專利名稱：微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫淀粉酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物學、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種低溫淀 粉酶微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。該發(fā)明生產(chǎn)的低溫淀粉酶主要應用于食品加工、中草藥提取、造 紙、紡織、印染、洗滌、環(huán)境保護以及其它淀粉酶應用行業(yè)?？梢蕴岣咴系睦寐?、轉化率 和生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，改善并提高產(chǎn)品質量。
背景技術：
淀粉酶是催化淀粉水解轉化成葡萄糖、麥芽糖及其他低聚糖的一組酶的總稱，廣 泛存在于動物、植物和微生物中(錢海豐等，西北農(nóng)業(yè)學報，200 。淀粉酶作為生物制劑， 已經(jīng)廣泛應用于食品加工、中草藥提取、造紙、紡織、印染、洗滌、環(huán)境保護以及其它淀粉酶 應用行業(yè)。國內(nèi)外目前使用的淀粉酶主要為中溫和高溫型淀粉酶。有關低溫淀粉酶的研 究是起步階段，主要研究菌種選育、發(fā)酵條件優(yōu)化、酶學性質以及相關基因克隆等(張剛 等，海洋科學，2002 ；傅力等，農(nóng)產(chǎn)品加工，2007 ；王淑軍等，中國釀造，2008 ；劉志培等，環(huán)境 科學，2009)；而低溫淀粉酶產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化生產(chǎn)及應用還未見報道。低溫淀粉酶與高溫、中 溫淀粉酶相比具有很大的應用優(yōu)勢，因為低溫淀粉酶在低溫條件下具有高酶活力及高催化 效率；可減少加工工藝，縮短加工過程的時間并省卻昂貴的加熱或冷卻費用；在節(jié)能方面 有相當大的優(yōu)勢；經(jīng)過溫和的熱處理可使低溫酶的活力喪失；低溫或適溫處理有助于提高 產(chǎn)品品質和質量(孫謐等，海洋水產(chǎn)研究，200 ，低溫淀粉酶上述特性有助于其推廣和應 用。低溫淀粉酶的應用將對傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、輕工、能源和環(huán)保等領域產(chǎn)生深遠的影 響。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫淀粉酶，按原料重量0. 1%。 0. 5%。的量添加于生料發(fā)酵、 食品加工和多孔淀粉生產(chǎn)等領域中，在7 20°C處理0. 5 1.證，可以提高原料的轉化率 15. 4% 8%，降低了生產(chǎn)成本，改善并提高產(chǎn)品質量，從根本上擺脫中溫、高溫酶的加 熱、冷卻設備和工藝。低溫淀粉酶具有非常巨大的開發(fā)潛力和應用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫淀粉酶的方法，該方法主要是微生 物經(jīng)過低溫馴化后，在14 20°C液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫淀粉酶的方法，這種生產(chǎn)方法獲得的低 溫淀粉酶粗酶液活性可以達到199. 8U/mL，如再經(jīng)過分離和純化，可以得到不同濃度和純度 的酶制劑。當該酶制劑活性為1000U/mL或1000U/g，0. 1%。 0. 5%。的添加量應用于生料發(fā) 酵、食品加工和多孔淀粉生產(chǎn)等領域中，在6 18°C處理0. 5 1.證，可以提高原料的轉化 率15. 4% 8%。該酶制劑應用操作簡單、方便、快捷、成本低?？梢詮母旧媳苊庵袦亍?高溫酶的加熱、冷卻設備和工藝。本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫淀粉酶的方法具體包括以下步驟(1)將產(chǎn)生淀粉酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環(huán)境中生長良好；(2)按常規(guī)方法將低溫馴化后的淀粉酶產(chǎn)生菌在14 20°C逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發(fā)酵液體積的2 8%接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基 中，在14 20°C培養(yǎng)48 144h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫淀粉酶結束；(4)將(3)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(5)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化， 制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。本發(fā)明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。淀粉酶產(chǎn)生菌(例如， CGMCC菌種編號1. 2323τ或1. 447或1. 504等)，菌株先活化，再經(jīng)過逐級低溫馴化，發(fā)酵生 產(chǎn)低溫淀粉酶時按本發(fā)明方法進行培養(yǎng)。低溫馴化后的菌株在4°C環(huán)境中可保存2個月，用 25 40%甘油制成的菌懸液在零下80°C條件下可以長期保藏。
具體實施例方式實施例一(1)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水 1. 0L, pH 值 7. 0，121°C 高壓蒸氣滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基淀粉10. 0 20. 0g，蛋白胨10. 0 20. 0g, NaCl 7. 0 12. Og,瓊脂20. Og,蒸餾水1. 0L, pH值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基淀粉5.0 8. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 5. 0 8. 0g， K2SO4O. 8 1. 2g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。④產(chǎn)酶培養(yǎng)基淀粉12. 0 15. 0g，牛肉膏3. 0 6. 0g，NaCl 14. 0 20. 0g， K2S042. 0 4. 0g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。(2)將產(chǎn)生淀粉酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的 菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環(huán)境中生長良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的淀粉酶產(chǎn)生菌在14 16°C培養(yǎng)48 72h，按5% 的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發(fā)酵液體積2 4%的接種量接入10L的產(chǎn)酶培養(yǎng) 基中，在14 16°C培養(yǎng)96 144h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫淀粉酶結束；(6)將(5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(7)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化， 制備成不同活性、純度和劑型的低溫淀粉酶制劑。實施例二
(1)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水 1. 0L, pH 值 7. 6，121°C 高壓蒸氣滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基淀粉10. 0 20. 0g，蛋白胨10. 0 20. 0g, NaCl 7. 0 12. Og,瓊脂20. Og,蒸餾水1. 0L, pH值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基淀粉5.0 8. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 5. 0 8. 0g， K2SO4O. 8 1. 2g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。④產(chǎn)酶培養(yǎng)基淀粉12. 0 15. 0g，牛肉膏3. 0 6. 0g，NaCl 14. 0 20. 0g， K2S042. 0 4. 0g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。(2)將產(chǎn)生淀粉酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的 菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環(huán)境中生長良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的淀粉酶產(chǎn)生菌在16 18°C培養(yǎng)48 72h，按5% 的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發(fā)酵液體積4 6%的接種量接入50L的產(chǎn)酶培養(yǎng) 基中，在16 18°C培養(yǎng)72 96h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫淀粉酶結束；(6)將(5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(7)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化， 制備成不同活性、純度和劑型的低溫淀粉酶制劑。實施例三(1)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水 1. 0L, pH 值 7. 6，121°C 高壓蒸氣滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基淀粉10. 0 20. 0g，蛋白胨10. 0 20. 0g, NaCl 7. 0 12. Og,瓊脂20. Og,蒸餾水1. 0L, pH值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基淀粉5.0 8. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 5. 0 8. 0g， K2SO4O. 8 1. 2g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。④產(chǎn)酶培養(yǎng)基淀粉12. 0 15. 0g，牛肉膏3. 0 6. 0g，NaCl 14. 0 20. 0g， K2S042. 0 4. 0g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。(2)將產(chǎn)生淀粉酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的 菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環(huán)境中生長良好；
(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的淀粉酶產(chǎn)生菌在18 20°C培養(yǎng)48 72h，按5% 的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發(fā)酵液體積6 8%的接種量接入100L的產(chǎn)酶培養(yǎng) 基中，在18 20°C培養(yǎng)48 72h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫淀粉酶結束；(6)將(5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(7)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化， 制備成不同活性、純度和劑型的淀粉酶制劑。實施例四按實施例一、二和三方法生產(chǎn)的低溫淀粉酶制劑，平均酶活性為1000U/mL，將活性 為1000U/mL或1000U/g的低溫淀粉酶制劑，按原料重量0. 1%。 0. 5%。的量添加于生料發(fā) 酵、食品加工和多孔淀粉生產(chǎn)等領域中，在7 20°C處理0. 5 1.證，可以提高原料的利用 率、轉化率和生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，改善并提高產(chǎn)品質量。低溫淀粉酶應用部分實驗結果 見下表。
權利要求
1.一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫淀粉酶的方法，其包括以下步驟(1)將產(chǎn)生淀粉酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環(huán)境中生長良好；(2)按常規(guī)方法將篩選出的淀粉酶產(chǎn)生菌在14 20°C逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級 種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發(fā)酵液體積的2 8%接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中， 在14 20°C培養(yǎng)48 144h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫淀粉酶結束；(4)將(3)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(5)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備 成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中菌種低溫馴化培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng) 基分別為(1)菌種低溫馴化培養(yǎng)基淀粉10.0 20. 0g，蛋白胨10. 0 20. 0g, NaCl 7. 0 12. Og,瓊脂20. Og,蒸餾水1. 0L, pH值7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。(2)液體種子培養(yǎng)基淀粉5.0 8. 0g，牛肉膏2. 0 4. 0g, NaCl 5. 0 8. 0g, K2SO4 0. 8 1. 2g, CaCl2 0. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值 7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣火菌30min。(3)產(chǎn)酶培養(yǎng)基淀粉12. 0 15. 0g，牛肉膏 3. 0 6. 0g, NaCl 14. 0 20. 0g, K2SO4 2. 0 4. 0g, CaCl2 0. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸餾水 1. 0L, pH 值 7. 0 7. 6，121°C高壓蒸氣滅菌30min。
全文摘要
本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫淀粉酶的方法是將產(chǎn)生淀粉酶的微生物逐級低溫馴化，使其在低溫環(huán)境中生長良好；將低溫馴化后的淀粉酶產(chǎn)生菌在14～20℃逐級擴大培養(yǎng)，按發(fā)酵液體積的2～8％接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在14～20℃培養(yǎng)48～144h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫淀粉酶結束；發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據(jù)不同需要和使用對象不同，將粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號C12N9/24GK102093990SQ201010162660
公開日2011年6月15日 申請日期2010年4月9日 優(yōu)先權日2009年12月11日
發(fā)明者張慶芳, 王鑫, 遲乃玉 申請人:大連大學