專(zhuān)利名稱(chēng)：植物低鉀敏感型相關(guān)的蛋白AtLKR1及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物低鉀敏感型相關(guān)的蛋白AtLKRl及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鉀是植物細(xì)胞中最豐富的陽(yáng)離子之一，也是植物生長(zhǎng)所必需的三大營(yíng)養(yǎng)元素之一，在植物整個(gè)生命活動(dòng)中都起著重要作用。它不僅參與植物的許多生理、生化代謝過(guò)程， 還通過(guò)調(diào)控光合作用、呼吸作用和許多酶系統(tǒng)的功能而對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量形成等產(chǎn)生重要影響。在我國(guó)限制農(nóng)作物生產(chǎn)發(fā)展的重要因素之一就是我國(guó)大部分耕地土壤缺鉀且鉀肥資源極其匱乏。盡管提高鉀肥施用量可以大幅度地提高作物產(chǎn)量，但大量進(jìn)口鉀肥無(wú)論從經(jīng)濟(jì)上還是從長(zhǎng)遠(yuǎn)的戰(zhàn)略意義上考慮，都有一定的局限性。因此，了解和認(rèn)識(shí)植物對(duì)低鉀脅迫的反應(yīng)機(jī)制，進(jìn)而提高農(nóng)作物的耐低鉀能力，已成為如何進(jìn)一步提高農(nóng)作物產(chǎn)量的重要研究工作。擬南芥(Arabidopsis thaliana)是一種典型的雙子葉模式植物，具有個(gè)體小、生長(zhǎng)周期短、遺傳背景簡(jiǎn)單清楚、易被誘變等特點(diǎn)，其作用與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)鼠、果蠅、線蟲(chóng)等相當(dāng)，已被廣泛用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究。擬南芥共有約1. 3億個(gè)堿基對(duì)，2. 9萬(wàn)個(gè)基因。目前大部分基因的功能還不清楚，利用突變技術(shù)研究基因功能已成為一種有效方法，而且目前已得到大量的T-DNA插入突變體。通過(guò)對(duì)突變體的研究，可以較為方便地獲得一些有重要應(yīng)用價(jià)值的植物功能基因。擬南芥的大多數(shù)基因在其他植物中都能找到與之同源的序列，有關(guān)擬南芥的絕大多數(shù)發(fā)現(xiàn)也都能應(yīng)用于其他植物研究。以往的研究已經(jīng)證明，對(duì)擬南芥的研究將幫助科學(xué)家找到提高農(nóng)作物產(chǎn)量的方法。面對(duì)土壤缺鉀的問(wèn)題，克隆植物低鉀敏感基因能夠作為土壤缺鉀的一個(gè)指標(biāo)，即時(shí)反映土壤中鉀的狀態(tài)；同時(shí)可通過(guò)抑制低鉀敏感基因的表達(dá)來(lái)培育作物耐低鉀新品種，這對(duì)作物改良及新品種的培育具有重要的實(shí)踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物低鉀敏感型相關(guān)蛋白AtLKRl及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的植物低鉀敏感型相關(guān)蛋白，名稱(chēng)為AtLKRl，來(lái)源于擬南芥 (Arabidopsis thaliana) Col-Ο生態(tài)型，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；幻將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物低鉀敏感型相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。為了使1)中的AtLKRl分泌到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中或使其功能穩(wěn)定，可在由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端連接上信號(hào)肽序列；為了使1)中的 AtLKRl便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述幻中的AtLKRl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。 上述2)中的AtLKRl的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/ 或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述植物低鉀敏感性相關(guān)蛋白的編碼基因(命名為AtLKRl)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述植物低鉀敏感性相關(guān)蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中的序列1 ；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因；3)與1)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。序列表中序列1的核苷酸序列由1344個(gè)堿基組成，其編碼序列為自序列表中序列 1的第1-1344位核苷酸，編碼具有序列表中序列2所示的蛋白(AtLKRl)。上述嚴(yán)格條件可為用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實(shí)驗(yàn)中65°C下雜交并洗膜。擴(kuò)增上述AtLKRl基因全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上述植物低鉀敏感型相關(guān)蛋白的編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有AtLKRl基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pBIB、pCAMBIA3301、 pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN 或其它衍生植物表達(dá)載體。使用AtLKRl基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子、泛素 (Ubiquitin)基因啟動(dòng)子(pm3i)、Super啟動(dòng)子等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、 螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組載體具體為在pCAMBIA1300 =Super的多克隆位點(diǎn)間插入上述基因得到的重組表達(dá)載體；所述pCAMBIA1300 =Super是將序列表中序列4的自5’端第113-1112位所示的Super啟動(dòng)子插入pCAMBIA1300的HindIII和)(bal酶切位點(diǎn)間得到的載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育低鉀敏感型的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的培育低鉀敏感型的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將上述的編碼基因 (AtLKRl基因)轉(zhuǎn)入目的植物中，得到低鉀敏感性強(qiáng)于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。攜帶有本發(fā)明的AtLKRl基因的植物表達(dá)載體可通過(guò)Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。具體地，上述的編碼基因通過(guò)上述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中的。上述目的植物可以是雙子葉植物或單子葉植物，如擬南芥。本發(fā)明的另一目的在于提供培育耐低鉀脅迫的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的培育耐低鉀脅迫的轉(zhuǎn)基因植物的方法是將所述的基因(AtLKRl)在目的植物體內(nèi)敲除或抑制目的植物體內(nèi)基因(AtLKRl)的表達(dá)后，得到的耐低鉀脅迫性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。上述目的植物可以為雙子葉植物或單子葉植物，如擬南芥。實(shí)驗(yàn)證明將本發(fā)明的基因AtLKRl在目的植物中過(guò)表達(dá)后，植物就表現(xiàn)低鉀敏感性狀，可作為土壤鉀指標(biāo)的指示植物，預(yù)警土壤的低鉀；反之，將本發(fā)明所提供的AtLKRl基因敲除掉或使AtLKRl基因表達(dá)量降低，植物就表現(xiàn)耐低鉀性狀。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤偷外浶缕贩N，以及植物對(duì)低鉀耐受的研究具有重要意義，如利用本發(fā)明的基因可設(shè)計(jì)小干擾 RNA對(duì)該基因的表達(dá)進(jìn)行干擾、插入突變?cè)摶蚧蛘呷笔蛔冊(cè)摶?，從而提高植物?duì)低鉀的耐受能力。


圖1是AtLKRlT-DNA插入突變體插入示意圖及基因敲除鑒定，(A) AtLKRl基因結(jié)構(gòu)圖實(shí)心盒為外顯子，線條為內(nèi)含子，數(shù)字為核苷酸，1為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，突變體中的T-DNA插入位置已用箭頭指出；(B)Northern blots鑒定突變體lkrl_a、lkrl_b中AtLKRl的表達(dá)情況。圖2是Ikrl突變體表型檢測(cè)，是Col、lkrl-a、lkrl_b在MS培養(yǎng)基和LKLN培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10天后的表型比較。圖3是Col、lkrl-a和Ikrl_b突變體在不同鉀濃度條件下表型檢測(cè)。圖4是AtLKRl恢復(fù)突變材料表達(dá)量鑒定及低鉀條件下表型檢測(cè)，(A) Col、lkrl-a突變體、AtLKRl恢復(fù)突變材料(com-1和com_4)在MS培養(yǎng)基和LKLN培養(yǎng)基上生長(zhǎng)12天后的表型比較；(B)RT-PCR鑒定AtLKRl恢復(fù)突變材料。圖5是AtLKRl過(guò)表達(dá)材料鑒定及低鉀條件下表型檢測(cè)，㈧Col、lkrl-a突變體、 AtLKRl過(guò)表達(dá)材料(0E-5和0E-9)在MS培養(yǎng)基和LKLN培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10天后的表型比較； (B) Northern blots 鑒定 AtLKRl 過(guò)表達(dá)材料。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、與植物鉀營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的蛋白及其編碼基因的獲得提取7天擬南芥(Columbia型又稱(chēng)Col-O生態(tài)型)(購(gòu)自美國(guó)擬南芥生物資源中 (Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC)) IejW^ RNA>M Takara ^
DNA酶消化RNA中的DNA，用消化后產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以此cDNA為模板、利用分別設(shè)有)(ba I/EcoR I和Mc I/Sal I酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與鉀營(yíng)養(yǎng)相關(guān)基因的⑶S全長(zhǎng)。引物序列如下Primerl 5' -AAtctagagaattcATGAGTGGAAGCAGAAGGAAGGC-3‘ (Xba I/EcoR I)Primer2 5' -GAgagctcgtcgacTTATTGCTTTTGTTCTTCAGCGG-3‘ (Sac I/Sal I)采用Takara公司的高保真的Pyrobest DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μ L， 含 IOXPyrobest PCR 緩沖液 5. O μ L，IOmM dNTP mix 1. O μ L，引物各 1. O μ L，Pyrobest 酶 0. 5 μ L，模板3. O μ L (0. 1 μ g)，補(bǔ)充滅菌超純水至50 μ L，反應(yīng)體系在冰上進(jìn)行操作。在PE 9700儀器上進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)變性5min，95°C變性30s, 60 °C 30s, 72 °C 1. 5min,循環(huán)數(shù)30個(gè)， 72°C延伸 IOmin0將擴(kuò)增片段用0. 8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，回收擴(kuò)增片段，連接到pMDlS-Τ載體，酶切、擴(kuò)增、測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果表明，上述PCR擴(kuò)增得到的片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，為本發(fā)明的調(diào)控植物響應(yīng)低鉀脅迫CDS基因命名為AtLKRl，序列表中序列1的核苷酸序列由1344個(gè)堿基組成，其編碼序列為自序列表中序列1的第1-1344位核苷酸，編碼具有序列表中序列2所示的蛋白(AtLKRl)。將上述獲得的正確的含有AtLKRl的重組載體命名為 pMD18-AtLKRl。實(shí)施例2、與植物鉀營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的蛋白及其編碼基因的功能驗(yàn)證一、突變體的鑒定從ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)購(gòu)得到編號(hào)為 SALK 058629 (lkrl-a)和SALK_014699 (lkrl_b)的T-DNA插入突變體。其各自DNA水平的鑒定引物為SALK_058629LP 5-TGCCAAGTGAAAAATATAATGGCA-3,RP 5-CGTCACAAAATGGTCGAACAGG-3SALK_014699LP 5-TTCAAACCGAGTTTGAGGATG-3RP 5-TATCCATGAACGCTTTCGAAC-3為了進(jìn)一步確定其轉(zhuǎn)錄水平上是否敲除，我們將擬南芥野生型(Columbia型)和突變體Ikrl材料(lkrl-a和lkrl_b)布在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一周，取樣(約IOOmg)提取RNA。正常MS培養(yǎng)基組成為每升溶液含1650mg NH4NO3,1900mg KNO3, 370mgMgS04 · 7H20，170mg KH2PO4, 440mg CaCl2 ‘ 2H30,22. 3mg MnSO4 · 4H20，0. 83mg KI, 0. 025mg CuSO4 · 5H20,6. 25mg H3BO5,0. 025mg CoCl · 6H20,8. 65mg ZnSO4 · 7H20,0. 25mg Na2MoO4 · 2H20, 27. 8mg FeSO4 · 7H20, 37. 3mg Na2EDTA。擬南芥種子在 MS 上培養(yǎng)條件采用全日照光照培養(yǎng)，溫度220C，光強(qiáng)100 μ mol/(m2*s)。RNA提取方法按hvitrogen Trizol Reagent的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。用紫外分光光度計(jì)和電泳方法相結(jié)合作精確定量。然后進(jìn)行如下操作(1)配制1. 2% (w/v)瓊脂糖的甲醛變性凝膠:1. 2g瓊脂糖，IOml 10XMOPS緩沖液，75ml DEPC-H2O,加熱融化后冷至50-60°C時(shí)加入15ml甲醛；混勻后灌膠；凝膠室溫放置約1小時(shí)后放入1XM0PS電泳緩沖液中，上樣前預(yù)電泳30分鐘(60V)； (2) RNA 樣品處理10-30 μ g 總 RNA,加 2 倍體積(ν/ν)的 RNA loading buffer,混勻后65°C加熱5-10分鐘，置于冰上3-5分鐘；(3)電泳在1 XMOPS電泳緩沖液中進(jìn)行電泳分離；電壓lOV/cm，電泳至溴酚籃距邊緣約2cm處停止，約需2小時(shí)；(4)凝膠掃描及浸泡紫外燈下掃膠，然后切去多余的邊緣膠條；用250ml 10 X SSC浸泡凝膠兩次以洗去甲醛，每次20分鐘，浸泡完畢可直接轉(zhuǎn)膜。(5)轉(zhuǎn)膜在磁盤(pán)中加入10XSSC溶液250mL，架一塊玻璃板，在上方放一層寬于凝膠的濾紙，兩頭浸入液體中，濾紙與玻板間不能有氣泡，將凝膠倒扣于濾紙上排盡氣泡，用 parafilm封好膠塊四周；剪取與膠大小一致的尼龍膜，在10XSSC中潤(rùn)濕，鋪于膠上，再依次加3張濾紙、數(shù)層吸水紙，其上壓一塊玻璃板及重物；以10 X SSC為轉(zhuǎn)移液，利用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜1 2天。轉(zhuǎn)膜完畢后，在膜上標(biāo)記加樣孔位置，用2XSSC漂洗尼龍膜，取出用濾紙吸干或
晾干；將尼龍膜包在濾紙中于80°C烘1 池以使DNA與雜交膜緊密結(jié)合，之后用于分子雜 、-父。(6)探針純化及標(biāo)記PCR擴(kuò)增目的基因的特異性片斷(500bp左右)，經(jīng)純化試劑
盒純化后，定量備用。LKRl probe (495bp)引物F :5，-AAATGGAAGAAACCGCAAAGC-3，R5' -TTTCAAACCGAGTTTGAGGA-3’探針標(biāo)記按 Amersham Biosciences 的 Rediprime II Random Prime LabelIingSystem試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。在PCR反應(yīng)管中加入25ng純化的目的片段，加pH 8. 0的TE buffer至45 μ 1，95°C變性5min，迅速放于冰上冷卻；將變性后的cDNA加入到 Amersham公司的探針標(biāo)記反應(yīng)管中，到同位素室加入40 50 μ Ci32P-dCTP反復(fù)吹吸12次， 37°C水浴反應(yīng)2h以上。(7)預(yù)雜交與雜交將雜交膜放入雜交管中，帶有RNA的一面向里，加入7 15mL 預(yù)熱到65°C的Church緩沖液，65°C預(yù)雜交4 5h ；將標(biāo)記好的探針?lè)兴凶冃?5min，冰上迅速冷卻5min ；棄去管中Church，重新加入7-8mL Church，加入變性好的探針，65°C雜交16h以上。
(8)洗膜；雜交結(jié)束后，分別用 2XSSC+0. 5% (w/v) SDS，1 X SSC+0. 5% (w/v) SDS, 0.5XSSC+0.5% (w/v) SDS在65°C下洗膜(可據(jù)實(shí)際情況確定洗膜的次數(shù))，每次15min，并不斷用monitor檢測(cè)信號(hào)。(9)放射自顯影洗膜完畢后，用保鮮膜包好，放入暗盒，壓磷屏，1-2天后掃磷板。如要更換探針雜交，之前先用0. 1-0.5% (w/v) SDS煮膜15min，2 X SSC漂洗IOmin再進(jìn)行后面的雜交。經(jīng)Northern雜交分析，結(jié)果如圖1所示，AtLKRl的突變體lkrl_a和lkrl_b在轉(zhuǎn)錄水平上均被敲除。二、突變體的表型檢測(cè)1、突變體在LKLN (低鉀低銨)培養(yǎng)基上的表型觀察IL 的 LKLN 培養(yǎng)基的配置方法370mg MgSO4 · 7H20，144mg NH4H2PO4, 706mgCa(NO3)2 · 4H20 ；22. 3mg MnSO4 · 4H20，0. 83mg KI,0. 025mg CuSO4 · 5H20，6. 25mgH3B05, 0. 025mg CoCl ·6Η20，8· 65mg ZnSO4 ·7Η20，0· 25mg Na2MoO4 ·2Η20，27· 8mgFeS04 ·7Η20，37· 3mg Na2EDTA,用電阻大于16ΜΩ的雙蒸水定容至1L。pH為5. 70-5. 75，LKLN培養(yǎng)基中鉀濃度 70-100 μ mol/L，相當(dāng)于7. 077-10. Ilmg的KNO3，該鉀來(lái)源于廣東汕頭瓊脂粉中的鉀。萌發(fā)條件表型篩選將春化好的種子播于正常MS和LKLN培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)大約10 天左右，擬南芥種子培養(yǎng)條件采用全日照光照培養(yǎng)，溫度22°C，光強(qiáng)100 μ mol/(m2*s)。結(jié)果如圖2所示，由于受到低鉀脅迫野生型出冠部開(kāi)始表現(xiàn)發(fā)黃的缺鉀癥狀，而兩個(gè)突變體株系lkrl-a和lkrl_b冠部仍保能保持綠色，說(shuō)明AtLKRl參與了低鉀通路，是低鉀敏感基因。2、不同鉀濃度條件下表型檢測(cè)設(shè)置如下的培養(yǎng)基在LKLN基礎(chǔ)上添加不同濃度的ΚΝ03(分別是100uM，200uM， 2000uM)，其余成分不變。將lkrl-a、lkrl-b和野生型擬南芥種子播在上述的不同鉀濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件是日照光照培養(yǎng)，溫度22°C，光強(qiáng)100 μ mol/(m2*s)。結(jié)果如圖3所示，從左往右圖中添加的KNO3依次是10. llmg、20. 22mg、202. 2mg,隨著鉀濃度的升高，突變體和野生型之間的差異就逐漸消失了，說(shuō)明了該基因主要是在低鉀條件下起作用，所觀察到的表型是依賴(lài)于鉀濃度的。三、恢復(fù)突變體的表型檢測(cè)1、恢復(fù)突變體的構(gòu)建提取10天擬南芥(Columbia型)幼苗的總DNA，以此DNA為模板、利用一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到相關(guān)基因的ftOmoter序列。引物序列如下Primerl 5' -ATaagcttTACTAAAACGGCAAATACTAAAC-3‘ (HindIII)Primer2 5' -ACggatccTTTCTTTTTCCGATTAAGAAA-3‘ (BamHI)采用Takara公司的高保真的Pyrobest DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μ L， 含 IOXPyrobest PCR 緩沖液 5. 0 μ L，IOmM dNTP mix 1. 0 μ L，引物各 1. 0 μ L，Pyrobest 酶 0. 5 μ L，模板3. 0 μ L (0. 1 μ g)，補(bǔ)充滅菌超純水至50 μ L，反應(yīng)體系在冰上進(jìn)行操作。在PE 9700儀器上進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)變性5min，95°C變性30s, 56°C 30s, 72°C 2min，循環(huán)數(shù)30個(gè)，72°C 延伸lOmin。
對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到1749bp的核苷酸片段我們將其命名為proAtLKRl。將為proAtLKRl連接到pMD18_T載體得到的重組載體命名為pMD18_proAtLKRl。
將以上所獲得的含有AtLKRl基因的重組載體pMD18-proAtLKRl和載體 PCAMBIA1300,同時(shí)用內(nèi)切酶HindIII和BamH I進(jìn)行大體系酶切。將所切得的proAtLKRl 基因片段和線性化的PCAMBIA1300質(zhì)粒片段進(jìn)行回收，連接，并酶切驗(yàn)證，即獲得驗(yàn)證正確的含有PAtLKRl基因的重組載體并將其命名為proAtLKRl-pCAMBIA1300。將實(shí)施1獲得的含有AtLKRl基因CDS序列的重組載體pMD18_AtLKRl和上述獲得的重組載體proAtLKRl-pCAMBIA1300同時(shí)用內(nèi)切酶BamH I和Me I進(jìn)行大體系酶切。將所切得的AtLKRl基因CDS片段和線性化的proAtLKRl-pCAMBIA1300質(zhì)粒片段進(jìn)行回收，連接，并酶切驗(yàn)證，即獲得驗(yàn)證正確的含有AtLKRl基因Promoter和⑶S的重組載體并將其命名為 AtLKRl-pCAMBIA1300。將AtLKRl_pCAMBIA1300利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化侵染突變體植株lkrl_a，從而獲得AtLKRl恢復(fù)突變材料Tl代。經(jīng)過(guò)在含50 μ g/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)AtLKRl-pCAMBIA1300擬南芥陽(yáng)性植株并進(jìn)行分離比統(tǒng)計(jì)，在T3代即得到轉(zhuǎn)AtLKRl-pCAMBIA1300擬南芥單拷貝純合株系，即AtLKRl恢復(fù)突變株系 AtLKRl-pCAMBIA1300-l 和 AtLKRl_pCAMBIA1300_4，簡(jiǎn)寫(xiě)為 com-Ι 和 com_4。2、擬南芥野生型(Columbia型)、恢復(fù)突變材料種子(com_l，com_4)和lkrl_a突變體的分子檢測(cè)以及表型觀察將擬南芥野生型(Columbia型)、恢復(fù)突變材料種子(com_l，com_4)和Ikrl_a突變體分別布在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一周，取樣(約IOOmg)提取RNA。按照SUPERSCRIPT的使用說(shuō)明，合成cDNA。設(shè)計(jì)引物進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平上是否將AtLKRl的表達(dá)水平恢復(fù)到野生型狀態(tài)。所用引物是Primerl 5' -catat gATGAGTGGAAGCAGAAGGAAGGC-3，，Primet2 :5， -ctcgag TTATTGCTTTTGTTCTTCAGCGG-3，基因的擴(kuò)增條件如下將合成的單鏈cDNA稀釋10倍，作為以下PCR反應(yīng)的模板 20L 體系，內(nèi)含 10XPCR Buffer 2L,2. 5mM dNTP mix 0. 4L, 10M Primerl 禾口 Primer2 各 OUaq enzyme (15U/uL)0. 1L。在 PE9700 上擴(kuò)增95°C預(yù)變性 5min，95°C 30s, 57°C 30s, 72°C 3minl0s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，將獲得的PCR產(chǎn)物(3092bp)，用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。EF基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因，作為對(duì)照，其引物是EF-F 5’ -ATGCCCCAGGACATCGTGATTTCAT-3’EF-R 5’ -TTGGCGGCACCCTTACGTGGATCA-3’。其擴(kuò)增方法為將上述合成的單鏈cDNA稀釋10倍，作為以下PCR反應(yīng)的模板 20L 體系，內(nèi)含 10XPCR Buffer 2L, IOmM dNTP mix 0. 4L, 10M EF-F 禾口 EF-R 各 0. 4uL, Taq enzyme (15U/uL)0. luL。在 PE9700 上擴(kuò)增:95°C預(yù)變性 5min，95°C 30s，56°C 30s，72°C lmin, 共計(jì)20個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，將獲得的PCR產(chǎn)物(6^bp)，用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明如圖4B，在com-1、com-4和Col中都能檢測(cè)到AtLKRl的表達(dá)，而在lkrl-a突變體中沒(méi)有檢測(cè)到該基因的表達(dá)，且com-1、com-4中AtLKRl的表達(dá)量和Col中 AtLKRl的表達(dá)量基本相同。將經(jīng)檢測(cè)過(guò)的材料種子(Col，com-1，com-4，lkrl-a)低溫處理3天后播于正常MS 和LKLN培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)大約10天左右，如圖4A，可以看出com-1和com_4將lkrl-a突變體冠部耐低鉀的表型恢復(fù)了，和野生型沒(méi)有明顯區(qū)別，說(shuō)明lkrl-a突變體冠部較野生型耐低鉀的表型確實(shí)由于AtLKRl的缺失所以起的。四、AtLKRl 過(guò)量表達(dá)植株(Super :AtLKRl_9 和 Super :AtLKRl_5)的獲得1、中間載體 pCAMBIA1300 =Super 的構(gòu)建利用弓丨物aagcttGTGGGCCTGTGGTCTCAAGAT 和 tctagaCTAGAGTCGATTTGGT 從質(zhì)粒pMSP-1 (GenBank號(hào)為EU181145)中擴(kuò)增出核苷酸序列如序列表中序列4的自5 ’端第113-1112位所示的Super啟動(dòng)子的Super啟動(dòng)子序列；將擴(kuò)增得到的Super啟動(dòng)子用 HindIII和XbaI雙酶切，回收Super啟動(dòng)子片段，插入到質(zhì)粒pCAMBIAl300 (GenBank號(hào)為 FJ362601)的HindIII和XbaI酶切位點(diǎn)之間中，得到pCAMBIA1300 =Super質(zhì)粒。2、Super =AtLKRl 的構(gòu)建將實(shí)施例1獲得的含有AtLKRl基因的重組載體pMD18-AtLKRl和上述步驟1獲得的中間載體pCAMBIA1300 =Super,同時(shí)用內(nèi)切酶)(bal和Me I進(jìn)行大體系酶切。將所切得的AtLKRl基因片段和線性化的pCAMBIA1300 =Super質(zhì)粒片段進(jìn)行回收，連接，并酶切驗(yàn)證， 即獲得驗(yàn)證正確的含有AtLKRl基因的重組載體并將其命名為Super :AtLKRl。將Super =AtLKRl利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化侵染Columbia野生型擬南芥植株。從而獲得 AtLKRl過(guò)量表達(dá)Tl代轉(zhuǎn)Super =AtLKRl擬南芥植株。經(jīng)過(guò)在含50 μ g/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)Super =AtLKRl擬南芥陽(yáng)性植株并進(jìn)行分離比統(tǒng)計(jì)，在T3代即得到轉(zhuǎn)Super AtLKRl擬南芥單拷貝純合株系，即AtLKRl過(guò)量表達(dá)株系Super :AtLKRl_5和Super AtLKRl-9，簡(jiǎn)寫(xiě)為0E-5和0E-9表示。將野生型擬南芥(Columbia型)、AtLKRl過(guò)量表達(dá)植株(Super =AtLKRl擬南芥單拷貝純合株系，名稱(chēng)為Super :AtLKRl-5和Super :AtLKRl_9，即0E_5和0E_9)種子在MS培養(yǎng)基萌發(fā)生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件采用全日照光照培養(yǎng)，溫度22°C，光強(qiáng)100 μ mol/(m2*s)。取生長(zhǎng)7 天的上述材料約IOOmg提取RNA。RNA提取方法及檢測(cè)、Northern雜交方法和所用目的基因探針引物同實(shí)施二。經(jīng)Northern雜交分析，0E-5和0E-9中基因的表達(dá)水平明顯高于野生型，如圖5B 所示。五、過(guò)表達(dá)株系、突變體、野生型、在低鉀條件下的表型觀察將野生型(Columbia型)、lkrl_a突變體種子和經(jīng)過(guò)檢測(cè)的AtLKRl過(guò)表達(dá)植株 0E-5和0E-9的種子低溫處理3天后播于正常MS和LKLN培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)大約10天左右觀察性狀。表型分析結(jié)果表明如圖5A，過(guò)表達(dá)材料冠部較野生型敏感，表現(xiàn)為冠部發(fā)白，而突變體冠部則表現(xiàn)出較野生型耐低鉀的表型。
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下1)或幻的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物低鉀敏感型相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3) 中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中的序列1；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因；3)與1)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體的構(gòu)建方法是將權(quán)利要求2-4中任一所述的基因插入pCAMBIA1300 =Super載體的)(bal和KpnI酶切位點(diǎn)之間構(gòu)成的重組表達(dá)載體；所述PCAMBIA1300 =Super載體的是將核苷酸序列如序列表中序列4的自5’端第 113-1112位所示的Super啟動(dòng)子插入pCAMBIA1300質(zhì)粒的HindIII和)(bal酶切位點(diǎn)之間構(gòu)成的載體。
6.一種培育低鉀敏感型的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因轉(zhuǎn)入目的植物中，得到低鉀敏感性強(qiáng)于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述的編碼基因是通過(guò)權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述目的植物優(yōu)選為擬南芥。
9.一種培育耐低鉀脅迫的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的基因在目的植物體內(nèi)敲除或抑制目的植物體內(nèi)權(quán)利要求2或3所述的基因的表達(dá)后，得到的耐低鉀脅迫性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述植物為雙子葉植物或單子葉植物， 優(yōu)選為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種植物低鉀敏感型相關(guān)蛋白AtLKR1及其編碼基因與應(yīng)用。所述蛋白是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物低鉀敏感型相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。將本發(fā)明的基因AtLKR1在目的植物中過(guò)表達(dá)后，植物就表現(xiàn)低鉀敏感性狀，可作為土壤鉀指標(biāo)的指示植物，預(yù)警土壤的低鉀；反之，將本發(fā)明所提供的AtLKR1基因敲除掉或使AtLKR1基因表達(dá)量降低，植物就表現(xiàn)耐低鉀性狀。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤偷外浶缕贩N，以及植物對(duì)低鉀耐受的研究具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102234325SQ20101016441
公開(kāi)日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2010年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月29日
發(fā)明者任慧敏, 劉麗麗, 武維華 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)