專利名稱：植物耐逆性相關(guān)蛋白TaDREB3A及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物耐逆性相關(guān)蛋白TaDREB3A及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱、高鹽及低溫等逆境脅迫是影響小麥生長、發(fā)育的障礙因子。因此，了解小麥對逆境條件的應(yīng)答與信號傳導(dǎo)機制，提高小麥品種的抗逆性，成為小麥遺傳研究及小麥品種改良的重要任務(wù)之一。在逆境脅迫下植物體內(nèi)會產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，伴隨著許多生理生化及發(fā)育上的變化。明確植物對逆境的反應(yīng)機制，將為抗逆基因工程研究和應(yīng)用提供科學(xué)論據(jù)。目前，植物抗逆性研究已逐漸深入到細胞、分子水平，并與遺傳學(xué)和遺傳工程研究相結(jié)合，探索用生物技術(shù)來改進植物生長特性，其目的是提高植物對逆境的適應(yīng)能力。在干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細胞和整體水平上做出相應(yīng)的調(diào)整，以最大程度上減少環(huán)境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘導(dǎo)表達，這些基因的產(chǎn)物不僅能夠直接參與植物的脅迫應(yīng)答，而且能夠調(diào)節(jié)其它相關(guān)基因的表達或參與信號傳導(dǎo)途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強對脅迫環(huán)境的抗性。與脅迫相關(guān)的基因產(chǎn)物可以分為兩大類第一類基因編碼的產(chǎn)物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、 滲透調(diào)節(jié)因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應(yīng)答的基因產(chǎn)物；第二類基因編碼的產(chǎn)物包括參與脅迫相關(guān)的信號傳遞和基因表達調(diào)節(jié)的蛋白因子，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等。其中，轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應(yīng)答的基因表達調(diào)控中起著重要作用。轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性作用的DNA結(jié)合蛋白，通過它們之間以及與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)決定了它與順式作用元件結(jié)合的特異性，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)決定了它對基因表達起激活或是抑制作用。此外，其自身活性還受到核定位及寡聚化等作用的影響。目前已知在植物中與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有具有AP2結(jié)構(gòu)域的 AP2(APETALA2)/EREBP (乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein)轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈的bZIP (basic region/ leucinezipper motif transcription factors)類轉(zhuǎn)錄因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉鏈的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MTO家族。這五個轉(zhuǎn)錄因子家族，除WRKY家族不參與植物的水脅迫反應(yīng)外，其它四個家族均參與調(diào)節(jié)植物對干旱、高鹽和低溫等的逆境脅迫反應(yīng)。其中， AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中廣泛存在，它是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，近年來， 在擬南芥、煙草、玉米、水稻、大豆和油菜中均有報道，這表明AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。DREB (脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，DRE-binding protein)類轉(zhuǎn)錄因子是AP2家族中 EREBP-Iike亞家族中的一個成員。DREB和EREBP類轉(zhuǎn)錄因子在氨基酸序列上沒有顯著的相同性，但都含有一段非常保守的由58個左右氨基酸組成的DNA結(jié)合區(qū)域(EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域)。蛋白質(zhì)三維分析表明，該區(qū)域含有3個折疊，對識別各類順式作用元件起關(guān)鍵作用。其中位于第二個折疊中的第14、19位的兩個氨基酸殘基的差異，決定這類轉(zhuǎn)錄因子與不同順式作用元件的特異結(jié)合。DREB類轉(zhuǎn)錄因子第14位氨基酸是纈氨酸(V14)，第 19位氨基酸是谷氨酸(Ε19)，其中第19位的氨基酸并不保守，例如水稻的OsDREBI轉(zhuǎn)錄因子的第 19 位氨基酸就是纈氨酸(Dubouzet JG, Sakuma Y, Ito Y, Kasuga M, Dubouzet EG, Miura S, Seki Μ, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, 2003) 在 DREB 相關(guān)蛋白中決定 DNA結(jié)合的特異性方面，V14的作用明顯要比Ε19重要(Sakuma Y,Liu Q,Dubouzet JG,Abe H, Shinozaki K andYamaguchi-Shinozaki K, 2002)；而 ERF 類轉(zhuǎn)錄因子第 14 位氨基酸是甘氨酸，第19位是天冬氨酸，因而DREB特異結(jié)合DRE/CRT順式元件，ERF特異結(jié)合GCC-盒。 AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的C-端區(qū)還包含1個由18個氨基酸殘基組成的核心序列，該序列形成雙親性的α-螺旋，該α-螺旋可能參與同其它轉(zhuǎn)錄因子及DNA間的相互作用。目前，在許多植物中都發(fā)現(xiàn)含有EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，并分別與抗病、抗逆等信號傳遞有關(guān)(劉強，趙南明，Yamaguchi-Siinozaki K, Shinozaki K, 2000) 劉強等認為，一個DREB基因可以調(diào)控多個與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關(guān)的功能基因的表達(劉強，趙南明，Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K, 2000) Kasuga 等的研究證實， 導(dǎo)入到擬南芥的DREBlA基因可以同時促進與逆境脅迫耐性有關(guān)的基因rd29、rdl7、kinl、 cor6. 6、corl5a以及erdlO的表達，轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性大大增強(Kasuga M，Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K.，1999)。同樣，低溫耐性轉(zhuǎn)錄因子 CBFl 的轉(zhuǎn)基因植株的耐低溫能力有顯著提高(Jaglo-OttosenKR，Gilmour SJ, Zarka DG, Schabenberger O, Thomashow MF.，1998)。由于植物的逆境耐性是由多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀，依靠導(dǎo)入單個功能性蛋白基因很難實現(xiàn)植物抗逆性的綜合提高。因此，利用一個關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子促進多個功能基因的表達，從而增強植物的抗逆性，已經(jīng)成為植物抗逆基因工程的研究熱點。根據(jù)含DNA結(jié)合區(qū)的數(shù)目，AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子分為AP2 (APETALA2)和乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白 EREBP (ethylene-responsive element binding protein)以及 RAV 三個大類型。AP2型轉(zhuǎn)錄因子包括擬南芥的AP2、ANT，玉米的Glossy、idsl等。這種類型的轉(zhuǎn)錄因子含有兩個AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)細胞的生長發(fā)育，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)14個AP2型轉(zhuǎn)錄因子基因；EREBP型轉(zhuǎn)錄因子僅含1個AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)植物對激素(乙烯)、病原、低溫、干旱及高鹽等地分子應(yīng)答反應(yīng)。EREBP型轉(zhuǎn)錄因子中，已發(fā)現(xiàn)有煙草EREBP1-4、 番茄 Pti4-6、擬南芥 RAV1-2、AtEBP、AtERF 1-5、DREBlA-C (CBF1-3)和 DREB2A-B 等許多成員，分別與細胞發(fā)育、激素、抗病、低溫及干旱、高鹽等信號傳遞有關(guān)。這些EREBP型轉(zhuǎn)錄因子又可以再分為EREBP (ethylene-responsive element binding protein,艮口 ERF)亞組，包括煙草EREBP1-4、番茄Pti4-6、擬南芥AtEBP、AtERFl_5、這類轉(zhuǎn)錄因子與含核心序列AGCCGCC的GCC-盒特異結(jié)合，因此，它的DNA結(jié)合區(qū)又稱為GCC-盒結(jié)合域(GCC_box binding domain，GBD)，其中第2個G、第5個G、第7個C對ERF蛋白的識別有重要作用(Hao D，Ohme-Takagi M，Sarai A，1998)。用核磁共振對其三維空間結(jié)構(gòu)的研究表明，AtERFl的 GBD通過形成3個反向的β -片層與其靶序列GCC-盒的大溝相結(jié)合；DREBP亞組，包括擬南芥DREBlA-C (CBFlD和DREB2A-B，這類轉(zhuǎn)錄因子在干旱、高鹽、低溫下特異結(jié)合干旱應(yīng)答元件DRE/CRT，在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)IM個BREBP型轉(zhuǎn)錄因子基因；RAV型轉(zhuǎn)錄因子包括擬南芥RAVI、RAV2、含有兩個不同的DNA結(jié)合區(qū)-ERF/AP2和B3，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)6個RAV型轉(zhuǎn)錄因子基因。還有一類特殊的轉(zhuǎn)錄因子AL079349，它與以上的轉(zhuǎn)錄因子都不同，自
成一類。最近發(fā)現(xiàn)EREBl5s蛋白參與了干旱、高鹽和低溫脅迫的信號傳導(dǎo)和基因表達調(diào)控。 Mine等人從低溫儲藏的土豆塊莖中分離到了 EREBP轉(zhuǎn)錄因子CIP353，受低溫脅迫誘導(dǎo)強烈表達(Mine Τ, Hiyoshi Τ, Kasaoka K, Ohyama Α，2003)，說明可能有 EREBP 蛋白參與了受低溫脅迫的基因表達調(diào)控。Park等利用西紅柿為材料，得到了受高鹽、乙烯或茉莉酸誘導(dǎo)表達的 EREBP 轉(zhuǎn)錄因子 iTsi 基因，EMSA(Electrophoretic mobilityshift assays)試驗分析發(fā)現(xiàn)，Tsi蛋白與GCC-box和DRE/CRT順式元件都能結(jié)合(ParkJM，Park CJ, Lee SB, Ham BK, Shin R，Paek KH，2001)，盡管前者結(jié)合能力大于后者，但說明，某些EREBP蛋白能激活受滲透脅迫誘導(dǎo)表達的基因。在正常生長條件下，Tsi基因的超量表達提高了轉(zhuǎn)基因植株 (35S: :Tsil)的耐鹽性、增強了抗病性(ParkJM，Park CJ, Lee SB,Ham BK, Shin R，Paek KH, 2001)，以上說明了 Tsi基因可能參與了生物脅迫和非生物脅迫兩條信號傳導(dǎo)途徑。由高鹽脅迫激活的一條類MAPK信號傳遞模式(包括SIMKK和SIMK)，將脅迫信號傳遞給EIN2 (在乙烯信號傳遞途徑的CTRl下游)(Guo HW and Ecker J，2004)，最后激活某些EREBI3s轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控滲透脅迫相關(guān)基因的表達，提高植物的耐鹽性。對于是否存在含GCC-box元件， 且表達產(chǎn)物直接參與非生物脅迫響應(yīng)的基因，還有待作進一步的證實。綜合目前的研究結(jié)果，植物在逆境脅迫條件下的信號傳遞途徑至少有以下六條途徑(1)依賴于ABA的信號傳遞途徑有三條受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活MYB、MYC類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有MYBR或MYCR順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活A(yù)BF/AREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有ABRE順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活CBF4，DREB1類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因。(2)不依賴于ABA的信號傳遞途徑有三條受干旱、高鹽誘導(dǎo)，激活DREB2類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因；受低溫誘導(dǎo)，激活CBF1-3/DREB1A-C類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽或乙烯誘導(dǎo)，激活ERF類轉(zhuǎn)錄因子基因，調(diào)控具有DRE/CRT 或GCC順式作用元件的靶基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物耐逆性相關(guān)蛋白TaDREB3A及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，為一種脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，來源于小麥屬小麥 (Triticum aestivum L·)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列1所示蛋白質(zhì)由389個氨基酸殘基組成，自氨基端第75位-85位氨基酸殘基和第111位-115位氨基酸殘基為兩個可能的核定位信號區(qū)，自氨基端第138位-195位氨基酸殘基為保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。為了使(a)中的TaDREB3A便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
上述(b)中的TaDREB3A可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得至IJ。上述(b)中的TaDREB3A的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5' 端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述基因可為如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第43至1212位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的 DNA分子。所述嚴格條件為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列2所示cDNA序列由1325個核苷酸組成，該基因的開放閱讀框架為自5'端第 43位-1212位核苷酸。含有所述基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA 片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo) (Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、 玉米的泛素啟動子⑴biquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外， 使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子， 這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱
7讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的， 可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達載體具體可為YEP-GAP-TaDREB3A、pBI121-TaDREB3A、 pAHC25-TaDREB3A 或 pCAMBIA-TaDREB3A0 所述 YEP-GAP-TaDREB3A 為將權(quán)利要求 2 所述基因插入YEP-GAP的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5’端第43 位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入YEP-GAP的EcoRI和BioI酶切識別位點之間得到的重組質(zhì)粒。所述pBI121-TaDREB3A為將權(quán)利要求2所述基因插入pBI121的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入 PBI121的BamHI和BioI酶切識別位點之間得到的重組質(zhì)粒。所述pAHC25_TaDREB3A為將權(quán)利要求2所述基因插入PAHC25的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為將序列表的序列2 自5，端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入pAHC25的SmaI和SpeI酶切識別位點之間得到的重組質(zhì)粒。所述pAHC25-TaDREB3A為將權(quán)利要求2所述基因插入pCAMBIA3301 的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入pCAMBIA3301的SmaI和SpeI酶切識別位點之間得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到耐逆性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述基因具體可通過所述重組表達載體導(dǎo)入所述目的植物中。攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述目的植物既可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物，如擬南芥(如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥)、小麥(如濟麥19)、大豆(如東農(nóng)50)等。所述耐逆性可為耐非生物脅迫或抗病。所述耐非生物脅迫具體可為耐旱和/或耐鹽和/或耐高溫(如 43V )。所述抗病可為抗白粉病，具體可為抗由白粉病病原菌E09引起的白粉病。本發(fā)明還保護所述蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用。本發(fā)明的TaDREB3A在高鹽、高溫、低溫、干旱、病原菌、ABA、乙烯、JA的誘導(dǎo)下表達，并且可以特異的調(diào)控含有DRE/CRT順式元件(核心序列CCGAC)的基因的轉(zhuǎn)錄表達，提高植物的抗旱性、耐鹽性、耐高溫性，以及對白粉病病原菌的抗性。本發(fā)明的TaDREB3A為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物育種中發(fā)揮重要的作用。


圖1為TaDREB3A與小麥TaDREB氨基酸序列的同源性比對結(jié)果。圖2為TaDREB3A受脅迫誘導(dǎo)表達的實時熒光定量PCR圖譜；A 脫落酸處理；B 乙烯處理；C 高溫處理；D 茉莉酸甲酯處理；E 冷害處理；F 鹽漬處理；G 干旱處理；H 水楊酸處理；I :白粉病病原菌處理。
圖3為酵母單雜交系統(tǒng)證明轉(zhuǎn)錄因子體內(nèi)結(jié)合特異性和激活特性的原理示意圖。圖4為重組質(zhì)粒163hGFP_TaDREB3A的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5為重組質(zhì)粒pBI121_TaDREB3A的結(jié)構(gòu)示意圖。圖6為重組質(zhì)粒pAHC25_TaDREB3A的結(jié)構(gòu)示意圖。圖7為重組質(zhì)粒pCAMBIA_TaDREB3A的結(jié)構(gòu)示意圖。圖8為實施例7的抗旱性結(jié)果(恢復(fù)澆水起，植株第1至15天的表型)；A 非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?；B 轉(zhuǎn)基因株系1 ；C 轉(zhuǎn)基因株系2 ；D 轉(zhuǎn)基因株系3。圖9為實施例7的耐鹽性結(jié)果；A 非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?；B 轉(zhuǎn)基因株系1 ；C 轉(zhuǎn)基因株系 2 ；D 轉(zhuǎn)基因株系3。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實施例1、TaDREB3A的克隆一、mRNA 的分離將水培的生長10天左右的小白麥(國家種質(zhì)資源庫，編號ZMM2)三葉期幼苗干旱處理2小時，用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆?。采用Quikpr印Micro mRNA Purification Kit (Pharmacia)進行 mRNA 的分離。二、cDNA文庫的構(gòu)建及滴度測定l、cDNA文庫的構(gòu)建采用Timesaver cDNA Synthesis Kit (Pharmacia)將步驟一得到的 mRNA 合成 cDNA雙鏈，并力口EcoRI/NotI adaptor ；采用 ZAP Express Predigested Gigapack IIIGold Cloning Kit(Stratagene)進行cDNA文庫的構(gòu)建，共得到500ul庫液。2、滴度的測定(1)取 Iul 庫液用 SM Buffer 稀釋 1000 倍；(2)分別取Iul、IOul、IOOul稀釋液至三個IOml離心管中，分別加IOOul感受態(tài)宿主菌 XLl-Blue MRF，(OD600 為 1. 0)，于 37°C溫浴 20min ；(3)分別加入3ml頂膠(50°C )混勻，立即鋪于固體NZY平板上，凝固后倒置，37°C 培養(yǎng)過夜；(4)根據(jù)平板噬菌斑數(shù)，求平均值，即為庫容量。
計算公式口遼菌斑數(shù)(Pfu) X稀釋因子 l0f)0ii1/m1 噬菌體稀釋液的體積(ul)經(jīng)計算，該cDNA文庫的滴度為3. 0 X IO6個噬菌斑。三、cDNA文庫的篩選1、探針的準備根據(jù)已克隆的DREB基因的AP2保守區(qū)序列設(shè)計引物WAPF和WAPR，以普通小麥的cDNA為模板進行PCR擴增。WAPF :5，-ACC GCG GTG TGA GGC AGA GGA-3，；WAPR 5' -TGA GAA GTT GAC ACG TGC TTT GGC-3，。PCR擴增產(chǎn)物進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳。2、探針的回收采用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2· 0 (TaKaRa 公司，Code No. DV805A)回收純化180bp位置的條帶(探針)。3、轉(zhuǎn)膜(1)取Iul步驟二的1的庫液，在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)噬菌體，大概6. OX l(fpfu ；(2)噬菌斑培養(yǎng)好后放在4°C冷卻，臨用時取出置于超凈臺吹干，防止轉(zhuǎn)膜時頂膠被膜粘起；(3)將Hybrond-N+膜剪成圓形，比直徑為150mm的培養(yǎng)皿稍小，用鉛筆在膜上表明編號及日期(與培養(yǎng)皿對應(yīng))；(4)用鑷子夾住膜兩邊，有字面朝上，中間先接觸平板，慢慢松開，不要移動，不要有氣泡，使膜自然攤平，完全攤平后，計時；(5)用注射器針頭在膜上扎三個不對稱的孔，在培養(yǎng)皿背面對應(yīng)的位置用記號筆做好標(biāo)記；(6) ;3min后，用鑷子從一邊開始輕輕揭起膜，不要帶起頂膠；(7)將膜迅速放入盛有變性液的培養(yǎng)皿中(放一層濾紙及15ml變性液)變性 7min，有字面朝下，注意避免溶液到達膜的上表面；(8)將膜轉(zhuǎn)移至盛有中和液的培養(yǎng)皿中(放一層濾紙及15ml中和液)中和兩次， 每次3min ；(9)然后將膜轉(zhuǎn)入漂洗液中洗30min，可輕輕搖動；(10)取出膜，在干凈的濾紙上吸干，有字面朝下；(11)用保鮮膜將膜包好，在紫外交聯(lián)儀上交聯(lián)lmin，4°C存放備用；4、預(yù)雜交和雜交反應(yīng)65°C預(yù)雜交5_6h (新膜)；探針標(biāo)記完后，加入NaOH溶液，混勻后于室溫靜置 IOmin使探針變性，然后65°C雜交過夜。5、洗脫在55°C _65°C條件下洗膜。用濾紙吸干洗好的膜，保鮮膜包好，壓X-光片。6、陽性克隆的二輪篩選(1)將X光片與膜對齊，確定位置，描下膜上的三個不對稱點的位置；(2)在讀片機上放上X光片及相應(yīng)的培養(yǎng)皿，根據(jù)不對稱點使培養(yǎng)皿定位；C3)用去頭的Iml槍頭取出確定的陽性雜交斑，放在Iml SM緩沖溶液中，加入50ul 氯仿；(4)振蕩30秒，室溫放置1小時，離心，取上清；(5)取10-50ul上清再次鋪板，培養(yǎng)噬菌體進行二次篩選；(6) 二次篩選的步驟同上轉(zhuǎn)膜、預(yù)雜交和雜交反應(yīng)、洗脫、壓X-光片，得到單個陽性噬菌斑。
TaDREB3A1、集群內(nèi)刪除(Mass excision)(1)制備 XLl-Blue MRF，和 XLOLR 菌；用液體 LB 培養(yǎng)基培養(yǎng) XLl-Blue MRF，和 XLOLR菌，30°C過夜，培養(yǎng)基中添加0.2%麥芽糖、IOmM MgSO4和抗生素，分別為12. Syg/ml 四環(huán)素和50 μ g/ml卡那霉素；第二天，1000 X g離心IOmin收集菌體，用IOmM MgSO4重懸， 使 OD6tltl 達到 1. 0 ；(2)在一個IOml的無菌離心管中加入1 μ 1庫液(約含6. 0 X IO3噬菌體顆粒)XLl-Blue MRF，200 μ 1 (OD600 為 1. 0)ExAssist 助手噬菌體 2 μ 1 ( > 1 X 1010pfu/ml)(3)37°〇溫育15111士11;(4)加入20ml液體NZY培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)2. 5_3h ；(5) 65-70 V 加熱 20min ；(6) 1000 Xg離心lOmin，上清移至一個新管中；(7)在一個1. 5ml的離心管中混合200 μ 1 XLOLR菌和1 μ 1上清；(8)37°〇溫育15111士11;(9)取10 μ 1、100 μ 1菌液分別涂于LB固體培養(yǎng)基(含氨芐50 μ g/ml)上，37°C培養(yǎng)過夜。2、cDNA文庫插入片段的檢查(1)隨機挑取步驟1中集群內(nèi)刪除的單菌落，提取它們的質(zhì)粒DNA ；(2)用限制內(nèi)切酶EcoR I (Takara)消化，反應(yīng)體系10 μ 1 IOX 緩沖液 H1μ 1EcoR I(12U/y 1)0. 5 μ 1質(zhì)粒DNA2μ 1ddH206. 5 μ 1(3) 37°C消化》ι，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)95%以上的載體有插入片段，說明 95%以上的噬菌體含有重組子，因此文庫實際含有的重組子為2. 85X 106(cDNA文庫的滴度為3. OX IO6)。50%以上的重組子的插入片段在800bp-4Kb之間，說明構(gòu)建的文庫較完整。3、單克隆內(nèi)刪除(Single-clone excision)(1)將得到單個陽性噬菌斑從平板上摳下，放入到一個無菌的、已加有500μ 1 SM 緩沖液和20 μ 1氯仿的離心管中，漩渦振蕩10seC，4°C儲存；(2)用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)XLl-Blue MRF，和XLOLR菌，30°C過夜，培養(yǎng)基中添加 0. 2% (w/v)麥芽糖、IOmM MgSO4和抗生素，分別為12. 5 μ g/ml四環(huán)素和50 μ g/ml卡那霉素；(3)第二天，1000 Xg 離心 IOmin 收集菌體，用 IOmM MgSO4 重懸，使 OD6tltl 達到 1. 0 ；(4)在一個IOml的無菌離心管中加入XLl-Blue MRF'200 μ 1 (OD600 為 1. 0)噬菌體貯存液250 μ 1 (至少含1 X IO5噬菌體顆粒)ExAssist 助手噬菌體 1 μ 1 ( > 1 X K^pfu/ml)
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(5)37°〇溫育15111士11;(6)加入3ml液體NZY培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)2. 5_3h ；(7)于 65-70°C水浴離心管 20min，然后 IOOOXg 離心 15min ；(8)將上清移至一個新的離心管中，即為噬菌粒懸浮液；(9)在一個1. 5ml的離心管中加入200 μ 1步驟(3)制備好的XLOLR菌和步驟(8) 制備好的噬菌粒懸浮液100 μ 1，再加入300 μ 1液體NZY培養(yǎng)基，37°C溫育45-60min ；(10)取50 μ 1菌液涂于LB固體培養(yǎng)基(含氨芐50 μ g/ml)上，37°C培養(yǎng)過夜；(11)第二天挑取陽性克隆，用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，用EcoRI酶切， 電泳檢測插入片段長度。(12)選取插入片段大于SOObp的克隆進行測序，在ABI733測序儀 (GenecoreBiological Company)上，采用雙脫氧核苷酸鏈終止法測定序列，將得到的全序列與EMBL Bank以及GENEBANK等核苷酸數(shù)據(jù)庫比較，用DNASIS軟件進行分析。發(fā)現(xiàn)16、92 號克隆有一個保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。且基因結(jié)構(gòu)完整。(13)分析16、92號克隆的核苷酸序列及對應(yīng)的氨基酸序列，得到序列表中序列2 所示的核苷酸序列。將序列表的序列1所示的蛋白命名為TaDREB3A蛋白，由389個氨基酸殘基組成。 序列1中的自氨基端第75位-85位氨基酸殘基和第111位-115位氨基酸殘基為兩個可能的核定位信號區(qū)，自氨基端第138位-195位氨基酸殘基為保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。 TaDREB3A蛋白的同源序列比對結(jié)果如圖1所示(黑框表示一致的氨基酸部分)，TaDREB3A 與已報道的小麥TaDREB(AAL01124)只有68. 72%的同源性，說明TaDREB3A是一個新發(fā)現(xiàn)的小麥蛋白。將TaDREB3A蛋白的編碼基因命名為TaDREB3A基因，其開放閱讀框架為自序列表的序列2的5'端第43位-1212位核苷酸。實施例2、實時熒光定量PCR分析TaDREB3A的表達特性一、進行各種脅迫處理苗齡為10天的小白麥幼苗，進行以下處理(1)干旱處理將水培的小麥幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的濾紙上，干旱培養(yǎng)30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、M小時后取出材料，用液氮速凍，-80 °C
保存?zhèn)溆谩?2)鹽漬處理將小麥幼苗置于2%的由NaCl和Na2SO4組成的鈉鹽溶液中(NaCl 與Na2SO4W質(zhì)量百分比為3 2)中，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、M小時后分別取出材料，用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?3)脫落酸處理將小麥幼苗置于200 μ M的脫落酸(ABA)溶液中，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆谩?4)白粉病病原菌處理將小麥幼苗接種白粉病菌株，光照培養(yǎng)3小時、6小時、12 小時、2天、3天、4天、5天后，取出并用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?5)冷害處理將小麥幼苗置于4°C培養(yǎng)箱，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時后取出并用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆谩?6)茉莉酸甲酯處理將小麥幼苗置于50 μ M的茉莉酸甲酯(JA)溶液中，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，-80 V
保存?zhèn)溆谩?7)乙烯處理小麥幼苗置于含有乙烯的塑料袋中，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?8)水楊酸處理將小麥幼苗置于50 μ M的水楊酸(SA)溶液中，光照培養(yǎng)30分鐘、 1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆谩?9)高溫處理將小麥幼苗置于42°C下，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時、2小時、4小時、 8小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?10)對照的處理直接取未經(jīng)任何處理的小麥幼苗_80°C凍存作為對照(0小時)。二、mRNA 的分離Quikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia) πΛΝΑ 白勺^>畠。三.反轉(zhuǎn)錄為cDNA采用R103_Quant_Reverse_Transcriptase (TIANGEN)將純化的 mRNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。四、實時熒光定量PCR根據(jù)TaDREB3A序列，在其可變區(qū)設(shè)計特異引物TaDREB3RTF和TaDREB3RTR。以 actin為內(nèi)參基因，引物為actin-2F和actin_2R。TaDREB3RTF :5，-GATGCTGCCCGTGCTTATGAC-3，；TaDREB3RTR 5’ -CTGAGTGGTTGGTGGATGTTGT-3 ’。actin-2F:5，-CTCCCTCACAACAACCGC—3，；actin-2R :5，-TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3，。TaDREB3A對各個脅迫及激素表現(xiàn)出響應(yīng)，見圖2。實施例3、TaDREB3A的激活特性用酵母單雜交系統(tǒng)證明轉(zhuǎn)錄因子的激活特性的主要原理如圖3所示，將DRE順式作用元件和突變體DRE順式作用元件分別構(gòu)建到pHISi-Ι載體和pLacZi載體的基本啟動子Pmin (minimal promoter)上游，Pmin啟動子下游連接報道基因(His3、LacZ和URA3)。 當(dāng)連接有編碼轉(zhuǎn)錄因子的目的基因的表達載體YEP-GAP (不含激活功能)分別轉(zhuǎn)化到連有 DRE順式作用元件和突變體DRE順式作用元件的酵母細胞后，如果連有突變體DRE順式作用元件的酵母細胞中的報道基因不能表達，而連有特定的DRE順式作用元件的酵母細胞中的報道基因能夠表達，說明該轉(zhuǎn)錄因子能與DRE順式作用元件結(jié)合，且具有激活功能，激活了 Pmin啟動子，促使報道基因表達。從而證明目的轉(zhuǎn)錄因子的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活功能。YEP-GAP 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究保證向公眾提供；參考文獻Liu Q， KasugaM, Sakuma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Two transcriptionfactors, DREBl and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate twocellular signal transduction pathways in drought— andlow-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis, Plant Cell 1998 Aug ； 10 (8) :1391_1406。YPD液體培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract) 10g/L,細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(Bacto-Ρ印tone) 20g/L,調(diào)節(jié)pH至5. 8，121°C /15min滅菌，降至60°C以后加入40%的Glucose，使其終濃度為20g/L。SD/His-Z^ra-Ztrf選擇性培養(yǎng)基不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base) 6. 7g/L，營養(yǎng)缺陷型混合物(drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml，瓊脂粉 (Bacteriological agar) 20g/L，調(diào)節(jié) pH 至 5. 8，121 °C /15min 滅菌，降至 60°C后加入 40% Glucose，使其終濃度為20g/L。營養(yǎng)缺陷型混合物(Drop-outmix) =(IOX) :L_Isoleucine (異亮氨酸)300mg/L， L-Valine (纈氨酸)1500mg/L，L-Adenine (腺嘌呤)200mg/L, L-Arginine (精氨酸)200mg/ L, L-Histidine Hcl monohydrate (MMM) 200mg/L, L-Leucine (^tMM) lOOOmg/L, L-Lysine Hcl (賴氨酸)300mg/L，L-Methionine (甲硫氨酸)200mg/L，L-Phenylalanine (苯丙氨酸)500mg/L，L-Threonine (蘇氨酸)2000mg/L，L-Tyrosine (酪氨酸)300mg/L。lXPEG/LiAc 50% PEG3350 8ml, IOXTE buffer lml, IOXLiAc 1ml。IOXTE Buffer =IOOmM Tris-Hcl, IOmM EDTA、pH = 7. 5，121°C高壓滅菌，室溫保存。ΙΧΤΕ/LiAc =IOXTE buffer lml, IOXLiAc lml, ddH20 8ml。Z Buffer :Na2HPO4 · 7H20 16. lg/L, NaH2PO4 ‘ H2O 5. 5g/L, KCl 0. 75g/L, MgSO4 · 7H200. 246g/L，調(diào)節(jié) pH 至 7. 0，121°C /15min 滅菌，4°C保存。X-gal 儲存液(X-gal Stock Solution)用 N，N-dimethyl-formamide (DMF)溶解 X-gal，使其終濃度為20mg/ml，-20°C貯存。含有X-gal 的 Z buffer 緩沖液 100ml (Ζ buffer with X-gal)，現(xiàn)用現(xiàn)配 Z buffer98ml, β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol) 0. 27ml, X-gal 儲存液(X-gal stocksolution)1. 67ml。10 X LiAc =Clontech 公司。一、重組表達載體的構(gòu)建1、獲得TaDREB3A基因的獲得根據(jù)TaDREB3A基因的序列設(shè)計引物TaDREB3_EI和TaDREB3_XI，引物末端分別引入EcoRI和BioI酶切位點，以小白麥的cDNA為模板，PCR擴增獲得TaDREB3A基因。TaDREB3-EI :5，-GGGGAATTCATGACGGTAGATCGGAAGGACG-3，；TaDREB3-XI 5’ -GGGCTCGAGTCACAACCCTTCGAAGAACTCG-3 ’。PCR擴增產(chǎn)物進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2· O (TaKaRa 公司，Code No. DV807A)回收純化1. 1Kb左右的PCR產(chǎn)物。2、重組表達載體的構(gòu)建①用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BioI酶切步驟1回收純化的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；②用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BioI酶切表達載體YEP-GAP，回收載體骨架；③將步驟①的酶切產(chǎn)物和步驟②的載體骨架連接；④將步驟③的連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化JM109菌株(Clontech公司購買)，37 °C過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行測序；測序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒YEP-GAP-TaDREB3A (在YEP-GAP的EcoRI和BioI酶切位點之間插入了序列表的序列2自5，端第43-1212位核苷酸所示的DNA片段)。二、TaDREB3A的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活特性的驗證1、酵母報道子的構(gòu)建(1)正常雙重酵母報道子的構(gòu)建DNA 片段 A (含 4 個 DRE 元件)5，-GAATTC-DRE-DRE-DRE-DRE-GTCGAC-3，(DRE 的核心序列TACCGACAT)。DNA片段A的核苷酸序列見序列表的序列3。將DNA 片段 A 構(gòu)建到 pHis-Ι 載體(MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech 公司)的Rninms3啟動子上游，得到重組載體pHis-1-DRE，用Bio I和Nco I內(nèi)切酶將 pHi s-1-DRE載體切成線狀。將DNA 片段 A 構(gòu)建到 pLacZi 載體(MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech 公司)P·啟動子上游，得到重組載體pLacZi-DRE，用)(h0 I和Nco I內(nèi)切酶分別將 pLacZi-DRE載體切成線狀。先將線狀pHi s-1-DRE載體轉(zhuǎn)化到酵母細胞(YM4271株系，MATCHMAKER One-HybridSystem, Clontech公司)內(nèi)，獲得能在SD/His—培養(yǎng)基上正常生長的酵母轉(zhuǎn)化子 (Yeasttransformant)。接著以這種酵母轉(zhuǎn)化子為寄主細胞，繼續(xù)轉(zhuǎn)化含有4個重復(fù)DRE元件的pLacZi-DRE載體。這樣在同時缺乏組氨酸和尿嘧啶的SD/His_/^ra_培養(yǎng)基上，選擇獲得含有pHis-1-DRE和pLacZi-DRE的正常雙重酵母報道子。(2)突變體雙重酵母報道子的構(gòu)建DNA 片段 B (含 4 個 MDRE 元件)5，-GAATTC-MDRE-MDRE-MDRE-MDRE-GTCGAC-3，(M DRE 將4個DRE元件的核心序列CCGAC突變成TTTTT)。DNA片段B的核苷酸序列見序列表的序列4。用DNA片段B代替DNA片段A，方法同步驟(1)，得到突變體雙重酵母報道子。2、PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母及結(jié)果分析(1)接種酵母菌株(YM4271株系)到Iml YPD液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩2分鐘，分散團塊后將懸浮液轉(zhuǎn)至含有50ml YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C /250rpm搖過夜，測0D600 =1.7-1. 8 (計數(shù)約 4 X IO7 個/mL)；(2)取30ml步驟(1)過夜培養(yǎng)物接到300ml新鮮的YPD培養(yǎng)基中，30°C /250rpm 培養(yǎng)，約3小時(至0D600 = 0. 5士0. 1)，室溫IOOOg離心5min，收集菌體，棄上清，用1/2 體積1 XTE懸浮，1000g/5min離心；(3)吸棄上清，用1. 5ml新鮮配制的ΙΧΤΕ/LiAc溶液懸浮，振蕩混勻備用；(4)取出0. Iml酵母感受態(tài)進行轉(zhuǎn)化，依次加下列溶液0. 1 μ g YEP-GAP-TaDREB3A、0. Img ssDNA (鮭魚精DNA，Sigma)、0. 6mlPEG/LiAc 高速振蕩 1 分鐘，30°C /200rpm 振蕩培養(yǎng)30分鐘；(5)加入70ul DMS0(sigma#D8779)，輕輕倒置混勻，42°C熱激30分鐘，其間輕輕振蕩，冰浴2分鐘，室溫IOOOg離心5min ；(6)吸棄上清，加入0.5ml 1 X TE buffer懸浮細胞；(7)用接種環(huán)蘸取懸浮液，分別在含有O、15mmol/L 3_AT的ΞΟ/Η Γ/^^Λι^選擇性培養(yǎng)基上畫線培養(yǎng)。
(8)平板的一半培養(yǎng)正常雙重酵母報道子，另一半培養(yǎng)突變體雙重酵母報道子，以便做對照分析。(9)顛倒放置于培養(yǎng)箱中，30°C培養(yǎng)3-4天。(10)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Ommol/L 3-AT的SD/HiS_/^ra_/trp_的培養(yǎng)基平板上正常的酵母報道子和突變的酵母報道子都有生長，但突變的酵母報道子的直徑明顯??；而在15mmol/ L3-AT的SD/His7toa7Trp_的培養(yǎng)基平板上正常的酵母報道子能正常生長，但突變的酵母報道子被抑止沒有生長。3、半乳糖苷酶活性檢測(1)從Ommol/L 3_AT的SD/His-Z^ra—Ztrf的培養(yǎng)基平板上分別挑取正常的酵母報道子和突變的酵母報道子菌落。轉(zhuǎn)至YPD液體培養(yǎng)基中，于30°C振蕩培養(yǎng)，待長至對數(shù)生長后期，取1. 5ml菌液，3000rpm離心30s ；(2)棄上清，控干管中液體，將離心管置于液氮中速凍lOmin，取出使其自然融解， 加50ul Z/X-gal溶液，30°C溫育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常的酵母報道子在6- 內(nèi)變藍，而突變的酵母報道子在12h內(nèi)沒有變化，仍為白色。說明轉(zhuǎn)錄因子TaDREB3A能與DRE順式作用元件結(jié)合，且具有激活功能，激活了 Rnin啟動子，促使報道基因表達。從而證明了 TaDREB3A的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活功能。實施例4、亞細胞定位分析一、載體構(gòu)建PCR擴增TaDREB3A基因全長。用Hindlll，BamHI雙酶切PCR產(chǎn)物，將目的片段連接到同樣雙酶切的亞細胞定位載體16!3hGFP上，熱激轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α。對重組質(zhì)粒進行 PCR檢測。將陽性克隆測序。測序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒16;3hGFP-TaDREB3A(見圖4)。二、材料準備3 μ g重組質(zhì)粒DNA加入直徑為1. 0 μ M的金粉懸液6 μ 1 (50mg/ml)，0. IM亞精胺 (spermidine) 4 μ 1,2. 5Μ CaCl2 6 μ 1，將金粉、DNA、亞精胺和氯化鈣先分別振蕩混勻，然后混合振蕩混勻3min后，冰上靜置15min。12000rpm離心IOs (指轉(zhuǎn)速達到12000rpm后10s)， 棄上清。加入140 μ 1無水乙醇，粗振蕩后(打散金粉)12000rpm離心10s，收集金粉沉淀。 20 μ 1無水乙醇懸浮沉淀，點膜。三、基因槍轟擊受體材料1.選用一定壓力的可裂膜(本實驗用llOOpsi)，與轟擊膜一起，在70%的酒精中浸泡1 池，取出晾干；2.金屬擋板用酒精浸泡，在酒精燈上滅菌，基因槍的超凈工作臺紫外滅菌；3.取20μ 1上述制備好的金粉-質(zhì)粒復(fù)合體，均勻涂布于轟擊膜的中間位置上，不要涂于整個膜上，大小與載體固定圈上的孔徑范圍一致，晾干，然后固定在載體固定圈上；4.將上述載體固定圈安裝到發(fā)射裝置上；5.將可裂膜安裝到氣體加速管下端；6.將洋蔥表皮培養(yǎng)皿放入真空室內(nèi)，取下培養(yǎng)皿蓋；7.抽真空指針到^h/Hg ；8.放氦氣于氣體加速管，直到管中壓力達到可裂膜所能承受的壓力時，可裂膜破開；
9.氣體沖到轟擊膜上，載體向下運動，被金屬擋板擋住，而下面的金粉-質(zhì)粒復(fù)合體卻透過金屬擋板的網(wǎng)孔射向靶細胞；10.將轟擊好的洋蔥表皮細胞放入25°C培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)16 24h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。四、洋蔥表皮細胞鏡檢將基因槍轟擊、暗培養(yǎng)16_24h之后的洋蔥表皮壓片，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡(Bio-Rad MicroRadiance) (Laser scanning confocal microscopy, LSMC)觀察 GFP (綠色熒光蛋白)熒光，并進行掃描照像。結(jié)果表明TaDREB3A定位到細胞核中。LSCM的工作參數(shù)為Ex = 488nm, Em = 525士 15nm，Power = 10%, Zoom7,中速掃描，F(xiàn)rame512X512。軟件為 TIME-COURSE 和 PH0T0SH0P5. O。實施例5、TaDREB3A提高了擬南芥的抗旱、耐鹽、耐高溫性一、重組表達載體的構(gòu)建l、TaDREB3A 基因的克隆根據(jù)TaDREB3A基因的序列設(shè)計引物對(TaDREB3A_121F和TaDREB3A_121R)，引物末端分別引入BamHI和BioI酶切識別位點，以小白麥的cDNA為模板，PCR擴增TaDREB3A。TaDREB3A-121F :5，-GGGGGATCCATGACGGTAGATCGGAAGGACG-3，；TaDREB3A-121R :5，-GGGCTCGAGTCACAACCCTTCGAAGAACTCG-3，。PCR擴增產(chǎn)物進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，采用Agarose Gel DNA Purification KitVer. 2. O (TaKaRa 公司，Code No. :DV807A)回收純化 1. 1Kb 左右的條帶。2、重組表達載體的構(gòu)建①用限制性內(nèi)切酶BamHI和BioI酶切步驟1回收純化的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；②用限制性內(nèi)切酶BamHI和BioI酶切pBI121 (Clontech公司購買)，回收載體骨架；③將步驟①的酶切產(chǎn)物和步驟②的載體骨架連接；④將步驟③的連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化T0P10菌株(天根生化科技(北京)有限公司購買)，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行測序；測序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒 pBI121-TaDREB3A(在pBI121的BamHI和XhoI酶切位點之間插入了序列表的序列2自5， 端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段)(見圖5)。二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得1、用重組質(zhì)粒pBI121_TaDREB3A轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58(北京拜爾迪生物技術(shù)公司購買)，得到重組農(nóng)桿菌。2、將重組農(nóng)桿菌接種于YEP液體培養(yǎng)基中，28°C、3000rpm培養(yǎng)約30小時；3、將步驟2的菌液轉(zhuǎn)至YEP液體培養(yǎng)基(含50mg/L卡那霉素和50 μ g/L利福平) 中，28°C、300rpm培養(yǎng)約14小時(菌液0D600達到1. 5-3. 0)；4、收集菌體，4°C、4000g離心 lOmin，用 10%蔗糖(含0. 02%silwet)稀釋至0D600 約為 0. 8-1. O ；5、將擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型Col-0，SALK公司購買)整株與花盆一起倒扣在盛有步驟4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完畢后，取出花盆，側(cè)放于托盤中，蓋上黑色塑料布，Mhr后揭開塑料布，直立放置花盆，進行正常的光照培養(yǎng)，收獲T1代種子，卡那霉素篩選(濃度為50yg/L卡那霉素)陽性植株。將陽性植株進行PCR鑒定，鑒定結(jié)果表明，得到的轉(zhuǎn)基因植株(轉(zhuǎn)TaDREB3A基因植株)。T2代表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。三、轉(zhuǎn)空載體對照植物的獲得用質(zhì)粒pBI121轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，得到重組農(nóng)桿菌，用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥Col-Ο，得到轉(zhuǎn)空載體對照植株，方法同步驟二。四、轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性鑒定分別將T3代轉(zhuǎn)基因植株、T3代轉(zhuǎn)空載體對照植株和擬南芥Col-O (各60株)進行耐旱性鑒定、耐鹽性鑒定和耐高溫鑒定。均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。1、耐旱性將正常生長3周的幼苗，連續(xù)3周(21天)不澆水，第22天統(tǒng)計成活率。擬南芥 Col-O全部死亡，但40%轉(zhuǎn)基因植株存活且能正常生長。轉(zhuǎn)空載體對照植株的表型與擬南芥Col-O —致，存活率與擬南芥Col-O沒有顯著差異。2、耐鹽性將正常生長3周的幼苗，用400mM NaCl澆灌，然后轉(zhuǎn)移到正?；ㄅ柚羞M行正常管理，2周后統(tǒng)計成活率。擬南芥Col-O幾乎全部死亡，但35%轉(zhuǎn)基因植株仍然能存活且正常生長。轉(zhuǎn)空載體對照植株的表型與擬南芥Col-O —致，存活率與擬南芥Col-O沒有顯著差已升。3、耐高溫將正常生長2周的幼苗，進行高溫處理(43°C )4小時，常溫恢復(fù)生長1周，計算存活率。擬南芥Col-O的存活率為50%，100%轉(zhuǎn)基因植株存活且能正常生長。轉(zhuǎn)空載體對照植株的表型與擬南芥Col-O —致，存活率與擬南芥Col-O沒有顯著差異。實施例6、TaDREB3A提高了小麥的抗旱性和對病原菌的耐逆性一、重組表達載體的構(gòu)建1、TaDREB3A 基因的獲得根據(jù)TaDREB3A基因的序列設(shè)計引物對(TaDREB3A_121F和TaDREB3A_121R)，引物末端分別引入SmaI和SpeI酶切位點，以小白麥的cDNA為模板，PCR擴增TaDREB3A基因。TaDREB3A-121F :5，-TTTCCCGGGATGACGGTAGATCGGAAGGACG-3，；TaDREB3A-121R :5，-GGGACTAGTTCACAACCCTTCGAAGAACTCG-3，。PCR擴增產(chǎn)物進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2· O (TaKaRa 公司，Code No. DV807A)回收純化1. 1Kb左右的PCR產(chǎn)物。2、重組表達載體的構(gòu)建①用限制性內(nèi)切酶SmaI和SpeI酶切步驟1回收純化的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；②用限制性內(nèi)切酶SmaI和SpeI酶切pAHC25 (北京拜爾迪生物技術(shù)公司購買)，回收載體骨架；③將步驟①的酶切產(chǎn)物和步驟②的載體骨架連接；
④將步驟③的連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化T0P10菌株(天根生化科技(北京)有限公司購買)，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行測序；測序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒 pAHC25-TaDREB3A(在pAHC25的SmaI和SpeI酶切位點之間插入了序列表的序列2自5，端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段)(見圖6)。二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得1、基因槍法轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織取大田小麥(濟麥19 ；購自山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院)授粉后14天的未成熟胚，接種于SD2 培養(yǎng)基上，26°C黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織，7-10d后準備基因槍轟擊。取適量金粉(1. Oym)懸浮液(60 μ g/槍)，將金粉和pAHC25_TaDREB3A的混合液在4°C振蕩10min，14000rpm離心5min去上清，加入無水乙醇(10 μ 1/槍加乙醇)準備用于
基因槍轟擊。采用PDS-1000/He基因槍(Bia-Rod公司生產(chǎn))轟擊小麥幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織。選擇IlOOI^i的可裂膜，對材料進行轟擊。轟擊后的愈傷組織繼續(xù)在原滲透壓培養(yǎng)基上培養(yǎng) 16-1 ，然后轉(zhuǎn)入不加篩選劑的SD2培養(yǎng)基(MM培養(yǎng)基也可)中暗條件下(^TC)恢復(fù)培養(yǎng) 2周。2周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入第一次篩選培養(yǎng)基上(1/2MS+玉米素0.5mg/L+2%蔗糖+雙丙氨膦鈉3mg/L ；或l/2MS+a-萘乙酸lmg/L+6-糠氨基嘌呤0. 5mg/L+2%蔗糖+雙丙氨膦鈉 3mg/L也可)在(每天光照IOh)條件下篩選分化培養(yǎng)4周。待到愈傷組織分化出綠芽以后，將分化的綠芽轉(zhuǎn)入無激素培養(yǎng)基(1/2MS+雙丙氨膦鈉％ig/L)上直到小苗伸長(光照與溫度同前)，待到小苗伸長到l-2cm時(大概需要4周)，將抗雙丙氨膦鈉的再生植株移入壯苗培養(yǎng)基(1/2MS+生長素0. 5mg/L+多效唑0. 5mg/L)上壯苗，再生植株生長到適宜大小(苗高6-8cm，根系較好)時移入營養(yǎng)缽中，在15°C左右光照培養(yǎng)，待苗壯后置于溫室。將得到的陽性苗進行分子鑒定，結(jié)果表明得到了轉(zhuǎn)基因植株隊代)。T1代表示Ttl 代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T2代表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T4代表示T3代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T5代表示T4代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T6代表示T5代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。三、轉(zhuǎn)空載體對照植物的獲得用pAHC25代替pAHC25_TaDREB3A，制備轉(zhuǎn)空載體對照植株，方法同步驟二。四、轉(zhuǎn)基因小麥的耐病實例2008年10月將轉(zhuǎn)基因植株的T6代植株、轉(zhuǎn)空載體對照植株的T6代植株和濟麥 19 (各30株)種植于大田，2009年2月移栽于溫室、3月底接種白粉病病原菌E09 (北京地區(qū)流行的15號小種，其毒性譜Virl，3a，3b，3C，3e，5，6，7，8，17，19 ；購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所)。兩周后觀察并拍照，同時進行抗病鑒定，鑒定方法見文獻謝皓，陳孝， 盛寶欽，辛志勇，孔凡晶，林志珊，馬有志，小麥新種質(zhì)YWM3白粉病抗性鑒定和遺傳分析， 作物學(xué)報，2001 27(6)，715-721。抗病性鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株葉片中，單位面積的發(fā)病病斑數(shù)明顯小于濟麥 19和轉(zhuǎn)空載體對照植株，即轉(zhuǎn)基因植株對白粉病病原菌的耐性增強了 ；空載體對照植株的表型與野生型植株一致，對白粉病病原菌的耐性沒有顯著差異。實施例7、TaDREB3A提高大豆的抗旱性和耐鹽性
一、重組表達載體的構(gòu)建1、TaDREB3A 基因的獲得根據(jù)TaDREB3A基因的序列設(shè)計引物對(TaDREB3A_121F和TaDREB3A_121R)，引物末端分別引入Sma I和Spe I酶切位點，以小白麥的cDNA為模板，PCR擴增TaDREB3A基因。TaDREB3A-121F :5，-TTTCCCGGGATGACGGTAGATCGGAAGGACG-3，；TaDREB3A-121R :5，-GGGACTAGTTCACAACCCTTCGAAGAACTCG-3，。PCR擴增產(chǎn)物進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2· 0 (TaKaRa 公司，Code No. DV807A)回收純化1. 1Kb左右的PCR產(chǎn)物。2、重組表達載體的構(gòu)建①用限制性內(nèi)切酶Sma I和Spe I酶切步驟1回收純化的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；②用限制性內(nèi)切酶Sma I和Spe I酶切pCAMBIA3301 (美國Cambia公司)，回收載體骨架；③將步驟①的酶切產(chǎn)物和步驟②的載體骨架連接；④將步驟③的連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化T0P10菌株(天根生化科技(北京)有限公司)，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行測序；測序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒 pCAMBIA-TaDREB3A(在pCAMBIA3301的Sma I和Spe I酶切位點之間插入了序列表的序列 2自5，端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段)(見圖7)。pCAMBIA_TaDREB3A大小為 13638bp，植物抗性篩選標(biāo)記為磷化乙酰轉(zhuǎn)移酶基因bar。二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得根癌農(nóng)桿菌LBA4404 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究保證向公眾提供；參考文獻 徐淑平，衛(wèi)志明，黃健秋，鐘仲賢，徐悌惟；根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)B. t.基因和CpTI基因?qū)ㄒ说霓D(zhuǎn)化；植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，2002，觀(3) 193-199。用重組質(zhì)粒pCAMBIA_TaDREB3A轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌。以東農(nóng)50 (購自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院)為試驗材料，以大豆子葉節(jié)為外植體，采用根癌農(nóng)桿菌LBA4404 (RifE, StrE, KmE,)介導(dǎo)進行遺傳轉(zhuǎn)化，具體步驟如下1、外植體的獲得選取當(dāng)年收獲的表面光滑無病的健康飽滿的東農(nóng)50種子，利用氯氣消毒法滅菌 將選取好的豆種子放在培養(yǎng)皿中，稱量96ml的次氯酸鈉放于廣口瓶中，將其與放好種子的培養(yǎng)皿平穩(wěn)的放在通風(fēng)櫥內(nèi)密閉的容器內(nèi)，稱取細1的濃鹽酸混于盛有次氯酸鈉廣口瓶中，迅速密封容器，進行滅菌。將滅菌后的種子接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件溫度光周期16/8h。種子萌發(fā)5 7d后，去掉種皮，在子葉節(jié)下3 4mm處切去下胚軸，縱向切開子葉，去掉頂芽和腋芽。每粒種子獲得兩個子葉節(jié)外植體。萌發(fā)培養(yǎng)基的基本成分B5大量鹽和微量鹽， MS 鐵鹽，B5 維生素，2%蔗糖，0. 7mg · Γ^-ΒΑ,Ο. 8%瓊脂，PH = 5. 8。2、侵染與共培養(yǎng)在子葉節(jié)生長點附近輕劃傷口，與重組農(nóng)桿菌菌液(0D· = 0.6-0.8)混合在一起。將其置于搖床上，120rpm侵染30min。將外植體取出，吸干菌液，倒扣在鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3d。共培養(yǎng)培養(yǎng)基為1/10濃度的B5大量鹽和微量鹽，1/10濃度的 MS 鐵鹽，B5 維生素，3%蔗糖，3. 9g · L-1Mes^Omg · L^1AS, 0. 25ug · L-1GA3, ImM · L^1DTT, 8. 8mM · L^L-cysteine, 1. 70mg · L_16-BA,0. 5%瓊月旨，PH = 5. 4。3、叢生芽的誘導(dǎo)及篩選將共培養(yǎng)后的子葉節(jié)用無菌水清洗兩次，然后再用加有除菌劑的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基清洗兩次，用無菌濾紙吸干子葉節(jié)，接種在添加了除菌劑的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進行恢復(fù)培養(yǎng)。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為B5大量鹽和微量鹽，MS鐵鹽，B5維生素，3%蔗糖，0.598·!/^^， 1. 7mg · L_16-BA, IOOmg · ^cefotaxime,0. 8%瓊月旨，PH = 5. 6。在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后，將其轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中進行篩選7d。培養(yǎng)條件為 溫度；光周期16/8h。篩選培養(yǎng)基為B5大量鹽和微量鹽，MS鐵鹽，B5維生素，3% 蔴糖，Mes, 1. 7mg ‘ L-1 6-AP，IOOmg · cefotaxime, 5mg · L-1PPT, 0. 8%瓊月旨， PH = 5. 6。4、抗性芽的伸長和生根將通過篩選的外植體轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入時切掉子葉以及下胚軸基部的老化組織，每7d繼代一次。芽伸長培養(yǎng)基為MS大量鹽和微量鹽，MS鐵鹽，B5維生素，3%蔗糖，0. 59g ·廠1 Mes, 0. 5mg · L-1 GA3,0. Img · L-1 IAA, Img · L-1 ZR, 50mg · L_1L-asparagine, IOOmg · L_1L-pyroglutamic, IOOmg · ^cefotaxime,0. 8%瓊月旨，PH = 5. 6。當(dāng)芽伸長至3 km時，將其貼根剪下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度M±rc ；光周期16/8h。生根培養(yǎng)基為1/2濃度的B5大量鹽和微量鹽，MS鐵鹽，2%蔗糖，0. 59g · L-1Mes, Img · L-1IAB, 0. 8%瓊脂，PH = 5. 6。5、抗性植株的馴化待根足夠發(fā)達后，洗凈根部的培養(yǎng)基，將小苗移入液體培養(yǎng)液中煉苗3 5d，同時打開瓶口，使無菌苗逐漸適應(yīng)有菌的外界環(huán)境。然后將植株取出轉(zhuǎn)至蛭石中避光培養(yǎng)馴化， 同時套袋以保濕，然后逐漸降低濕度、增強光照。待小植株成活后轉(zhuǎn)入正常的土壤中栽培， 保持溫、濕度和正常光照至結(jié)莢成熟。共獲得觀株植株，提取葉片DNA進行PCR檢測。鑒定結(jié)果表明，得到了 Ttl代轉(zhuǎn)基因植株(轉(zhuǎn)TaDREB3A基因植株)。T1代表示Ttl代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T2代表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。將T2代植株進行Southern雜交，結(jié)果明，TaDREB3A基因在大豆基因組中以低拷貝的形式存在。三、轉(zhuǎn)空載體對照植物的獲得用質(zhì)粒pCAMBIA3301轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌，用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆，得到轉(zhuǎn)空載體對照植株，方法同步驟二。四、轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性鑒定分別將三個株系的T2代轉(zhuǎn)基因植株、T2代轉(zhuǎn)空載體對照植株和野生型植株(各60 株)進行耐旱性鑒定和耐鹽性鑒定。均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。1、耐旱性將正常生長3周的幼苗，連續(xù)15d不澆水，然后恢復(fù)澆水，每天觀察表型(見圖8)。 經(jīng)過15d的干旱脅迫后，轉(zhuǎn)基因植株仍然生長良好，偶有輕微萎蔫的葉片，但在恢復(fù)澆水1天后能迅速恢復(fù)正常。野生型植株出現(xiàn)了比較嚴重的萎蔫現(xiàn)象，恢復(fù)澆水后需要5天后才恢復(fù)正常。轉(zhuǎn)空載體對照植株的表型與野生型植株一致。經(jīng)過15d的干旱脅迫后，分別檢測轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的脯氨酸含量、丙二醛含量和SOD活性。結(jié)果表明轉(zhuǎn)TaDREB3A基因可以提高大豆的脯氨酸含量，降低丙二醛含量，提高SOD活性。這些變化對大豆抗逆是有益的。2、耐鹽性將正常生長4周的幼苗，用300mM NaCl澆灌4天，野生型植株葉片明顯變黃，繼續(xù)澆灌3周，野生型植株全部枯死。野生型植株全部枯死時，平行處理的轉(zhuǎn)基因植株僅是葉片枯黃，100%存活，且能正常結(jié)莢。說明轉(zhuǎn)基因植株具有很強抗鹽特性(見圖9)。轉(zhuǎn)空載體對照植株的表型與野生型植株一致，存活率與野生型植株沒有顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因，優(yōu)選為如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第43至1212位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或幻限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
3.含有權(quán)利要求2所述基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
4.如權(quán)利要求3所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為 YEP-GAP-TaDREB3A, pBI121-TaDREB3A, pAHC25-TaDREB3A 或 pCAMBIA-TaDREB3A ；所述YEP-GAP-TaDREB3A為將權(quán)利要求2所述基因插入YEP-GAP的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入 YEP-GAP的EcoRI和BioI酶切識別位點之間得到的重組質(zhì)粒；所述pBI 121-TaDREB3A為將權(quán)利要求2所述基因插入pBI 121的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入 PBI121的BamHI和BioI酶切識別位點之間得到的重組質(zhì)粒；所述pAHC25-TaDREB3A為將權(quán)利要求2所述基因插入pAHC25的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入 PAHC25的SmaI和SpeI酶切識別位點之間得到的重組質(zhì)粒；所述pAHC25-TaDREB3A為將權(quán)利要求2所述基因插入pCAMBIA3301的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入pCAMBIA3301的Sma I和Spe I酶切識別位點之間得到的重組質(zhì)粒。
5.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到耐逆性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2所述基因通過權(quán)利要求3或4所述重組表達載體導(dǎo)入所述目的植物中；所述耐逆性為耐非生物脅迫或抗病。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述耐非生物脅迫為耐旱和/或耐鹽和/或耐高溫；所述目的植物為擬南芥，優(yōu)選為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥；所述方法為將權(quán)利要求2 所述基因通過所述pBI121-TaDREB3A導(dǎo)入所述目的植物中。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于 所述目的植物為小麥，優(yōu)選為濟麥19 ；所述抗病為抗白粉??；所述白粉病是由白粉病病原菌E09引起的； 所述方法為將權(quán)利要求2所述基因通過所述pAHC25-TaDREB3A導(dǎo)入所述目的植物中。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于 所述耐非生物脅迫為耐旱和/或耐鹽； 所述目的植物為大豆，優(yōu)選為東農(nóng)50 ；所述方法為將權(quán)利要求2所述基因通過所述pCAMBIA-TaDREB3A導(dǎo)入所述目的植物中。
10.權(quán)利要求1所述蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物耐逆性相關(guān)蛋白TaDREB3A及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的TaDREB3A在干旱、高鹽、高溫、低溫、病原菌、ABA、乙烯、JA、SA誘導(dǎo)下表達，可以特異的調(diào)控含有DRE/CRT順式元件(核心序列CCGAC)的基因的轉(zhuǎn)錄表達；提高植物的抗旱性、耐鹽性、耐高溫性，以及對白粉病病原菌的抗性。本發(fā)明的TaDREB3A為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物中發(fā)揮重要的作用。
文檔編號C12N15/63GK102234323SQ20101016170
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日
發(fā)明者徐兆師, 李文濱, 李連城, 陳明, 馬有志 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所