亂沙門氏菌在一些健康豬的腸道或膽囊內(nèi)也有不同程度的潛伏存在，當飼養(yǎng)管理和飼養(yǎng)環(huán)境差導致豬的抵抗力降低時，常常會引起豬群發(fā)病。人們最早使用滅活的全菌疫苗來預防豬霍亂沙門氏菌引起的仔豬副傷寒，由于滅活苗具容易引起全身及局部反應、只能激發(fā)體液免疫、不能提供交叉保護、需多次加強免疫等缺點，此類疫苗的應用受到限制。隨后，人們發(fā)現(xiàn)弱毒沙門氏菌在誘導體液和細胞免疫反應方面比滅活疫苗或亞單位疫苗更為有效。于是，盡管傳統(tǒng)的滅活疫苗和亞單位疫苗一直在沿用，但由于免疫效果不佳以及免疫途徑不方便而逐漸被弱毒活疫苗所取代。各種沙門氏菌弱毒活疫苗在世界范圍內(nèi)得到了廣泛應用，取得了良好的預防效果(CurtissR,III，DoggettTjNayakA,SrinivasanJ.1996.Strategiesfortheuseofliverecombinantavirulentbacterialvaccinesformucosalimmunization,p.499-511.InH.KiyonoandM.F.Kagnoff(ed.),Essentialsofmucosalimmunology.AcademicPress,SanDiego,Calif；SirardJC，NiedergangF，KraehenbuhlJP.1999.LiveattenuatedSalmonella:aparadigmofmucosalvaccines.Immunol.Rev.171:5-26)。我國在60年代初，房曉文等將抗原性良好的豬霍亂沙門氏菌強毒株C78-1接種到含有醋酸鉈的培養(yǎng)基中傳數(shù)百代后，選出一株免疫原性好的弱毒株，被命名為C500(房曉文等，仔豬副傷寒弱毒菌苗的研究，畜牧獸醫(yī)學報，1981(2):29-36)。C500菌株在全國推廣使用，使我國仔豬副傷寒得到有效的控制(黃昌炳等，仔豬副傷寒弱毒通氣培養(yǎng)凍干苗口服免疫研究，中國農(nóng)業(yè)科學，1981(6):89-94)。但該弱毒疫苗菌株C500由野生強毒株經(jīng)過化學致弱方法制得，遺傳背景不清，存在毒力返強的風險。另外，在臨床應用中也發(fā)現(xiàn)，該弱毒疫苗仍有部分殘留毒力，能引起一些被免疫豬只強烈的副反應(康凱，仔豬副傷寒活疫苗，中國獸藥雜志，2003(37)37-49)。因此，仍然需要開發(fā)遺傳背景清楚、性狀穩(wěn)定、更符合生物安全性的新型豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗。隨著現(xiàn)代生物學和DNA重組技術的發(fā)展，人們對沙門氏菌毒力遺傳學進行了深入研究和了解。這為在該病原體基因組中引入多重(Multiple)、限定(Defined)、減毒(Attenuated)和不能回復(Irreversible)的突變提供了可能性，這種突變是制備弱毒活疫苗的遺傳學基礎。與滅活疫苗和亞單位疫苗相比，弱毒活疫苗具有高效、花費低、方便使用等優(yōu)點。理想的弱毒活疫苗應具備下列條件(1)完全減毒突變株的殘余毒性一般不被接受；(2)高度免疫原性活疫苗應能夠有效的刺激機體產(chǎn)生特異性免疫反應；(3)不能回復突變防止回復突變的發(fā)生，降低毒力返強的風險；(4)對環(huán)境不造成污染疫苗應在體內(nèi)存留特定的時間，誘導免疫反應后被某種機制清除并不滯留于環(huán)境；(5)對后代無害疫苗所誘導的保護性免疫應能傳給下一代，而疫苗本身不應垂直傳播；(6)經(jīng)濟且方便使用諸如口服、滴鼻、肌肉注射等免疫方法比較簡單、方便。使用基因工程手段致弱沙門氏菌從而篩選獲得弱毒疫苗株已經(jīng)成為國際上的一項研究熱點。這主要是因為臨床上對新型弱毒沙門氏菌疫苗的具有需求，以及沙門氏菌可作為開發(fā)其它多種病原菌疫苗載體(SirardJC,NiedergangF,KraehenbuhlJP.1999.LiveattenuatedSalmonellaaparadigmofmucosalvaccines.Immunol.Rev.171:5-26;SprengS,DietrichG.WeidingerG..2006.RationaldesignofSalmonella-haseAvaccinationstrategies.Methods38:133—143)。與致病個生密切相關的沙門氏菌毒力因子主要包括脂多糖、腸毒素、細胞毒素、侵襲力與毒力基因及毒力調節(jié)基因等。人們嘗試通過各種基因工程手段缺失其中的某些毒力相關基因，致使沙門氏菌毒力降低，但仍保留其免疫原性，最終篩選獲得沙門氏菌基因缺失弱毒疫苗株。例如，缺失arM營養(yǎng)合成相關基因(arM基因編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸_3_磷酸合成酶，該酶催化2，4-二羥基苯甲酸鹽的分支酸途徑的中間反應，產(chǎn)生芳香族氨基酸)(HoisethSK，StockerBA.1981.Aromatic-dependentSalmonellatyphimuriumarenon-virulentandeffectiveaslivevaccines.Nature,291:238-239；DouganGjMaskellD，PickardD，HormaecheC.1987.IsolationofstablearoAmutantsofSalmonellatyphiTy2:propertiesandpreliminarycharacterisationinmice.MolGenGenet,207(2-3):402-405)、cja和毒力調節(jié)基因(cja編碼環(huán)化腺苷酸合成酶，crp編碼cAMP受體蛋白，cya和crP基因的突變株影響參與碳水化合物和氨基酸代謝的基因表達和菌毛與鞭毛的表達)(CurtissRIII，KellySM.1987.SalmonellatyphimuriumdeletionmutantslackingadenylatecyclaseandcyclicAMPreceptorproteinareavirulentandimmunogenic.InfectImmunj55(12):3035-3043;KellySMjBoseckerBA，CurtissRIII.1992.CharacterizationandprotectivepropertiesofattenuatedmutantsofSalmonellacholeraesuis.InfectImmunj60:4881-4890).Dam和祐f/祐M基因調控相關因子(/fe基因編碼DNA腺苷酸甲基化酶，至少調節(jié)由激活的40種基因的表達，而祐o/V祐M基因編碼轉錄激活因子/傳感器激酶)(GalanJEjCurtissIIIR.1989.VirulenceandvaccinepotentialofphoPmutantsofSalmonellatyphimurium.MicrobPathogen,6:433443;HohmannEL，OlettaCA,MillerSI.1996.EvaluationofaphoP/phoQ~de\eted,aroA~deletedliveoralSalmonellatyphivaccinestraininhumanvolunteers.Vaccine,14(1):19-24)等等。其中，部分沙門氏菌基因缺失菌株(主要是鼠傷寒沙門氏菌，也包括少量豬霍亂沙門氏菌基因缺失菌株)表現(xiàn)出毒力的顯著下降和對實驗動物良好的免疫效力。與滅活疫苗和亞單位疫苗不同，沙門氏菌活疫苗可以侵入淋巴系統(tǒng)，能更有效地激發(fā)宿主的體液和細胞免疫，并通過自然感染途徑如口服或鼻內(nèi)接種，激發(fā)系統(tǒng)和粘膜免疫反應(CurtissR,III,DoggettT,NayakA,SrinivasanJ.1996.Strategiesfortheuseofliverecombinantavirulentbacterialvaccinesformucosalimmunization,p.499-511.InH.KiyonoandM.F.Kagnoff(ed.),Essentialsofmucosalimmunology.AcademicPress,SanDiego,Calif；SirardJC,NiedergangF,KraehenbuhlJP.1999.LiveattenuatedSalmonella:aparadigmofmucosalvaccines.Immunol.Rev.171:5-26)。這樣，弱毒活疫苗也許是解決當前商品化疫苗不足的一種可行方法。已有的構建沙門氏菌基因缺失弱毒疫苗株的基因工程手段仍存在不少缺陷。例如，利用轉座子介導的突變方法存在隨機性，只適合于表型發(fā)生明顯變化突變子的篩選，而不導致明顯表型變化的突變菌株就不能夠通過這些方法獲得；傳統(tǒng)的利用同源重組導致靶基因突變的方法雖然精確，但獲得的突變菌株最后往往含有抗性標記，由于不符合生物安全性要求不能作為疫苗株用于疫苗生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種免疫原性更好，安全性強的不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株。另外，本發(fā)明的目的還在于提供一種利用豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株制備的豬霍亂沙門氏菌基因缺失疫苗。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案采用了一種不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株SalmonellacholeraesuisC7821，其保藏編號為CCTCCNOM2010102。所述的不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株缺失了豬霍亂沙門氏菌的主要毒力調節(jié)基因CT/7。缺失后豬霍亂沙門氏菌株毒力顯著減弱，但仍具有很好的免疫原性。本發(fā)明的技術方案還在于采用了一種包含不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株choleraesuisC7821的豬霍亂沙門氏菌基因缺失疫苗。所述的不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株缺失了豬霍亂沙門氏菌的主要毒力調節(jié)基因cr/7。本發(fā)明的不含抗性標記豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株，其基因工程菌株衍生于豬霍亂沙門氏菌C78-2(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家獸醫(yī)微生物保藏中心商業(yè)菌株)。所述的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株其主要毒力調節(jié)基因cr/7缺失了320bp，導致該細菌不能從哺乳動物中攝取cAMP，生長比較緩慢，且毒力大大降低，因而具有很高的安全性。經(jīng)動物試驗證實，該基因缺失突變菌株具有很好的免疫保護力。本發(fā)明不含抗性標記豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株的基本構建方法為利用基因工程技術缺失了豬霍亂沙門氏菌野生強毒株C78-2(簡稱C78-2，下同)的毒力調節(jié)基因cr/7，從而構建成新的突變株Zl77C78-2，我們將該新菌株命名為C7821。通過大量的生物學實驗數(shù)據(jù)證明本發(fā)明制備的基因缺失菌株C7821可用于制備針對豬霍亂沙門氏菌感染的弱毒活疫苗。本發(fā)明的主要優(yōu)點為(1)本發(fā)明的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株具有很好的免疫保護性，且毒力較弱，對免疫豬無任何不良副作用；由該菌株制備而成的疫苗，與傳統(tǒng)的疫苗相比更安全，用該親本菌構建的基因缺失突變菌株制成的疫苗可以刺激豬產(chǎn)生抵抗豬霍亂沙門氏菌同源野毒株的保護性免疫反應，有效防止豬霍亂沙門氏菌的感染，具有廣闊的市場應用前景。(2)本發(fā)明的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株保留了針對豬霍亂沙門氏菌感染的免疫保護效力，而且遺傳背景清晰，性狀穩(wěn)定，因而具有更好的生物安全性。(3)本發(fā)明的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株不含抗性標記，完全符合疫苗生物安全性要求。本發(fā)明的不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株SalmonellacholeraesuisC7821，于2010年4月26日保藏在位于武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，其保藏編號為CCTCCNO:M2010102o圖1為本發(fā)明制備的轉移質粒pREΔcrp的物理圖譜；圖2為本發(fā)明制備的轉移質粒pREcrpl2構建的流程圖3為本發(fā)明中不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌cr/7基因缺失菌株ZlcrpCl^-2的PCR檢測電泳圖譜；圖3A為ΔcrpC78~2突變株PCR鑒定圖(Pr5/Pr6)；其中，圖中M為DNAmarker(DL2，000)；1為H2O對照；2為親本菌株C78-2對照(918bp)；3為篩選的ZlcrpC78~2突變株(599bp)；圖3B:ZlcrpC78~2突變株PCR鑒定圖(Pr7/Pr6)，圖中M為DNAmarker(DL2，000)；1為pRE112質粒對照；2為H2O對照；3為親本菌株C78-2對照(1731bp)；4為篩選的ZlcrpC78~2突變株(1412bp)；圖4為本發(fā)明中的不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌突變株ZlcrpC78~2在加1%麥芽糖的麥康凱瓊脂上的菌落形態(tài)。圖4A為ΔcrpCl^-2突變株在LB培養(yǎng)上的菌落形態(tài)；圖4B為ΔcrpClS-2突變株在含有1%麥芽糖的麥康凱瓊脂上的菌落形態(tài)(無色)；圖4C為親本菌株C78-2在含有1%麥芽糖的麥康凱瓊脂上的菌落形態(tài)(紅色)；圖5為本發(fā)明中的不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌突變株C7821的生長特性試驗結果；圖6為本發(fā)明中不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌突變株ZlcrpCm-2的遺傳穩(wěn)定性實驗結果；圖6A為引物Pr5/Pr6對缺失菌株ZlcrpCH的PCR鑒定圖，圖中M:DNAmarker(DL2，000)；1為H2O對照；27為1、10、20、30、40和50代缺失菌株模板的擴增結果；圖6B為引物Pr7/Pr6對缺失菌株ZlcrpCH的PCR鑒定圖，圖中M:DNAmarker(DL2，000)；1為H2O對照；27為1、10、20、30、40和50代缺失菌株模板的擴增結果。具體實施例方式實施例1豬霍亂沙門氏菌C78-2cr/7基因缺失菌株的構建1、引物設計(用于基因克隆和分子檢測)參照文獻(徐引弟，等.豬霍亂沙門氏菌C500株AcrpAasd缺失菌株平衡致死載體系統(tǒng)的構建及鑒定.生物工程學報，2006，22(3):366_372)和已報道的傷寒沙門氏菌株Ty2的cr/7基因序列(GenBankNo:AE016847)設計2對引物(prl/pr2和pr3/pr4，見表1)，從豬霍亂沙門氏菌強毒株C78-2(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家獸醫(yī)微生物保藏中心商業(yè)菌株)基因組中分別擴增《77基因上下游片段cr/77(上臂)和Ci7^(下臂)，擴增片段大小分別為1048bp和1743bp，上臂兩端分別引入損aI和及I酶切位點，下臂兩端分別引入IAoI和幻wI酶切位點。另設計2對引物(pr5/pr6和pr7/pr6，見表1)進行C78-2親本菌株和crp缺失菌株的鑒定。引物均由上海SANGON公司合成。表1PCR引物_墨aI引_名稱名稱引舊列(5、v.)_切位轟("F綱》上SP^片βcrplρ2TTTTCTAGAGCIGGAIGAGAGTIITGIGGXTlGCIgCrCCCATrCAAGAGTCGGGTCT104SXSa1JamHIcrpTifpr3片護erfpr4TTICTCGAG€CICGTCGCTTACA,4CiTCACTrrocrrACCCACTAACTGGATGCIGTATAA'iOI^nlp5€ψcrp-pr$TACGCGCATACAAC.4AAAGICGCGCCiOTCrrGACC^AAJTAACGGCr599ιχψ-}prcrpcrp-“ρι.6TCGCGIACCCAI.4ICAACTTGCCiCTTCTGACGGAAJIAACGGGI73_)WOifri-)2、豬霍亂沙門氏菌C78-2crp基因上下游片段crpl(上臂)與crp2(下臂)的克隆將凍干的豬霍亂沙門氏菌C78-2在LB固體培養(yǎng)基上劃線，LB固體培養(yǎng)基的組成為10g胰蛋白胨，5g酵母浸膏，5g氯化鈉，15g瓊脂粉，蒸餾水定容至1000mL，12rC高壓25min，37°C培養(yǎng)16h。挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(10g胰蛋白胨，5g酵母浸膏，5g氯化鈉，蒸餾水定容至1000mL，121°C高壓25min)中，37°C、200r/min振搖培養(yǎng)16h。按細菌基因組提取試劑盒(購自北京TIANGEN公司)說明書提取基因組為PCR模板。crpl和crp2擴增反應均在25μL的體系中進行，反應體系(PCR相關試劑均購自大連TaKaRa公司)如下模板DNA1μL，10XPCR緩沖液2.5μL,25mmol/LMgCl22μL,10μmol/L上、下游引物各1yL，2mmol/LdNTPs1μL，2U/μLTaqase0.5μL，ddH2016μL0crpl和crp2擴增條件為95°C變性5min后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94°C1min,57°C1min，72°C2min。30個循環(huán)后，72°C延伸10min。擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增2個片段大小與預期大小相當，分別為1048bp和1743bp。將得到的目的基因克隆到PMD18-T載體(購自大連TaKaRa公司)，送大連TaKaRa公司進行外源基因序列的測定。3、pREcrpl2轉移質粒的構建用XbaI和BamHI雙酶切crpl和pBluescriptSK(+)載體(購自美國Stratagene公司)，回收純化后用T4DNAIigase(購自大連TaKaRa公司)連接，16°C水浴12h，轉化DH5a感受態(tài)細菌(購自大連TaKaRa公司)，37°C在固體LB平板上培養(yǎng)12h，挑菌到液體LB培養(yǎng)基，37°C、200r/min振搖培養(yǎng)12h，使用質粒提取試劑盒(購自北京TIANGEN公司)小量制備質粒從而獲得質粒pSKcrpl。再用XhoI和KpnI雙酶切crp2與質粒pSKcrpl?；厥蘸笥肨4DNAIigase連接，轉化DH5α感受態(tài)細菌，37°C培養(yǎng)12h，挑菌到液體LB培養(yǎng)基，37°C、200r/min振搖培養(yǎng)12h，小量制備質粒從而獲得質粒pSKcrpl2。用XbaI和KpnI雙酶切轉移質粒PSKAcrp與自殺性質粒pRE112(由美國華盛頓大學Dr.RoyCurtissIII教授惠贈；Miller,V.L.,MekalanosJ.J.1988.Anovelsuicidevectoranditsuseinconstructiononinsertionmutations:osmoregulationofoutermembraneproteinsandvirulencedeterminantsinVibriocholeraerequirestoxR.J.Bacteriol.170:2575-2583)，回收crpl+crp2片段和質粒pRE112，用T4DNAligase連接，16°C水浴12h，電轉化(黃培堂等譯.薩姆布魯克J，拉塞爾DW著.分子克隆實驗指南(第三版).北京科學出版社，2002)大腸桿菌χ7213(由美國華盛頓大學Dr.RoyCurtissIII教授惠贈；Edwards，R.A.，L.H.Keller,andD.Μ.Schifferli.1998.Improvedallelicexchangevectorsandtheirusetoanalyze987Pfimbriageneexpression.Gene207:149-157)構建重組菌株χ7213(pREΔcrp)，37°C培養(yǎng)12h挑菌到液體LB培養(yǎng)基，37°C、200r/min振搖培養(yǎng)12h，小量制備質粒從而獲得pREcrpl2轉移質粒，其物理圖譜見圖1。酶切鑒定結果證實構建的轉移質粒pREcrpl2是正確的。轉移質粒pREcrpl2構建流程如圖2所示。4、豬霍亂沙門氏菌C78-2crp基因缺失菌株ΔcrpC78_2的構建以χ7213(pREcrpl2)為供體菌，C78-2為受體菌進行接合轉移。供體菌和受體菌分別在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，NaCl8.0g，KCl0.2g,Na2HP04.12H202.9g，KH2P040.2g，蒸餾水加至1000mL，經(jīng)121°C高壓滅菌30min)洗兩遍，調整菌濃度至0D600為0.8，各取100μL菌懸液混合。將無菌硝酸纖維濾膜貼于固體LB平板上，將混合菌液滴于濾膜上，37°C培養(yǎng)12h，同時做供體和受體對照。洗下濾膜上菌液，無菌PBS洗兩遍，涂布含氯霉素(Cm，終濃度30μg/ml)的固體LB平板，37°C培養(yǎng)12h，將Cm抗性菌落同時轉接含Cm和5%蔗糖的LB平板，篩選Cm抗性(Cmr)接合子，提取基因組，用引物pr5/pr6(見表1)擴增鑒定(見圖3A)。陽性接合子在無抗性無NaCl的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，連續(xù)10倍稀釋，涂布含5%蔗糖的無NaCl的固體LB平板，挑取單菌落復制在含Cm和5%蔗糖的固體平板，篩選Cm敏感(Cms)菌落。提取基因組，再次用引物pr5/pr6擴增鑒定，crp缺失菌株進一步用引物pr7/pr6(表1)鑒定(見圖3B)。結果表明，所構建的C78-2crp基因缺失菌株是正確的，我們將其命名為豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株SalmonellacholeraesuisC7821。實施例2豬霍亂沙門氏菌C78-2crp基因缺失突變菌株C7821的鑒定及生物學特性1、基因缺失菌株C7821的表型鑒定將基因缺失菌株C7821(實驗編號ΔcrpC78-2)與親本菌株C78-2劃線接種固體LB平板，然后轉接葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、衛(wèi)矛醇、尿素等碳源及H2S等生化鑒定管(購自杭州天和公司)進行生化反應。按血清因子(購自中國獸藥監(jiān)察所)說明書并進行0和H抗原鑒定。結果表明基因缺失菌株C7821的生化特性與親本菌株C78-2并不完全一致。親本菌株C78-2能夠利用麥芽糖，在加麥芽糖的麥康凱瓊脂上呈紅色菌落(見圖4C)，而crp基因缺失后，不能利用麥芽糖，因此在加麥芽糖的麥康凱瓊脂上仍呈無色菌落(見圖4B)。與親本菌C78-2不同，基因缺失菌株C7821不再能利用麥芽糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖與木糖，但其它碳源的利用情況及表型一致?；蛉笔Ь闏7821的血清型為6，7:C:1，5，與親本菌株C78-2—致，仍符合豬霍亂沙門氏菌的典型抗原特征。2、基因缺失菌株C7821的生長特性分析基因缺失菌株C7821在LB平板37°C培養(yǎng)12h，菌落其直徑約為1.0mm，較親本菌株C78-2(2.4mm)顯著減小。SHAPE\*MERGEF0RMAT親本菌株C78-2與基因缺失菌株C7821從106CFU/mL開始培養(yǎng)，每1h取樣，并進行活菌計數(shù)。結果顯示，基因缺失菌株C7821生長速度顯著慢于親本菌株C78-2(見圖5)，其平均世代間隔(Meangenerationtime)為37.2min，較親本菌株(26.0min)延長11.2min。3、基因缺失菌株C7821的遺傳穩(wěn)定性將本發(fā)明制備的基因缺失菌株C7821在固體LB平板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落到液體LB培養(yǎng)基中，37°C、200r/min培養(yǎng)16h，按體積11000的比例轉接到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，再次按體積1:1000的比例轉接到LB液體培養(yǎng)基中，連續(xù)進行50次轉接。另劃線接種到1%芽糖的麥康凱瓊脂，觀察菌落顏色。結果表明菌落不能變紅，仍符合《77基因缺失的表型特征。同時用引物pr5/pr6和pr6/pr7進行PCR擴增，基因缺失菌株C7821中的crp缺失基因遺傳情況見圖6。圖6表明，缺失菌株的1、10、20、30、40和50代模板的擴增的結果均無可見差別，表明本發(fā)明制備的基因缺失菌株C7821能夠穩(wěn)定遺傳。實施例3豬霍亂沙門氏菌基因缺失疫苗的制備將獲得的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株C7821(實驗編號ΔCT/7C78-2)進行鑒定，每代接種于1%芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上觀察菌落顏色，并利用豬霍亂沙門氏菌的crp基因進行PCR檢測鑒定缺失細菌的遺傳穩(wěn)定性。經(jīng)50次傳代后發(fā)現(xiàn)缺失突變菌株C7821在1%芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上菌落不能變紅，仍符合cr/7基因缺失的表型特征；且PCR鑒定cr/7基因仍然缺失了320bp，遺傳性穩(wěn)定。該豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株C7821在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到活菌濃度達到IXlO10CFU/mL。按細菌液明膠保護劑(體積體積)為7:1的比例加入明膠保護劑(該明膠保護劑配制方法是每100mL去離子水中加蔗糖40g，明膠8g，充分融化后，置121°C下滅菌30min后保存?zhèn)溆?，于滅菌凍干瓶中按2.0mL/瓶分裝，置-50°C冷凍干燥機中凍干，凍干36h后壓蓋，用10%鋁膠生理鹽水溶解并進行活菌計數(shù)(CFU)，并確定沒有雜菌污染，置-20°C保存?zhèn)溆茫鳛檠兄浦亟M疫苗的疫苗菌株。實施例4豬霍亂沙門氏菌基因缺失疫苗C7821的安全性評價1、本發(fā)明的基因缺失菌株C7821的毒力測定為測定構建的基因缺失菌株C7821(實驗編號Δcr/7C78-2)對BALB/c小鼠的毒力，將32只BALB/c小鼠平均分為2個大組，每大組分為4小組。第1大組小鼠進行口服感染C7821，每小組每只分別注射2.IXlO5CFU,2.IXlO6CFU,2.IXlO7CFU和2.IXlO8CFU；第2大組進行口服感染親本菌C78-2，每小組每只分別注射2.IXlO5CFU,2.IXlO6CFU、2.IXlO7CFU和2.IXlO8CFU。記錄死亡情況并按照ReedandMuench法(ReedLJ,MuenchH.1938.Asimplemethodofestimatingfiftypercentendpoints.Am.J.Hyg.27:493-497)進行計算小鼠半數(shù)致死劑量(50%lethaldose,LD5tl)。評價基因缺失菌株C7821與親本菌株C78-2相比毒力減弱程度。結果見表2用親本菌株4個濃度注射小鼠后，最低濃度(2XIO4CFU)和最高濃度(2XIO7CFU)均使小鼠全部死亡；而本發(fā)明的基因缺失疫苗菌株C7821(實驗編號Acr/7C78-2)口服感染的小鼠，最低濃度(2XIO5CFU)到最高濃度(2XIO7CFU)沒有小鼠死亡。計算結果表明基因缺失菌株C7821和親本菌株C78-2的LD50分別為1.5XIO7CFU和3.3XIO6CFU，C7821的毒力較親本菌株C78-2降低了1.325X104倍。這表明本發(fā)明的基因缺失突變菌株C7821與親本菌株C78-2相比其毒力明顯降低。表2本發(fā)明的基因缺失疫苗菌株與親本菌株毒力比較試驗權利要求一種不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株SalmonellacholeraesuisC7821，其保藏編號為CCTCCNOM2010102。2.根據(jù)權利要求1所述的不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株，其特征在于所述的不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株缺失了豬霍亂沙門氏菌主要毒力調節(jié)基因crp的320bpDNA片段。3.一種含有不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株choleraesuisC7821的豬霍亂沙門氏菌基因缺失疫苗。4.根據(jù)權利要求3所述的豬霍亂沙門氏菌基因缺失疫苗，其特征在于所述的不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株缺失了豬霍亂沙門氏菌的主要毒力調節(jié)基因crp的320bpDNA片段。5.一種不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株在制備豬霍亂沙門氏菌基因缺失疫苗方面的應用。全文摘要本發(fā)明涉及一種不含抗性標記的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株SalmonellacholeraesuisC7821，其保藏編號為CCTCCNOM2010102；同時還涉及一種由該菌株制備而成的豬霍亂沙門氏菌基因缺失疫苗。本發(fā)明的不含抗性標記豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株，其基因工程菌株衍生于豬霍亂沙門氏菌C78-2株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家獸醫(yī)微生物保藏中心商業(yè)菌株)。所述的豬霍亂沙門氏菌基因缺失突變菌株其主要毒力調節(jié)基因crp缺失了320bp，導致該細菌不能從哺乳動物中攝取cAMP，生長比較緩慢，且毒力大大降低，因而具有很高的安全性。經(jīng)動物試驗證實，該基因缺失突變菌株具有很好的免疫保護力。本發(fā)明制備的基因缺失疫苗可以刺激豬產(chǎn)生抵抗豬霍亂沙門氏菌同源野毒株的保護性免疫反應，有效防止豬霍亂沙門氏菌的感染。文檔編號C12N1/20GK101962625SQ201010159879公開日2011年2月2日申請日期2010年4月29日優(yōu)先權日2010年4月29日發(fā)明者余祖華,吳庭才,廖成水,張春杰,李銀聚,王臣,程相朝,趙戰(zhàn)勤,郁川申請人:河南科技大學