專利名稱：動物飼料中4種細(xì)菌16s rDNA PCR-RFLP指紋圖譜分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于進(jìn)出境動物飼料中4種細(xì)菌的指紋分析方法。
背景技術(shù)：
隨著我國對外貿(mào)易的擴(kuò)大，動物飼料的進(jìn)口量也與日俱增。目前，我國進(jìn)口的 動物飼料包括白魚粉、紅魚粉、牛肉骨粉、牛羊肉骨粉、魚飼料等。沙門氏菌和志賀氏 菌為當(dāng)前進(jìn)出境動物飼料的法檢項(xiàng)目，而其他食品上的法檢項(xiàng)目并未被列入其中，如阪 崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙雷菌等。隨著動物福利的日益提高，這些菌在將來也許 會成為法檢項(xiàng)目?；贒NA的檢測方法已越來越多的被當(dāng)前檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)所采納，成為對大 宗貨物進(jìn)行篩查的方法之一。細(xì)菌的16s rDNA是非常保守的一段序列，通過對其序列 的分析，可將細(xì)菌鑒定到屬，甚至是種。同時，對其序列的分析發(fā)現(xiàn)，各個細(xì)菌的16s rDNA具有限制性片段多態(tài)性。基于細(xì)菌16s rDNA的PCR-RFLP (PCR-限制性片段長 度多態(tài)性)可以建立各種細(xì)菌的指紋圖譜，因此可以通過對動物飼料中的細(xì)菌進(jìn)行16s rDNA的PCR-RFLP分析，與所建立的指紋圖譜進(jìn)行比對，即可得出是哪種細(xì)菌，從而進(jìn) 行鑒別。該方法操作簡便、靈敏、特異、快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。目前國內(nèi)外還沒有建 立針對動物飼料中的細(xì)菌16s rDNA的PCR-RFLP指紋圖譜，本發(fā)明可彌補(bǔ)目前方法的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要是應(yīng)用14種內(nèi)切酶對動物飼料中的4種細(xì)菌16s rDNA進(jìn)行切割，從 而16s rDNA的指紋圖譜。本發(fā)明的主要原理為針對4種細(xì)菌的16s rDNA，利用通用引物27f和1492r進(jìn) 行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用17種內(nèi)切酶分別進(jìn)行切割，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，顯示出各個芽孢 桿菌的特異性指紋譜圖。本發(fā)明涉及過程如下(1)常規(guī)方法分離鑒定動物飼料中常見的4種細(xì)菌。(2)細(xì)菌總DNA的提取利用細(xì)菌DNA提取試劑盒，分別提取4種菌的總DNA，步驟按照試劑盒操作說明。(3) PCR利用細(xì)菌16s rDNA通用引物對提取的細(xì)菌DNA進(jìn)行16s rDNA擴(kuò)增。(4) RFLP用14種內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切割。14種內(nèi)切酶及其排布順序如下
Aval, BamHI, BgII, DraI, EcoRI, EcoRII, HindIII, Hinf, HpaI, PstI, SmaI，TaqI，XbaI，XmaL·(5)瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳膠為2%的瓊脂糖凝膠。(6) PCR-RFLP指紋圖譜的建立
具體實(shí)施例方式對所得圖譜進(jìn)行分析，顯示各個菌的譜圖能相互區(qū)分，表明各個菌的指紋圖譜 具有特異性，可作為其他菌株P(guān)CR-RFLP比對的基礎(chǔ)。

圖1是從飼料中分離的一種細(xì)菌的16srDNAPCR-RFLP圖譜；圖2是從飼料中分離的另外一種細(xì)菌的16srDNAPCR-RFLP圖譜；圖3是阪崎腸桿菌的16s rDNA PCR-RFLP圖譜；圖4是戴氏西地西菌的16s rDNA PCR-RFLP圖譜；圖5是金黃色葡萄球菌的16s rDNA PCR-RFLP圖譜；圖6是居泉沙雷菌的16s rDNA PCR-RFLP圖譜。經(jīng)比對，所分離的2 種菌與其中的戴氏西地西菌和居泉沙雷菌完全吻合，因此 鑒定為戴氏西地西菌和居泉沙雷菌。
權(quán)利要求
1.存在于動物飼料中4種細(xì)菌鑒定的快速檢測方法，其特征在于所使用的內(nèi)切酶種類 及酶切后形成的指紋圖譜共用14種內(nèi)切酶4種細(xì)菌進(jìn)行酶切鑒定，14種內(nèi)切酶為Aval，BamH I，BgII, Dra I，EcoR I，EcoRII, HindIII, Hinf, Hpa I，Pst I，Sma I，Taq I，Xba I，Xma I，并按照這樣的順序進(jìn)行酶切。指紋圖譜為這14種內(nèi)切酶切割后形成14道的電泳圖譜，而 且每種菌均具有特異而且唯一的指紋。
全文摘要
本發(fā)明為動物飼料中4種細(xì)菌的PCR-RFLP檢測技術(shù)，具體地說是用14種內(nèi)切酶對存在于動物飼料中的4種芽孢桿菌的16s rDNA進(jìn)行酶切，每種菌形成一個16s rDNA的內(nèi)切酶指紋圖譜，從而建立4種菌的檢測方法。方法包括PCR擴(kuò)增16s rDNA，然后以14種內(nèi)切酶分別對4種菌的16s rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳。4種細(xì)菌分別是阪崎腸桿菌、戴氏西地西菌、金黃色葡萄球菌、居泉沙雷菌。具體檢測方法包括4種菌DNA的提取、PCR擴(kuò)增16s rDNA、內(nèi)切酶酶切、瓊脂糖凝膠電泳、PCR-RFLP指紋圖譜的建立。其優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便。
文檔編號C12Q1/68GK102010895SQ201010160378
公開日2011年4月13日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者朱來華, 肖西志, 鄧明俊, 高宏偉 申請人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心