專利名稱：一種活性重組核糖核酸酶抑制劑的高效可溶性表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及重組核糖核酸酶抑制劑的原核表達(dá)。
背景技術(shù)：
核糖核酸酶抑制劑(RNase Inhibitor,RI)是一種分子量約為50KDa的蛋白分子， 能夠結(jié)合和抑制哺乳類胰核糖核酸酶(RNase)超家族的多種成員。RI是一種胞漿蛋白，在許多哺乳動(dòng)物組織中廣泛存在。它通過(guò)與多種核糖核酸酶緊密結(jié)合形成1 1的復(fù)合體，抑制這些核糖核酸酶的活性。盡管RNase超家族的一些成員的同源性有很大差異，RI與它們形成的復(fù)合物，其解離常數(shù)在0.5-200fM的水平(Lee FS, Shapiro R,Vallee BL. Tight—binding inhibition ofangiogenin and ribonuclease A by placental ribonuclease inhibitor.Biochemistry,1989, 28 :225-30 ；Shapiro R,Vallee BL. Interaction of human placental ribonucleasewith placental ribonuclease inhibitor. Biochemistry. 1991 ；30 :2246-2255)。RI 與這些配體 RNase 的高親和力，在自然界中極為罕見。在一些分子生物學(xué)研究中，RI可用于防止核糖核酸酶污染可能引起的問(wèn)題，如在 mRNA反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，無(wú)細(xì)胞的體外蛋白翻譯實(shí)驗(yàn)，和其他涉及RNA研究的工作中。天然核糖核酸酶抑制劑可從人胎盤中分離純化(Blacliburn P.Ribonucleaseinhibitor from human placenta :rapid purification and assay. J Biol Chem. 1979 :口484-7)，也可以從一些哺乳動(dòng)物組織中提取純化(Gribnau AA, Schoenmakers JG, van Kraaikamp M，Bloemendal H. High purification of the RNaseinhibitor from rat liver by affinity chromatography. Biochem Biophys Res Commun. 1970 ；38 :1064-8 ；Garcia MA, Klebe RJ. Affinity chromatography of RNaseInhibitor. Mol Biol Rep. 1997 ；24 :231-3 ；Chatterjee J, Maiti TK, Dasgupta S.Isolationand partial characterization of ribonuclease inhibitor from goat liver. Protein PeptLett. 2006 ；13 :779-83)。對(duì)牛、豬、羊、小鼠和大鼠來(lái)源的 RI 研究 (Burton LE, FucciNP. Ribonuclease inhibitors from the livers of five mammalian species. Int J PeptProtein Res. 1982 ；19 :372-9)顯示，它們具有與人胎盤來(lái)源的 RI 相近的性質(zhì)和氨基酸組成。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)基因重組表達(dá)人、大鼠和豬RI，也在大腸桿菌和其它表達(dá)宿主獲得了成功(美國(guó)專利5，552，302 ；美國(guó)專利5，965，399 ；美國(guó)專利5，932，440 ； Klink TA，Vicentini AM，Hofsteenge J，Raines RT. High-Ievelsoluble production and characterization of porcine ribonuclease inhibitor. ProteinExpr Purif.2001 ； 22 :174-9 ；Park JH，Hwang IS，Kim KI，Lee JM，Park YM，Park CH，Chung IS. Functional expression of recombinant human ribonuclease/angiogenininhibitor in stably transformed Drosophila melanogaster S2 cells· Cytotechnology· 20080以大腸桿菌為宿主的原核重組表達(dá)方法，具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉等突出優(yōu)點(diǎn)。然而，特定基因的表達(dá)依賴于諸多因素，有時(shí)基因表達(dá)會(huì)引起宿主細(xì)胞死亡。大腸桿菌表達(dá)時(shí)還會(huì)出現(xiàn)包含體表達(dá)，產(chǎn)生無(wú)活性蛋白產(chǎn)物，需要體外復(fù)性。人、大鼠和豬RI具有相近的性質(zhì)和較高的基因同源性，其原核表達(dá)主要面臨無(wú)活性包含體表達(dá)的問(wèn)題?？寺〉娜薘I基因表達(dá)產(chǎn)物，以無(wú)活性的包含體形式存在，需要體外折疊復(fù)性，而其復(fù)性率很低；在人RI基因融合先導(dǎo)信號(hào)肽編碼基因，也無(wú)法獲得活性產(chǎn)物；而某些表達(dá)策略可直接導(dǎo)致宿主菌的死亡(美國(guó)專利5，552，302)?？寺〉拇笫驲I基因，需要與小片斷的其他基因序列融合表達(dá)，才能獲得表達(dá)產(chǎn)物，少量可溶性的活性蛋白和無(wú)活性的包含體并存于宿主菌內(nèi)；克隆的豬RI 基因的原核表達(dá)可引起宿主菌生長(zhǎng)抑制或死亡(美國(guó)專利5，965，399)?？偟膩?lái)說(shuō)，由RI基因原核表達(dá)獲得活性產(chǎn)物的產(chǎn)量很低，一般在0. 25mg/L菌液的水平(Klink TA, Vicentini AM,Hofsteenge J,Raines RT. High-Ievelsoluble production and characterization of porcine ribonuclease inhibitor. ProteinExpr Purif. 2001 ;22 :174-9)。為提高 RI 基因原核表達(dá)的活性產(chǎn)物的產(chǎn)量，Klink等在該文獻(xiàn)采用Trp啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)，獲得豬RI基因的高效可溶性表達(dá)，高密度發(fā)酵時(shí)產(chǎn)量在15mg/L菌液或lmg/g濕菌體的水平，但需要更換培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)，操作繁雜。RI蛋白分子含有30個(gè)左右的游離巰基，巰基氧化會(huì)導(dǎo)致RI的活性喪失，因此需在一定濃度的還原劑如DTT存在下保存和使用。小鼠RI的巰基排列與其它種屬的蛋白分子有所不同；美國(guó)New England Biolabs(NEB)公司所售重組小鼠RI (M0314)的說(shuō)明指示， 小鼠RI具有明顯的抗氧化失活作用，可在很低濃度還原劑時(shí)保持活性。盡管已有商品化的重組小鼠RI提供，而且編碼小鼠RI的完全基因序列已經(jīng)報(bào)告(NCBI序列號(hào)AF071546 ； NM_145135)，但其在大腸桿菌或其他表達(dá)宿主的有效重組表達(dá)活性產(chǎn)物的方法，尚無(wú)報(bào)告。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種重組核糖核酸酶抑制劑(RI)。本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)便易行和低成本高效獲得活性重組核糖核酸酶抑制劑的方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，將含有小鼠核糖核酸酶抑制劑(mRI)的編碼基因的重組質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化具有蛋白酶基因缺陷的工程菌，經(jīng)過(guò)適當(dāng)誘導(dǎo)， 可獲得較高水平活性產(chǎn)物的可溶性表達(dá)。實(shí)施本發(fā)明，需首先獲得編碼小鼠RI氨基酸序列的全長(zhǎng)cDNA克隆。按照已知的完全基因序列(NCBI序列號(hào)AF071546 ；NM_145135)或相應(yīng)多肽序列，用反轉(zhuǎn)錄PCR可直接獲得全長(zhǎng)cDNA克隆。全長(zhǎng)cDNA克隆也可通過(guò)cDNA文庫(kù)篩選的方法，或人工合成的方法獲得。人工合成的基因序列可以與天然cDNA序列相同，也可以按照小鼠RI氨基酸序列，用公知的設(shè)計(jì)方法合成不同的簡(jiǎn)并編碼。將編碼小鼠RI的cDNA克隆，連接到表達(dá)載體中，是分子生物學(xué)領(lǐng)域公知的方法。 各種商品化的原核表達(dá)載體，可提供選擇。如PQE30和pQE80L(Qiagen)，可生成His_6(六組氨酸)標(biāo)簽多肽融合的目的蛋白，該融合蛋白維持完全的核糖核酸酶抑制活性，并且可以用His-6特異性的金屬親和層析方法一步純化。其它類型的融合表達(dá)載體，如含有編碼 TrxA(硫氧還蛋白)的表達(dá)載體，可生成TrxA融合的目的蛋白。可溶性的活性蛋白和無(wú)活性的包含體并存于宿主菌內(nèi)。通常，在較低溫度下長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)，可溶性蛋白的表達(dá)量可獲提高。出于意料之外的是，經(jīng)過(guò)常規(guī)的表達(dá)條件優(yōu)化，重組小鼠RI (rmRI)在大腸桿菌中可溶性表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后，產(chǎn)量明顯高于一般文獻(xiàn)的報(bào)道。本發(fā)明還意外發(fā)現(xiàn)，在不同宿主菌進(jìn)行表達(dá)時(shí)，除可溶性表達(dá)的目的蛋白產(chǎn)量有所差異外，其產(chǎn)物的活性也有明顯差異。 在蛋白酶基因缺陷的BL21及其衍生的工程菌如BL21 (DE3)pLysS等，小鼠RI可獲高效可溶性表達(dá)，而其RNaseA抑制活性與人RI的活性相當(dāng)；在TGl或ToplO等工程菌表達(dá)時(shí)，純化產(chǎn)物的RNaseA抑制活性明顯降低。在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模O00_400ml搖瓶培養(yǎng))誘導(dǎo)表達(dá)中，純化的活性rmRI產(chǎn)量可高達(dá)4-8mg/L，或lmg/g濕菌體，與文獻(xiàn)報(bào)告的最高可溶性表達(dá) (Klink TA, Vicentini AM, Hofsteenge J, Raines RT. High-level soluble production and characterization ofporcine ribonuclease inhibitor. Protein Expr Purif. 2001 ； 22:174-9)產(chǎn)量相當(dāng)，而操作簡(jiǎn)單許多。表達(dá)的宿主菌經(jīng)常規(guī)的破碎方法，如凍融法、超聲破碎法、其它機(jī)械或化學(xué)破碎方法，收取含有可溶性表達(dá)產(chǎn)物的上清液?；钚詒mRI產(chǎn)物可通過(guò)公知的蛋白純化技術(shù)進(jìn)行純化，如鹽析法和各種層析方法。優(yōu)選的方案中，活性rmRI產(chǎn)物可通過(guò)標(biāo)簽多肽的親和層析技術(shù)，如His-6特異性的金屬親和層析方法，純化獲得。融合標(biāo)簽多肽的rmRI，通常維持完全或部分的核糖核酸酶抑制活性。優(yōu)選的方案中，標(biāo)簽多肽可用特異性切割蛋白融合序列的蛋白酶切除。本發(fā)明獲得的活性rmRI，與重組表達(dá)的人RI具有基本一致的核糖核酸酶抑制活性，可用于防止核糖核酸酶污染可能引起問(wèn)題的一些分子生物學(xué)研究中，或其他通過(guò)抑制核糖核酸酶活性取得一定生物學(xué)效應(yīng)的體外和體內(nèi)應(yīng)用中。


圖1. mRI原核表達(dá)載體在不同宿主菌中的轉(zhuǎn)化效率。將A 空載體pQE30 ；B 表達(dá)蛋白mRI的重組質(zhì)粒pQE30-mRNH ；C 表達(dá)蛋白mRI的重組質(zhì)粒pQE80L_mRNH分別轉(zhuǎn)化到四種宿主菌 T0P10、TGI、BL21 (DE3)pLysS、BL21 (DE3)Rosetta 中。pQE30_mRNH 的轉(zhuǎn)化克隆明顯少于pQE80L-mRNH和空載體pQE30的轉(zhuǎn)化克隆。圖2.目的蛋白mRI的原核表達(dá)質(zhì)粒pQE80L_mRNH在E. coli T0P10、TGU BL21(DE3)pLysS三種宿主菌中的表達(dá)。37°C，生長(zhǎng)至菌液濃度0D600在0. 4時(shí)，ImM IPTG 誘導(dǎo)4h，收取全菌進(jìn)行蛋白電泳(SDS-PAGE)。以未用IPTG誘導(dǎo)的相應(yīng)宿主菌為空白對(duì)照。 右側(cè)箭頭標(biāo)示為目的蛋白位置。圖3.重組質(zhì)粒pQE80L-mRNH在E. coli BL21 (DE3)pLysS宿主菌中的誘導(dǎo)表達(dá)。 370C，生長(zhǎng)至菌液濃度0D600在0. 4時(shí)，ImM IPTG誘導(dǎo)4h，收取全菌裂解，上清和沉淀進(jìn)行蛋白電泳(SDS-PAGE)。以未用IPTG誘導(dǎo)的宿主菌為空白對(duì)照。右側(cè)箭頭標(biāo)示為目的蛋白位置。圖4.表達(dá)條件對(duì)重組質(zhì)粒pQE80L-mRNH在E. coli BL21 (DE3)pLysS中表達(dá)的影響。27°C培養(yǎng)至菌液濃度0D600為0. 8時(shí)，分別使用ImM和0. ImM IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)或16 小時(shí)，收取全菌進(jìn)行蛋白電泳(SDS-PAGE)。以未用IPTG誘導(dǎo)的宿主菌為空白對(duì)照。右側(cè)箭頭標(biāo)示為目的蛋白位置。圖5. mRI重組質(zhì)粒pQE80L_mRNH在E. coli BL21 (DE3)pLysS菌中的可溶性表達(dá)和純化。27°C培養(yǎng)至菌液濃度0D600為0. 8時(shí)，用ImM IPTG誘導(dǎo)16小時(shí)，收取全菌。裂解離心后，上清液經(jīng)鎳親和層析，5 50mM咪唑溶液清洗，100 300mM咪唑溶液洗脫。蛋白電泳(SDS-PAGE)分離，右側(cè)箭頭所示為目的蛋白所在位置。
圖6. his-mRI蛋白分子量鑒定。飛行質(zhì)譜(MALDI-T0F)測(cè)定his-mRI蛋白分子量為 51420。圖 7.重組質(zhì)粒 pQE80L-mRNH 在 E. coli BL21 (DE3)pLysS, TGl 和 T0P10 三種宿主菌中可溶性表達(dá)純化比較。pQE80L-mRNH轉(zhuǎn)化的pLysS，TGI, ToplO，27°C培養(yǎng)至菌液濃度 0D600為0. 8時(shí)，用ImM IPTG誘導(dǎo)16小時(shí)，收取全菌。裂解離心后，上清液經(jīng)鎳親和層析， 5 50mM咪唑溶液清洗，300mM咪唑溶液洗脫。ToplO菌中表達(dá)的蛋白有明顯降解。蛋白電泳(SDS-PAGE)分離，右側(cè)箭頭標(biāo)示位置分別為目的蛋白His-mRI以及降解條帶位置。圖8.重組質(zhì)粒pRLTEV-mRNH在Ε. coli BL21 (DE3) pLysS菌中的可溶性表達(dá)純化。 27°C培養(yǎng)至菌液濃度0D600為0. 1時(shí)，用0. ImM IPTG誘導(dǎo)8小時(shí)，收取全菌。裂解離心后， 上清液經(jīng)鎳親和層析，300mM咪唑PBS溶液洗脫后，依次用TEV酶切去除His-TrxA標(biāo)簽，硫酸銨沉淀mRI后重溶解蛋白樣品再次通過(guò)鎳親和層析，流出液經(jīng)50%甘油PBS溶液透析，濃縮蛋白樣品。各樣品經(jīng)蛋白電泳(SDS-PAGE)分離。圖9. TrxA-mRI蛋白分子量鑒定。飛行質(zhì)譜(MALDI-T0F)測(cè)定A :TrxA_mRI蛋白分子量為66四8 ；B =TEV切除TrxA后，mRI蛋白分子量為50621。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例的陳述是為更好地理解本發(fā)明的原理和應(yīng)用，而不限定本發(fā)明的使用范圍。1.材料與方法牛胰RNase A購(gòu)自北京沁源惠幟生物技術(shù)有限公司；hRI (重組人RI)為!Iomega 公司產(chǎn)品(商品名RNasin Ribonuclease Inhibitor)，酵母rRNA購(gòu)自上?？笊锛夹g(shù)有限公司，使用之前經(jīng)過(guò)純化處理。阿魏酸(FA)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。 Ni-IDAAgarose購(gòu)自威格拉斯生物技術(shù)有限公司。純化蛋白的定量分別用5μ 1，10μ 1，20μ 1濃度為0. 2mg/ml牛血清白蛋白 (BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，與純化蛋白一同進(jìn)行SDS-PAGE電泳?？捡R斯亮藍(lán)染色，Quantikan 軟件對(duì)凝膠進(jìn)行灰度掃描，依據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目的蛋白含量。質(zhì)譜分析取5μ 1蛋白樣品經(jīng)a^phadex G-10離心柱脫鹽，得到的樣品與質(zhì)譜基質(zhì)FA 1 1混合點(diǎn)樣。經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0FMS) (MALDI-T0F/T0F Analyzer 4800plus, Applied Biosystem)對(duì)樣品蛋白進(jìn)行定性分析。核糖核酸酶活性及核糖核酸酶抑制劑活性測(cè)定核糖核酸酶的活性測(cè)定參考文獻(xiàn)[Umansky SR, Piker EG, Adler W. Ribonuclease activity of rat thymus chromatinproteins. Experientia. 1974 ；30 (7) :734-6]白勺 TCA 'iji U fe， 25mM Tris-HCl (pH8. 0), ImM EDTA，0. 01 % BSA 為緩沖液，適量的 RNase A 以及 8 μ g 酵母 rRNA， 37°C室溫反應(yīng)15min，放置冰上，加入等體積預(yù)冷的10% TCA，冰上放置15min。4°C 12000rpm 離心lOmin，取上清，0D280檢測(cè)光密度值。上述反應(yīng)中加入不同濃度的待測(cè)核糖核酸酶抑制劑與5 μ g RNase A混合，測(cè)定核糖核酸酶抑制劑對(duì)RNase A的抑制作用。抑制5ng RNase A活性50%的RI活性，定義為1個(gè)活性單位(U)。2.小鼠RI cDNA的克隆取昆明種小鼠肺組織，用總RNA提取試劑RNAVzol (威格拉斯生物技術(shù)有限公司)按說(shuō)明方法提取總RNA。5 μ g總RNA加入20 μ 1反轉(zhuǎn)錄體系中，該體系含有10 X RT-buffer 2 μ 1，隨機(jī)引物 200ng，dNTPs 0. 5mM, DTT IOmM, RNasin(Promega) IOu 和反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV H-(威格拉斯生物技術(shù)有限公司)1μ 1，42°C孵育50min合成cDNA第一鏈，70°C孵育IOmin 滅活 M-MLV，-20°C保存。設(shè)計(jì)和合成 PCR 上游引物 5 ‘ -ataagatctatgagtcttgacatcca gtgtgagc-3, Τ" iit 弓I · 5 ‘ -atagtcgactcaggaaatgatcctcagggaagg-3 ‘ (Invitrogen, Shanghai)，分別含有Bgl 11和Sal I酶切位點(diǎn)。100 μ 1 PCR反應(yīng)體系中含有10 X PCR-buffer 10 μ 1, cDNA 2 μ 1, dNTPs (2. 5mM)4y 1，上下游引物(40 μ Μ)各 1 μ 1, LA Taq 2· 5u。PCR 反應(yīng)經(jīng)94°C預(yù)變性3min, 35個(gè)包括變性(94°C /30s)、退火(55°C /30s)、延伸(72°C /50s)的循環(huán)和一個(gè)最后的延伸(72°C/7min)步驟完成。反應(yīng)結(jié)束后取5 μ 1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，0. 8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得約1. 4kb的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物與pBSK-T載體連接，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞。獲取含有插入片斷的陽(yáng)性克隆。提取質(zhì)粒，獲得的mRNH/pBSK經(jīng)BglII和Mil酶切證實(shí)含有1. 4kb的插入片斷。mRNH/ PBSK經(jīng)雙向序列測(cè)定(Invitrogen, Shanghai)，獲得小鼠RI的全長(zhǎng)cDNA含有1371個(gè)堿基，測(cè)定編碼序列與已知小鼠基因序列(NCBI序列號(hào)AF071546 ；NM_145135)進(jìn)行比對(duì)，其核酸序列的一致性達(dá)99%以上?；蛐蛄械牟町惪赡軄?lái)源于不同小鼠種系的遺傳差異，但不能排除基因操作或序列測(cè)定時(shí)人為的誤查。該核酸序列編碼的蛋白序列與已知小鼠RI蛋白序列(NCBI序列號(hào)AF071546 ； NM_145135)進(jìn)行比對(duì)，蛋白序列的一致性分別為98%和99%。與人、大鼠、豬等已知RI蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，其同源性分別為87%，94%和87%。3.小鼠RI cDNA的表達(dá)載體構(gòu)建mRNH/pBSK質(zhì)粒DNA經(jīng)Bgl 11和Sal I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離純化1. 4kb的 DNA 片斷，分別與 BamHI 和 SalI 處理的 pQE30, pQE80L 載體(Qiagen)，及 BamHI 和 XhoI 處理的PRLTEV載體(威格拉斯生物技術(shù)有限公司)連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞。 獲取含有插入片斷的陽(yáng)性克隆。獲得的表達(dá)載體pQE30-mRNH和pQE80L_mRNH中，小鼠RI cDNA的5'端融合有編碼額外包含His-6(六組氨酸)的12個(gè)氨基酸殘基的載體基因序列， 它們表達(dá)目的蛋白(His6-mRI)的理論分子量為51212Da，表達(dá)載體pRLTEV-mRNH中，小鼠 RIcDNA的5'端融合有編碼額外包含TrxA(硫氧還蛋白)和TEV蛋白酶切位點(diǎn)(ENLYFQ) 的載體基因序列，它表達(dá)目的蛋白(TrxA-mRI)的理論分子量為65789Da ;TEV蛋白酶處理去除TrxA后，其蛋白的理論分子量為50256Da。4. His6-mRI的表達(dá)與純化表達(dá)載體pQE30-mRNH和 pQE80L_mRNH 的質(zhì)粒 DNA 分別轉(zhuǎn)化 ToplO,TGUBL21 (DE3) pLysS 和 BL21 (DE3) Rosetta 感受態(tài)細(xì)胞。與 ToplO 和 TGl 相比，pQE30_mRNH 對(duì) BL21 (DE3) PLysS和BL21 (DE3) Rosetta的轉(zhuǎn)化效率明顯降低，而pQE80L_mRNH對(duì)各種感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率與空載體相當(dāng)(圖1)。由于PQE80L載體含有編碼額外LacI的基因框架，能夠抑制目的基因的基礎(chǔ)表達(dá)，推測(cè)pQE30-mRNH在BL21 (DE3) pLysS和BL21 (DE3) Rosetta有一定的基礎(chǔ)表達(dá)，從而對(duì)該菌種產(chǎn)生毒性。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，含有pQE30-mRNH和pQE80L_mRNH 質(zhì)粒的Top 10、TGl和BL21 (DE3) pLysS宿主菌均有額外的約50kD蛋白表達(dá)(圖幻。含有 pQE30-mRNH 和 pQE80L_mRNH 質(zhì)粒的 BL21 (DE3)pLysS 和 BL21 (DE3) Rosetta 宿主菌在 IPTG 誘導(dǎo)后，生長(zhǎng)明顯延緩。SDS-PAGE顯示，表達(dá)的宿主菌裂解后目的蛋白以包含體沉淀中為主(圖 3)。200 400ml經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的宿主菌，離心收取菌體，重懸于含1 % Triton-XlOO的 PBS中。經(jīng)凍融和超聲破碎，離心收取含可溶性目的蛋白的上清液。上清液通過(guò)Ni-IDA瓊脂糖親和基質(zhì)吸附，PBS清洗，和含20-300mM咪唑的PBS梯度洗脫，可獲得純化的His-mRI。 0. 1 ImM IPTG 27°C誘導(dǎo)16小時(shí)，目的蛋白表達(dá)量增高(圖4)，可溶性蛋白的收取量明顯提高。可溶性表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳親和層析純化(圖5)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定，單一峰顯示His-mRI分子量在51. 4kD左右(圖6)，與理論分子量基本一致，符合預(yù)期。在BL21 (DE3)pLysS宿主菌的His6-mRI產(chǎn)量為4 8mg/L菌液，或lmg/g濕菌體；ToplO、TGl宿主菌中產(chǎn)量相當(dāng)或略低。與重組人RI的活性相比，BL21 (DE3)pLysS宿主菌的His6-mRI活性接近，但ToplO、 TGl宿主菌純化產(chǎn)物的RNaseA抑制活性明顯降低(表1)。在多次的表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，有時(shí)會(huì)遇到表達(dá)及純化產(chǎn)物出現(xiàn)降解的情況(圖7)，推測(cè)ToplO、TGl宿主菌的表達(dá)產(chǎn)物的活性較低與產(chǎn)物降解有關(guān)；而BL21 (DE3)pLysS宿主菌由于存在蛋白酶缺陷表型，可能表達(dá)產(chǎn)物不易降解，能維持較高活性。ToplO宿主菌以明顯降解片斷為主的表達(dá)產(chǎn)物仍維持較低活性(表 1)，也可能與殘留的少量未降解產(chǎn)物的活性有關(guān)。4. TrxA-mRI的表達(dá)與純化表達(dá)載體pRLTEV-mRNH的質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng) 0. ImM IPTG誘導(dǎo)后，有額外的約66kD蛋白表達(dá)，可溶性表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行鎳親和層析純化后，300mM咪唑PBS溶液洗脫，TEV酶切作用去除TrxA標(biāo)簽后，飽和硫酸銨沉淀mRI蛋白，使用PBS溶液重溶解后的蛋白樣品，再次通過(guò)鎳親和層析，流出液經(jīng)50%甘油PBS溶液透析濃縮蛋白樣品(圖8)。TrxA融合的蛋白產(chǎn)物優(yōu)化表達(dá)，經(jīng)純化后收取量約為4 5mg/L，經(jīng)質(zhì)譜鑒定，分子量為66. 3kD左右，與理論分子量基本一致(圖9A)，其比活性約為 16kunits/mg ；TEV酶切去除TrxA后，純化的mRI的收取量約為1 ang/L，質(zhì)譜分析蛋白分子量為50. 6kD(圖9B)，比活性約為39kimits/mg，與重組人RI的活性相當(dāng)。表1 :PQE80L-mRNH轉(zhuǎn)化不同宿主菌的His-mRI蛋白可溶性表達(dá)、純化與活性鑒定。
權(quán)利要求
1.一種在大腸桿菌來(lái)源的宿主菌中，通過(guò)轉(zhuǎn)化重組核糖核酸酶抑制劑編碼基因的原核表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)一定條件下的誘導(dǎo)，獲得活性重組核糖核酸酶抑制劑的高效可溶性表達(dá)的方法，特征在于(1)所述的核糖核酸酶抑制劑編碼基因，是小鼠核糖核酸酶抑制劑編碼基因(CDNA)；(2)所述的宿主菌，是具有蛋白酶基因缺陷的工程菌；(3)所述的誘導(dǎo)條件，是低于37°C培養(yǎng)溫度下誘導(dǎo)表達(dá)。
2.權(quán)利要求1所述的具有蛋白酶基因缺陷宿主菌，是BL21或其衍生的工程菌。
3.權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)溫度，是在室溫下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
全文摘要
一種活性重組核糖核酸酶抑制劑的高效可溶性表達(dá)方法。技術(shù)領(lǐng)域 生物工程。本發(fā)明公開了一種簡(jiǎn)便易行和低成本獲得活性重組核糖核酸酶抑制劑的有效方法。將表達(dá)小鼠核糖核酸酶抑制劑(mRI)的編碼基因的重組質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化具有蛋白酶基因缺陷表型的工程菌，經(jīng)過(guò)適當(dāng)誘導(dǎo)，可獲得較高水平活性產(chǎn)物的可溶性表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102234649SQ20101016205
公開日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月5日
發(fā)明者孫婧慧, 王楠, 葛瑩 申請(qǐng)人:威志蘭斯醫(yī)學(xué)科技(北京)有限公司