專利名稱：一種用于治療乙肝的重組質粒疫苗及其組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種治療乙肝疾病的重組質粒DNA疫苗及其組合物，屬于生物醫(yī)學領域。
背景技術：
乙型肝炎嚴重危害人類健康，目前尚無特效治療手段，乙肝慢性化的主要原因是乙肝病毒(HBV)感染后機體缺乏持久的特異性細胞免疫及體液免疫。HBV外殼蛋白是有大蛋白LS(S1S2S抗原，由前Sl-前S2_S基因編碼)、中蛋白 MS (S2S抗原，由前S2-S基因編碼)、小蛋白S (S抗原，由S基因編碼)三種分子構成，其中， 前S2抗原分子量小，抗原性強，涉及乙肝病毒對宿主細胞的吸附，因而含前S2抗原的疫苗對于接種者的保護作用應更為有效。HBdg是由乙型肝炎病毒基因C區(qū)基因編碼，從第2個ATG起始翻譯，含183-185個氨基酸多肽，分子量約為21KD，其C端富含精氨酸和多種蛋白酶作用位點，有結合RNA的能力，并與其組裝成乙肝核心顆粒密切相關。HBdg顆粒由多個核心蛋白亞基構成，呈正二十面體對稱的顆粒樣結構，單個核心蛋白亞基(包括183-185個氨基酸多肽鏈)先形成同型二聚體(Homodimer)，二聚體再進一步聚集而形成HBcAg顆粒。重組質粒DNA疫苗是把外源基因克隆到真核表達載體上，然后將重組質粒直接注射到動物體內，使外源基因在活體內表達，產(chǎn)生抗原激活機體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應。 與傳統(tǒng)的疫苗相比，重組質粒DNA疫苗不僅能有效誘導體液免疫，還能誘導細胞免疫，可兼做預防和治療性疫苗，DNA質粒疫苗已經(jīng)在許多疾病的治療和預防方面顯示出廣泛的應用前景。Mancini(Mancini M,Hadchouel M,Davis HL,et al. DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigen chronic carrier state. ProNatl Acad Sci USA. 1996,93 :12496-12501)等應用編碼 preS2/S HBV 包膜蛋白的重組質粒免疫HBV轉基因小鼠，經(jīng)過一次肌肉注射就能清除轉基因小鼠循環(huán)中的HBsAg， 并且能夠長期抑制肝細胞中的病毒復制，證實了 DNA疫苗在治療慢性乙肝攜帶者的潛在優(yōu)勢° Mancini-Bourgine M 等(Mancini-Bourgine M, Fontaine H, Scott-Algara D, et al. Induction or expansion of T-cell responsese by a hepatitis B DanAvaccine administered to chronic HBV carriers. Hepatology. 2004,40 :874-882) jS ffi IS 石馬 preS2/S HBV包膜蛋白的重組質粒免疫10例慢性乙肝攜帶者，這10例攜帶者未接受過任何的抗病毒治療。結果發(fā)現(xiàn)，疫苗能夠很好地耐受，有2例攜帶者的PBMC發(fā)生抗原特異性的 T淋巴細胞增殖反應，并且HBV特異性分泌IFN- γ的T細胞數(shù)目在免疫后有較大幅度的提高，有5例攜帶者的血清HBV DNA水平下降，但是這種下降僅僅是暫時性的。此次研究也證實了 HBV DNA疫苗的安全性以及能夠在部分慢性乙肝攜帶者體內誘導出特異的T細胞免疫應答。HBcAg作為優(yōu)勢抗原，在乙肝疫苗的研究中也得到了廣泛應用，Veremeiko TA等(Veremeiko TA,Lebedev LR,Chikaev NA,et al. Humoral immune response ofBalb/c mice immunized with chimer HBcAg proteins carrying the epitopes of surfacehepatic B virus protein. Vopr virusol，2007，52 :40-45)把HBV外殼蛋白表位插入到 HBcAg，成功構建了 HBcAg-HBsAg融合蛋白，并以此融合蛋白免疫Balb/cxiaoshi，產(chǎn)生了高滴度的針對插入表位HBsiVg和載體蛋白HBdg抗體。張煒等(張煒，懂生福，孫淑惠，等.乙肝病毒核心抗原DNA疫苗誘導小鼠抗原特異性CD8+T細胞動態(tài)變化和動態(tài)分布.中國免疫學雜志.2004， 20 (6) =379-383)研究了重組HBcAg真核表達質粒pHBcl44對C57BL/6小鼠的免疫作用，結果發(fā)現(xiàn)，pHBcl44面以后抗原特異性CD8+T細胞逐漸增多，在初次免疫的第14天出現(xiàn)第一個免疫應答高峰，此后抗原特異性CD8+T細胞數(shù)量組建下降進入免疫記憶期并在1年內維持在穩(wěn)定水平。胸腺肽、GSF、IL-2、IL_4、IL-12或IFN-γ等為常作為免疫佐劑或增強劑，其中將胸腺肽、63 、11^-2或0^-^作為佐劑與HBV疫苗聯(lián)合使用已有研究。IL-12具有多種生物活性，是最強的N K細胞激活因子，可促進CD4+ThO細胞分化為Thl細胞，可協(xié)調亞適劑量 IL-2誘導LAK(activated killer cells)細胞活性。作為重要的免疫調節(jié)分子，IL-12是迄今所知誘導Thl型免疫應答的最主要的細胞因子，原體如細菌、寄生蟲、真菌和病毒感染所致疾病及腫瘤的DNA疫苗的研究。中國專利CN1316518A公開了一種重組真核表達質粒pS2S，質粒中含有細胞擊落刺激因子，并將重組疫苗質粒與含IL-2和IFN- γ的重做佐劑質粒聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)重組佐劑質?？梢蕴岣咧亟M疫苗質粒的免疫和治療作用。目前該項目已進入臨床研究階段。將乙肝表面抗原與乙肝核心抗原聯(lián)合構建重組疫苗質粒時，現(xiàn)階段通常是利用 HBcAg能裝配成直徑為27nm的顆粒狀結構的特點，直接以HBcAg作為表達載體將乙肝病毒表面抗原融合到HBcAg，構建得到融合蛋白疫苗，或者擴增HBV的S和C基因并拼接成SC融合片段，將融合片段插入真核表達載體中構建融合表達HBsAg/HBcAg的重組DNA質粒。但這種方式構建得到的重組DNA質粒，在獲得其中一種抗體滴度時，另一種抗原所產(chǎn)生的抗體滴度很弱，下降明顯。雖然DNA疫苗的初步臨床試驗結果令人滿意，但其免疫效果還未達到理想水平， 因此如何增強免疫效果已成為DNA疫苗研究的關鍵，尤其是在如何保證如何使DNA疫苗可同時獲得較強的HBsAg和HBcAg的免疫效果方面。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于治療乙型肝炎的經(jīng)優(yōu)化的重組質粒DNA疫苗， 所述的重組質粒DNA疫苗同時攜帶乙肝表面抗原蛋白編碼基因和乙肝核心抗原蛋白編碼基因。本發(fā)明中，所述的重組質粒DNA疫苗中的乙肝表面抗原蛋白編碼基因和乙肝核心抗原蛋白編碼基因不是通過直接連接而形成融合蛋白編碼基因的形式，而是通過優(yōu)化質粒，在重組質粒上設計兩個目的蛋白表達盒，兩編碼基因彼此隔開。本發(fā)明中，HBV便面抗原蛋白編碼基因可以是S1S2S蛋白編碼基因、S2S蛋白白編碼基因或S蛋白編碼基因，優(yōu)選乙肝病毒包膜中蛋白S2S蛋白編碼基因就，所述的乙肝核心抗原蛋白編碼基因為編碼乙肝病毒核心Core蛋白的編碼基因。
本發(fā)明中，所述的乙肝病毒S2S蛋白編碼基因，其核苷酸序列與kq ID No. 5具有至少70%的同源性，優(yōu)選至少80%的同源性，更優(yōu)選為至少90%的同源性，最優(yōu)選為與天然的乙肝病毒中蛋白S2S編碼基因核苷酸序列完全相同。本發(fā)明中，所述的乙肝病毒Core蛋白編碼基因，其核苷酸序列與kq ID No. 11具有至少70%的同源性，優(yōu)選至少80%的同源性，更優(yōu)選為至少90%的同源性，最優(yōu)選為與天然的乙肝病毒核心Core蛋白編碼基因核苷酸序列完全相同。本發(fā)明中，構建的重組質粒DNA疫苗還包括大腸桿菌復制起始點ColEl、卡那抗性基因序列Kan及兩個目的蛋白表達盒；其中處于上游位置的表達盒為優(yōu)化目的蛋白表達盒，其包括來源于SV40的增強子元件Enhancer、轉錄調控元件內含子^itronl和外顯子 Exonl、來源于HBV的轉錄后調節(jié)元件HPRE。本發(fā)明中，構建的重組質粒DNA疫苗可以是優(yōu)化表達HBV包膜中蛋白S2S的同時表達乙肝核心Core蛋白(C)的重組疫苗質粒PS2S-C，所述的重組疫苗質粒pS2S-C具有如 Seq ID No. 1所示的核苷酸序列；或者是優(yōu)化表達乙肝核心Core蛋白的同時表達乙肝包膜中蛋白的S2S的重組疫苗質粒pC-S2S，所述的重組疫苗質粒pC-S2S具有如kq ID No. 2所示的核苷酸序列。本發(fā)明中，核心Core蛋白可以是天然的全長核心Core蛋白，也可以是截短后的核心Core蛋白，其截短后的Core蛋白含N末端的IMaa，優(yōu)選為全長的核心Core蛋白。本發(fā)明的再一目的在于提供一種含有本發(fā)明所述的重組質粒DNA疫苗的組合物， 所述的組合物除含有本發(fā)明所述重組質粒DNA疫苗外，還可以含有一些其它治療或者具有輔助治療性的藥物，如核苷類治療乙肝的藥物，細胞因子，提高免疫作用的中藥成分等。本發(fā)明的再一目的在于提供通過基因重組技術而構建的一種用于治療乙肝的雙質粒DNA疫苗組合物，本發(fā)明所述的雙質粒DNA疫苗組合物，包括HBV DNA重組疫苗質粒和白介素-12重組佐劑質粒pIL12。本發(fā)明中，提供的雙質粒DNA疫苗組合物，其中所構建的重組疫苗質粒為攜帶HBV 中蛋白S2S編碼基因和核心Core (C)蛋白編碼基因的重組疫苗質粒，在所述的重組疫苗質粒中，抗原的表達先后順序可以是先表達HBV中蛋白S2S后表達HBV核心Core蛋白，即構建的重組質粒為pS2S_C(質粒結構示意圖見圖1)，具有如kq ID No. 1所示的核苷酸序列；也可以是先表達HBV核心Core蛋白后表達HBV中蛋白S2S，即構建的重組質粒為pC_S2S (質粒結構示意圖見圖2)，具有如kq ID No. 2所示的核苷酸序列。本發(fā)明中，所述的重組白介素12佐劑質粒(pIL12)，其中白介素12可以是來源于鼠的白介素12，所述的鼠白介素12可以是大鼠、小鼠或其它鼠的白介素12，所構建重組佐劑質粒pmIL12(具有如kq ID No. 4所示的核苷酸序列)；也可以是來源于人的白介素12， 構建重組佐劑質粒phIL12 (具有如kq ID No. 3所示的核苷酸序列)。本發(fā)明中，所述重組白介素12佐劑質粒還還包括大腸桿菌復制起始點ColEl、卡那抗性基因序列Kan及兩個目的蛋白表達盒，以及來源于SV40的增強子元件Enhancer、免疫調節(jié)序列CpG等元件。本發(fā)明中，所述的重組疫苗質粒和重組佐劑質粒還可攜帶有多克隆位點區(qū)MCS，所述的多克隆位點區(qū)包括SwaI、KpnI、Sail、EcoRV、BgIII等酶切位點。本發(fā)明的目的還在于提供一種雙質粒DNA疫苗組合物的構建方法。
1、重組質粒 HBV DNA 疫苗質粒 pS2S_C (pRec2. 0_preS2S_C)(1)先構建重組質粒載體骨架pOE-EKS 以pDRVISVl. 0為模板，以Primerl與Primer2為引物，其中引物2為5，末端磷酸化的引物，擴增獲得大小為748bp的復制子區(qū)域(Ori)，同時引入Ec0RI、KpnI及SwaI酶切位點；Primerl :5’ -GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAG C-3，Primer2 :5’ -CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAG G-3，以pDRVISVl. 0為模板，以Primerf與Primer4為引物，其中引物3為5，末端磷酸化的引物，擴增獲得大小為1056bp的卡那抗性標記基因(Kan)，同時引入EcoRI酶切位點；Primer3 :5’ -tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCT C-3，Primer4 :5，-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTC T-3，將上述兩個片段分別以EcoRI進行單酶切，連接后構建重組克隆pOK-EKS ；(2)構建重組質粒 DNA 疫苗 pRec2. 0_PreS2. S將合成基因ft~eS2S通過Xhol+Xbal雙酶切與&ilI+XbaI雙酶切的載體pHPRE連接，構建獲得重組克隆pHPRE-PreS2S ；所用的合成基因ft~eS2S委托北京雷默生物科技有限公司合成，其核苷酸序列為具有kq ID No. 5所示的核苷酸序列以pDRVISVl. 0為模板，以I^rimerS與I^rimere為引物，擴增獲得大小為271bp的 BGHpolyA區(qū)，同時在上游引入BamHI酶切位點，下游引入Bglll-EcoRV-SalI-KpnI酶切位點；通過BamHI+Kpnl雙酶切后克隆入Bglll+Kpnl雙酶切的pHPRE_PreS2S載體中，獲得重組質粒 pHPRE，-PreS2S ；Primer5 :5， _CGGGATCCgctgtgccttctagttgccag_3，Primer6 :5’ -GGGGTACCGTCGACAACGTTGATATCAACGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATC C-3，通過EcoRI+Kpnl將重組質粒pHPRE，_PreS2S的ft~eS2S表達盒克隆入載體 pOK-EKS 中，構建重組質粒 pRec2. 0_PreS2S。(3)構建重組質粒pRec2. O-C將合成基因CPreSl通過Xhol+Xbal雙酶切與&ilI+XbaI雙酶切的載體pHPRE連接，構建獲得重組克隆pHPRE-CPreSl ；合成基因CPreSl的核苷酸序列為Seq ID No. 6所示的核苷酸序列。以pDRVISVl. O為模板，以I^rimerS與I^rimere為引物，擴增獲得大小為271bp的 BGHpolyA區(qū)，同時在上游引入BamHI酶切位點，下游引入Bglll-EcoRV-SalI-KpnI酶切位點；通過BamHI+Kpnl雙酶切后克隆入Bglll+Kpnl雙酶切的pHPRE-CPreSl載體中，獲得重組質粒 pHPRE，-CPreSl ；通過EcoRI+Kpnl將重組質粒pHPRE，-CPreSl的CPreSl表達盒克隆入載體pOK-EKS 中，構建重組質粒 pRec2. O-CPreSl ；以pRec2. O-CPreSl為模板，以Primer7與Primer8為引物，擴增獲得大小為5%bp 的Core基因(C)，并通過I^stl+Xbal雙酶切后克隆入I^stl+Xbal雙酶切的pRec2. O-CPreSl 載體中，獲得重組質粒pRec2. O-C0Primer7 :5，-gtcttttctgcagtcaccgtcgTCGAG-3，Primer8 :5’ -GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3，
(4)構建重組質粒 pRec2. 0_PreS2S_C (pS2S_C)以pRec2. O-C為模板，以Primer9與Primer8為引物，擴增獲得大小為579bp的 Core基因(C)，通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3. 1進行連接，構建獲得pcDNA3. I-C ；Primer9 5’ -CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGATATTG-3’Primer8 :5’ -GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3，通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3. 1-C上切出C表達盒，克隆入 Bglll+EcoRV 雙酶切的 pRec2. 0_PreS2S 中，構建獲得重組質粒 pRec2. 0_PreS2S_C。2 重組 HBV DNA 疫苗質粒 pC_S2S (即 pRec2· 0-C-preS2S)以上述步驟O)中構建得到的pRec2. 0_PreS2S為模板，以Primerll與Primerl2 為引物，擴增獲得大小為873bp的ft~eS2S基因，通過HindiΙΙ+XbaI雙酶切與HindiII+XbaI 雙酶切的載體pcDNA3. 1進行連接，構建獲得pcDNA3. l_PreS2S ；Primerll :5’ -CCCAAGCTTGCCGCCACCATGCAGTGGAACTC-3，Primer12 :5， -GCTCTAGAATCAGATGTAAACCCAC-3，通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3. l_PreS2S上切出I^reSZS表達盒，克隆入 Bglll+EcoRV 雙酶切的 pRec2. O-C 中，構建獲得重組質粒 pRec2. 0_C_PreS2S (pC_S2S)。3重組佐劑質粒pmIL12的構建(1)將合成基因mP35 (具有kq ID No. 7所示的核苷酸序列)通過Hindlll+Xbal 雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3. 1進行連接，構建獲得重組質粒 pcDNA3. l-mP35 ；(2)通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3. l_mP35中切出mP;35基因表達盒，克隆入Bglll+EcoRV雙酶切的質粒pRec2. 0_PreS2S中，獲得重組質粒 pRec2. 0-PreS2S-mP35 ；(3)將合成基因mP40 (具有kq ID No. 8所示的核苷酸序列)通過Hindlll+Xbal 雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3. 1進行連接，構建獲得重組質粒 pcDNA3. l-mP40 ；(4)通過MlI+PvuII雙酶切出mP40基因表達盒，克隆入Sall+Swal雙酶切的質粒 pRec2. 0-PreS2S-mP35 中，獲得重組質粒 pRec2. 0-PreS2S_mIL12 ；(5)通過NdeI酶切質粒pRec2. 0-PreS2S_mIL12，共切出3個條帶 (1870bp+3448bp+3855bp)，回收1870bp片段及3855bp片段，將回收的3855bp片段進行CIP 去磷酸化后，與1870bp片段進行連接，篩選正向克隆的重組質粒pmIL12。4重組佐劑質粒phIL12的構建(1)將合成基因hP35 (具有kq ID No. 9所示的核苷酸序列)通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3. 1進行連接，構建獲得重組質粒 pcDNA3. l-hP35 ；(2)通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3. l-hP35中切出hP35基因表達盒，克隆入Bglll+EcoRV雙酶切的質粒pRec2. 0_PreS2S中，獲得重組質粒 pRec2. 0-PreS2S-hP35 ；(3)將合成基因hP40(具有kq ID No. 10所示的核苷酸序列)通過Hindlll+Xbal 雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3. 1進行連接，構建獲得重組質粒 pcDNA3. l-hP40 ；(4)通過&ilI+PvuII雙酶切出hP40基因表達盒，克隆入Mll+Swal雙酶切的質粒 pRec2. 0-PreS2S-hP35 中，獲得重組質粒 pRec2. 0_PreS2S_hIL12 ；(5)通過NdeI酶切質粒pRec2. 0_PreS2S_hIL12，共切出3個條帶 (1882bp+3446bp+3812bp)，回收1882bp片段及3812bp片段，將回收的3812bp片段進行CIP 去磷酸化后，與1882bp片段進行連接，篩選正向克隆的重組質粒phIL12。本發(fā)明的再一目的在于提供一種疫苗的制備方法，各質粒(pS2S-C、pC-S2S和 PIL12)的制備方法相同，但分開生產(chǎn)，將重組質粒pS2S-C、pC-S2S、pmIL12、phIL12分別轉化大腸桿菌DH5 α，篩選陽性克隆，含重組質粒的陽性單克隆經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、擴增，再經(jīng)裂解和柱純化后得到提純的重組質粒，具體可以為發(fā)酵在_70°C中取出含有質粒的大腸桿菌DH5 α，用接種環(huán)沾取少量菌液，于平皿上挑取單克隆置于5-10ml含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng) 10-12h，以1 1000的比例將培養(yǎng)液加入2. 5L含相應抗生素的LB培養(yǎng)基，37°C、200rpm培養(yǎng)12-1 后，將培養(yǎng)物進行離心處理，收集菌體，即得含質粒的發(fā)酵培養(yǎng)物。裂解將菌體加Buffer液，輕柔的顛倒離心管數(shù)次，室溫放置，使其裂解充分。柱層析裂解后的菌體通過DNA制備柱，洗脫分離，收集質粒并用有機溶劑沉淀， 用生理鹽水溶解質粒DNA即得。為了能夠更加便捷高效地表達本發(fā)明所述的重組疫苗質粒和重組佐劑質粒，本發(fā)明還構建了含有本發(fā)明所述重組質粒的大腸桿菌，應用本發(fā)明所述的重組大腸桿菌，可以更為快捷地制備本發(fā)明中的各個質粒。大腸桿菌菌株DH5 α /pmIL12,含有重組佐劑質粒pmIL12，通過事先構建重組質粒pmIL12，轉化大腸桿菌DH5 α菌株后在含卡那抗性的LB平皿中篩選獲得，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期2010年04月13日，建議的分類名為大腸埃希氏菌 Escherichia coli，保藏編號為CGMCC No. 3726。大腸桿菌菌株DH5 α /phIL12,含有重組佐劑質粒phIL12，通過事先構建重組質粒phIL12，轉化大腸桿菌DH5 α菌株后在含卡那抗性的LB平皿中篩選獲得，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期2010年04月13日，建議的分類名為大腸埃希氏菌 Escherichia coli，保藏編號為CGMCC No. 3727。大腸桿菌菌株DH5 α /pRec2. 0_S2S_C，含有重組佐劑質粒pS2S_C，通過事先構建重組質粒PS2S-C，轉化大腸桿菌DH5 α菌株后在含卡那抗性的LB平皿中篩選獲得，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期2010年04月13日，建議的分類名為大腸埃希氏菌 Escherichia coli，保藏編號為CGMCC No. 3728。大腸桿菌菌株DH5 α /pRec2. 0_C_S2S，含有重組佐劑質粒pC_S2S，通過事先構建重組質粒PC-S2S，轉化大腸桿菌DH5 α菌株后在含卡那抗性的LB平皿中篩選獲得，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期2010年04月13日，建議的分類名為大腸埃希氏菌 Escherichia coli，保藏編號為CGMCC No. 3729。本發(fā)明的再一目的還在于提供本發(fā)明所述的重組質粒DNA疫苗和雙質粒DNA疫苗在制備具有預防和治療乙型病毒性肝炎藥物中的應用。本發(fā)明的還一目的在于提供一種本發(fā)明所述重組質粒DNA疫苗或雙質粒疫苗在預防和治療乙型肝炎時的免疫給藥方式，其給藥方式可以是皮下注射、肌肉注射或借助電穿孔方式，優(yōu)選給藥方式為借助電穿孔方式給藥進行免疫或治療。本發(fā)明用于治療乙肝的雙質粒DNA疫苗的體外鑒定采用體外轉染^3-T和C0S-7 細胞，檢測到目的蛋白(HBsAg、HBcAg、IL12)的高水平表達。雙質粒DNA疫苗能誘導機體產(chǎn)生高水平的乙肝表面抗體(HBsAb)及核心抗體(HBcAb)水平和特異性的細胞免疫反應。本發(fā)明更值得注意的是，借助于電穿孔技術進行面以后，乙肝雙質粒DNA疫苗能夠誘導出顯著提高的免疫效果。


圖1為重組疫苗質粒pRec2. 0-S2S-C (pS2S_C)的結構示意圖。圖2為重組疫苗質粒pRec2. 0-C-S2S (pC_S2S)的結構示意圖。圖3為重組佐劑質粒phIL12的結構示意圖。圖4為重組佐劑質粒pmIL12的結構示意圖。圖5為重組疫苗質粒PS2S-C及pC-S2S的酶切電泳圖譜，其中泳道1為重組疫苗質粒pS2S-C經(jīng)^CbaI單切后的圖譜，可切出兩條帶，分別為 2300bp 和 4570bp ；泳道2為重組疫苗質粒PS2S-C經(jīng)EcoRI單切后，切出大小約為6870bp的普帶；泳道3為未進行酶切的重組疫苗質粒PS2S-C ；泳道4為重組疫苗質粒PS2S-C經(jīng)Ndel+Sall雙酶切后，切出大小約為1300bp、 2100bp、3400bp的三條普帶；泳道5為重組疫苗質粒pS2S-C經(jīng)PvuII+Xbal雙酶切后，切出大小約為lOOObp、 2200bp、3600bp的三條普帶；泳道 6 為 marker DL2000 ；泳道7 為 marker DL15000 ；泳道8為重組疫苗質粒pC-S2S經(jīng))(baI單切后的圖譜，切出的兩條帶分別為 2550bp 和 4320bp ；泳道9為重組質粒pC-S2S經(jīng)^CbaI單切后的圖譜，切出大小約為6870的普帶；泳道10為未進行酶切的重組疫苗質粒PS2S-C ；
泳道11為重組疫苗質粒PC-S2S經(jīng)Ndel+Sall雙酶切后，切出大小約為1500bp、 2300bp、3100bp的三條普帶；泳道12為重組疫苗質粒PC-S2S經(jīng)PvuII+Xbal雙酶切后，切出大小約為250bp、 500bp、2500bp、3600bp 的四條普帶；圖6為重組佐劑質粒pmIL12酶切電泳圖譜，其中泳道1為經(jīng)I^stI單酶切后，切出的三條普帶，大小為^0bp、2100bp、3300bp，其中 280bp大小普帶模糊，其余兩條完全正確；泳道2為經(jīng)NdeI單酶切后切出的2條普帶，大小分別為1900bp、3800bp，兩條帶完
全正確；泳道3為經(jīng)EcoRI+Bglll雙酶切后切出的兩條普帶，大小分別為1700bp、4000bp，
兩條帶完全正確；泳道4、5 分別為 DL15000、DL2000marker ；泳道6為經(jīng)EcoRI單切后的線性片段，大小約為5700bp ；泳道7為未進行酶切的重組佐劑質粒pmIL12。圖7為重組佐劑質粒phIL12酶切電泳圖譜，其中泳道1、2 分別為 DL2000、DL15000marker。泳道3為經(jīng)HindIII單酶切后，切出的三條普帶，大小分別為1496bp、1882bp、 2343bp，現(xiàn)實完全正確；泳道4為經(jīng)EcoRI+Bgl11雙酶切后，切出的兩條普帶，大小分別為1752、3942bp，兩條帶現(xiàn)實完全正確；泳道5為經(jīng)EcoRI單酶切后的線性片段，大小約為5700bp ；泳道6為未進行酶切的重組佐劑質粒phIL12。
具體實施例本發(fā)明通過下述實施例進一步闡明，但任何實施例或其組合不應當理解為對本發(fā)明的范圍或實施方式的限制。本發(fā)明的范圍由所附權利要求書限定，結合本說明書和本領域一般常識，本領域普通技術人員可以清楚地明白權利要求書所限定的范圍。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領域技術人員可以對本發(fā)明的技術方案進行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內。所用試劑及材料大腸桿菌DH5 α購自hvitrogen公司；攜帶轉錄后調節(jié)元件 (HPRE)的DNA疫苗質粒phH、質粒pDRVISVl. 0由中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心病毒免疫室惠贈(該質粒的構建過程及詳細資料已在中國專利CN1560259A中完全公開)；真核表達質粒pcDNA3. 1購自hvitrogen公司；真核表達載體pHPRE由中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心病毒免疫室構建；攜帶內部核糖體進入位點 (IRES)的雙順反子表達質粒pIRESneo購自Clontech公司J93T、C0S_7細胞購自于ATCC ； 小鼠脾細胞以1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(10%胎牛血清，^witrogen公司)；各種限制性內切酶、Pfu聚合酶、DNA連接試劑Sol I均購自NEB公司；質粒抽提純化試劑盒購自TIANGEN公司；乙肝表面抗原及表面抗體定量ELISA檢測試劑盒(化學發(fā)光法)購自北京源德生物科技有限公司。小鼠IFN-Y的ELISP0T檢測試劑盒購自BD公司?？乖碳る挠杀本┵惏偈⑸锛夹g有限公司合成?；蚝铣杉盎驕y序工作委托北京英峻生物科技有限公司進行。實施例1重組質粒pRec2. 0-preS2S_C (簡寫為pS2S_C)的構建(1)先構建重組質粒載體骨架pOE-EKS，其核苷酸序列為kqNo. 1所標示的核苷酸序列以pDRVISVl. 0為模板，以Primerl與Primer2為引物，其中引物2為5，末端磷酸化的引物，擴增獲得大小為748bp的復制子區(qū)域(Ori)，同時引入Ec0RI、KpnI及SwaI酶切位點；Primerl :5’ -GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAG C-3，Primer2 :5’ -CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAG G-3，以pDRVISVl. 0為模板，以Primerf與Primer4為引物，其中引物3為5，末端磷酸化的引物，擴增獲得大小為1056bp的卡那抗性標記基因(Kan)，同時引入EcoRI酶切位點；Primer3 :5， -tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCT C-3，Primer4 5’ -GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTC T-3，將上述兩個片段分別以EcoRI進行單酶切，連接后構建重組克隆pOK-EKS ；(2)構建重組質粒 DNA 疫苗 pRec2. 0_PreS2. S將合成基因ft~eS2S通過Xhol+Xbal雙酶切與&ilI+XbaI雙酶切的載體pHPRE連接，構建獲得重組克隆pHPRE-PreS2S ；以pDRVISVl. O為模板，以Primer5與Primer6為引物，擴增獲得大小為271bp的 BGHpolyA區(qū)，同時在上游引入BamHI酶切位點，下游引入Bglll-EcoRV-SalI-KpnI酶切位點；通過BamHI+Kpnl雙酶切后克隆入Bglll+Kpnl雙酶切的pHPRE_PreS2S載體中，獲得重組質粒 pHPRE，-PreS2S ；Primer5 :5，_CGGGATCCgctgtgccttctagttgccag_3，Primer6 :5’ -GGGGTACCGTCGACAACGTTGATATCAACGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATC C-3，通過EcoRI+Kpnl將重組質粒pHPRE，_PreS2S的ft~eS2S表達盒克隆入載體 POK-EKS中，構建重組質粒pRec2. 0_PreS2S，其核苷酸序列為kq No. 2所標示的核苷酸序列。(3)構建重組質粒pRec2. O-C將合成基因CPreSl通過Xhol+Xbal雙酶切與&ilI+XbaI雙酶切的載體pHPRE連接，構建獲得重組克隆pHPRE-CPreSl ；以pDRVISVl. O為模板，以Primer5與Primer6為引物，擴增獲得大小為271bp的 BGHpolyA區(qū)，同時在上游引入BamHI酶切位點，下游引入Bglll-EcoRV-SalI-KpnI酶切位點；通過BamHI+Kpnl雙酶切后克隆入Bglll+Kpnl雙酶切的pHPRE-CPreSl載體中，獲得重組質粒 pHPRE，-CPreSl ；通過EcoRI+Kpnl將重組質粒pHPRE，-CPreSl的CPreSl表達盒克隆入載體
14pOK-EKS 中，構建重組質粒 pRec2. O-CPreSl ；以pRec2. O-CPreSl為模板，以Primer7與Primer8為引物，擴增獲得大小為596bp 的Core基因(C)，并通過I^stl+Xbal雙酶切后克隆入I^stl+Xbal雙酶切的pRec2. O-CPreSl 載體中，獲得重組質粒pRec2. O-C0Primer7 :5， -gtcttttctgcagtcaccgtcgTCGAG-3，Primer8 :5’ -GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3，(4)構建重組質粒 pRec2. 0-PreS2S_C以pRec2. O-C為模板，以Primer9與Primer8為引物，擴增獲得大小為579bp的 Core基因(C)，通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3. 1進行連接，構建獲得pcDNA3. I-C ；Primer9 :5， -CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGATATTG-3，Primer8 :5’ -GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3，通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3. I-C上切出Core表達盒，克隆入 Bglll+EcoRV 雙酶切的 pRec2. 0-preS2S 中，構建獲得重組質粒 pRec2. 0_PreS2S_C。實施例2 重組質粒 pRec2. 0_C-preS2S (pC_S2S)的構建以實施例1中構建得到的pRec2. 0_PreS2S為模板，以Primerll與Primerl2為引物，擴增獲得大小為87!3bp的ft~eS2S基因，通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3. 1進行連接，構建獲得pcDNA3. l_PreS2S ；Primerll :5，-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGCAGTGGAACTC-3，Primer 12 :5， -GCTCTAGAATCAGATGTAAACCCAC-3，通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3. l_PreS2S上切出I^reSZS表達盒，克隆入 Bglll+EcoRV 雙酶切的 pRec2. O-C 中，構建獲得重組質粒 pRec2. 0_C_PreS2S (pC_S2S)。實施例3重組佐劑質粒pmIL12的構建(1)將合成基因mP;35通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體 pcDNA3. 1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3. l_mP35 ；(2)通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3. l_mP35中切出mP;35基因表達盒，克隆入Bglll+EcoRV雙酶切的質粒pRec2. 0_PreS2S中，獲得重組質粒 pRec2. 0-PreS2S-mP35 ；(3)將合成基因mP40通過HindIII+Xbal雙酶切與HindIII+Xbal雙酶切的載體 pcDNA3. 1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3. l_mP40 ；(4)通過&ilI+PvuII雙酶切出mP40基因表達盒，克隆入Sall+Swal雙酶切的質粒 pRec2. 0-PreS2S-mP35 中，獲得重組質粒 pRec2. 0-PreS2S_mIL12 ；(5)通過NdeI酶切質粒pRec2. 0-PreS2S_mIL12，共切出3個條帶 (1870bp+3448bp+3855bp)，回收1870bp片段及3855bp片段，將回收的3855bp片段進行CIP 去磷酸化后，與1870bp片段進行連接，篩選正向克隆的重組質粒pRec2. 0-mIL12 (pmIL12)。實施例4重組佐劑質粒phIL12的構建(1)將合成基因hP;35通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體 pcDNA3. 1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3. l_hP35 ；(2)通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3. l_hP35中切出hP35基因表達盒，克隆入Bglll+EcoRV雙酶切的質粒pRec2. 0_PreS2S中，獲得重組質粒 pRec2. 0-PreS2S-hP35 ；(3)將合成基因hP40通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體 pcDNA3. 1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3. l_hP40 ；(4)通過MlI+PvuII雙酶切出hP40基因表達盒，克隆入Mll+Swal雙酶切的質粒 pRec2. 0-PreS2S-hP35 中，獲得重組質粒 pRec2. 0_PreS2S_hIL12 ；(5)通過NdeI酶切質粒pRec2. 0_PreS2S_hIL12，共切出3個條帶 (1882bp+3446bp+3812bp)，回收1882bp片段及3812bp片段，將回收的3812bp片段進行CIP 去磷酸化后，與1882bp片段進行連接，篩選正向克隆的重組質粒pRec2. 0-hIL 12。實施例5融合方式構建的重組質粒pcDNA3. 1_SC與本發(fā)明設計的重組質粒pS2S_C 或pC-S2S對小鼠血清特異性抗體的檢測重組質粒pcDNA3. I-SC的構建按文獻方法(周陶友，趙連三，陳敏，等.融合表達 HBsAg/HBcAg的重組質粒誘導的小樹免疫應答)構建得到。6-8周齡Balb/c雌性小鼠購自中國醫(yī)學科學院動物繁殖中心，清潔級飼養(yǎng)，30只小鼠隨機分為3組，每組10只，分別腓腸肌注射重組質粒pcDNA3. I-SC (100 μ g)、重組質粒 pS2S-C(50 μ g)、重組質粒pC-S2S(50 μ g)，于第2、4周后各加強接種1次，采集小鼠血清。小鼠血清特異性抗體檢測分別于初次接種后第3、5、8、12周采集小鼠眶靜脈血，血清分離后置-80°C保存，將小鼠血清標本按1 5、1 IOU 25、1 50,1 100、 1 250、1 500稀釋，采用乙肝病毒抗-HBs和-抗-HBc檢測試劑盒(ELISA法)，對上述標本進行統(tǒng)一檢測。小鼠血清特異性抗體檢查結果抗-HBs 開始接種后3、5、8、12周，pcDNA3. I-SC組小鼠血清抗-HBs陽轉率分別為60%、80%、100%和70%，血清抗-HBs滴度逐漸升高，在第 8周達到峰值，而其抗-HBc值較低，僅部分小鼠可以檢測出，但其陽轉率均低于30 %。而對于優(yōu)化的重組質粒PS2S-C組，于開始接種3、5、8、12周后，其血清抗-HBs陽轉率分別為 70 %、100 %、100 %和80 %，抗體滴度在第5周即可達到峰值，與此同時，血清抗-HBc陽轉率分別為30%、40%、70%和50%，抗體滴度在第三周可達到最高，與重組質粒pcDNA3. I-SC 組相比，獲得血清抗-HBc陽轉率顯著要優(yōu)，差異具有顯著性(P <0.01)；對于優(yōu)化的重組質粒PC-S2S，于開始接種3、5、8、12周后，其血清抗-HBs陽轉率分別為0,20^^30% 和10%，抗-HBs陽轉率較低，均低于30%，但其對于的血清抗-HBc陽轉率分別為80%、 100%、100%和90%，血清抗-HBc的滴度明顯要高于pcDNA3. 1-SC組。實施例6表達不同形式HBcAg核酸疫苗的免疫原性比較比較截短、全長2種不同形式的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)核酸疫苗在小鼠體內的體液和細胞免疫原性，獲得優(yōu)化的免疫原設計方案；構建經(jīng)密碼子優(yōu)化的不同形式乙肝病毒HBcAg核酸疫苗，分別為①pRec2. O-Ct 表達截短至144aa的Core蛋白； ②pRec2. O-C表達全長183aa的Core蛋白；將上述疫苗質粒轉染細胞，WestemBlot 檢測目的抗原基因表達。通過肌肉注射法(每個質粒肌肉注射50 μ g)對Balb/c小鼠進行接種免疫后，ELISA方法檢測小鼠血清抗-HBc的抗體水平，IFN- y ELISPOT方法檢測小鼠體內HBcAg特異性T細胞免疫應答。結果除空白組小鼠以外，經(jīng)疫苗免疫后的各組小鼠均產(chǎn)生了 HBc抗原特異性抗體和T細胞應答，其中pRec2. O-C組抗-HBc抗體(110. 86士87. 03U/ml)和T細胞免疫反應水平(471. 3士88. Ospots)均顯著高于pRec2. O-Ct組(抗-HBc 38. 60士41. 87U/ml,IFN-y :203. 5士 126. 7spots) (P < 0. 05)。表明將 HBcAg 截短至 144 個氨基酸或會降低其體液及細胞免疫原性。實施例7雙質粒體外細胞瞬時轉染后HBsAg、IL12目的蛋白的表達按常規(guī)方法分別培養(yǎng)C0S-7細胞株、293T細胞株于含10%新生小牛血清(FBS) 的RPMI1640 (DMEM)培養(yǎng)基中，轉染前24h用胰蛋白酶消化帖壁細胞，重懸于含小牛血清 RPMI1640培養(yǎng)液，按3X IO5細胞/孔轉種于6孔培養(yǎng)板中，37°C、5 % CO2培養(yǎng)，待帖壁細胞生長達90 %融合度，取重組疫苗質粒pS2S-C、pCS2S，重組佐劑質粒pmIL12、phIL12， 用 Lipofectamine2000 轉染試劑進行細胞轉染(方法見 Lipofectamine2000protocol， Invitrogen公司)，質粒用量為5μ g/孔，37°C、5% CO2條件進行細胞培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)并于轉染后4 收集上清，檢測目的基因的表達量，HBsAg和IL12的定量測定按各自試劑盒的說明書進行，結果見表1和表2。表1重組疫苗質粒體外轉染C0S-7J93T細胞后HBsAg、HBcAg的體外檢測
■轉染細胞表達量二
C0S-793.215.1
293-T_6LJ__8. 4_
表2重組疫苗質粒體外轉染COS-7、293T細胞后ILl2的體外檢測
體外轉染嫌 -^1U21112 ^ (nS/ml) PML12 -= C0S-7 358. 7 564. 1 293-T _336. 9__ 381. 3_從表1和表2的結果可以看出，重組疫苗質粒PS2S-C和PC-S2S均能在C0S-7、 293-T細胞進行目的基因HBsAg的表達，檢測HBsAg的表達量分別為93. 2、15. 1和67. 9、 8. 4ng/ml,；重組佐劑質粒pmIL12和phIL12也均能在C0S_7、293_T細胞進行目的基因IL12 的表達，檢測IL12的表達量分別為358. 7,564. 1和336. 9、381. 3ng/ml。實施例8雙質粒疫苗的制備疫苗質粒(pS2S-C、pC_S2Q和佐劑質粒(pmIL12、phIL12)的制備方法相同，各質粒分開生產(chǎn)，具體步驟如下1)于平皿上挑取單克隆置于5-10ml含相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C， 200rpm 培養(yǎng) 10_12h ；幻以1 1000的比例將培養(yǎng)液加入2. 5L含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C， 200rpm 培養(yǎng) 12_16h ；3)于4°C，6000rpm離心15min，棄去上清，將沉淀重懸于500ml冰預冷的STE溶液中，4°C，6000rpm離心15min，棄去上清；4)菌體沉淀重懸于125ml的Buffer Pl中，振蕩至無沉淀團塊出現(xiàn)，加入125ml的Buffer P2，輕柔的顛倒離心管數(shù)次，室溫下靜置5min，待裂解充分后加入125ml的Buffer P3，顛倒離心管數(shù)次，充分混勻； 5)將混勻后的裂解產(chǎn)物倒入濾器(Mega-Giga Cartridge)中，室溫下靜置20min 以上，打開真空泵加壓抽濾，待液體抽濾完畢后，加入50ml的Buffer FWB2，用無菌玻璃棒輕輕攪動沉淀團塊，繼續(xù)進行抽濾； 6)在裂解液中加入30ml的Buffer ER,顛倒混勻，冰浴30min，待溶液澄清后加入預先用75ml的Buffer QBT平衡好的制備柱；7)待裂解液完全通過DNA制備柱后，用600ml的Buf f er QC洗脫雜質，待液體全部過柱后，以IOOml的洗脫液Buffer QN洗脫DNA ；8)收集DNA洗脫液，加入70ml的異丙醇，充分混勻后，于12°C，IOOOOrpm離心 50min ；9)小心倒去上清，用IOml 70 %乙醇洗滌沉淀，倒去乙醇洗液，離心管倒置在紙巾上自然干燥；10)加入5ml_10ml的生理鹽水溶解質粒DNA ；11)分光光度計測定所制備的質粒DNA的濃度，根據(jù)測定的質粒濃度相應的進行稀釋，稀釋為終濃度為lyg/μ 1(或0.4yg/y l，40ng/y l)，-20°c保存。實施例9含乙肝核心Core蛋白基因與不含Core蛋白基因對健康Balb/c小鼠的體液和細胞免疫比較6-8周齡Balb/c雌性小鼠購自中國醫(yī)學科學院動物繁殖中心，清潔級飼養(yǎng)。25只小鼠分為5個組，為pRec2. 0空載體組、4個免疫組分別給予重組質粒DNA疫苗pRec2. 0-S2S 組、對照質粒pcDNA3. 1-S2S、重組質粒DNA疫苗pRec2. 0-S2S-C (pS2S_C)、重組質粒DNA疫苗pRec2. 0-C-S2S (pC_S2S)各50 μ g進行免疫，每只小鼠按各組劑量注射質粒DNA，體積為 100 μ 1，每只小鼠兩后肢脛前肌各注射50 μ 1。免疫程序為0、2、4周各免疫一次，第6周殺鼠取血清并分離淋巴細胞。1、體液免疫檢測取小鼠血清嚴格按北京源德生物科技公司試劑盒使用說明書方法操作。2、細胞免疫檢測小鼠淋巴細胞制備頸椎脫臼法處死小鼠，置盛有75%乙醇的燒杯中，使小鼠體毛完全潤濕約3分鐘以上，然后切開小鼠腹腔，取出脾臟，將分離的脾臟放于下置無菌燒杯的200目篩網(wǎng)上(有培養(yǎng)液滴)，輕輕捻碎脾組織，研磨擠出脾細胞，取 5ml無血清1640培養(yǎng)液緩緩沖下細胞至燒杯中，將5ml脾細胞懸浮液緩慢加入裝有2. 5ml 淋巴細胞分離液的15ml離心管中，2000-2500r/min離心20min，收集分離淋巴細胞后，用 IC離心洗滌細胞兩次，每次1500r/min離心6min，用適量含5% FCS-1640完全培養(yǎng)液重懸分離的脾淋巴細胞，臺盼蘭染色計數(shù)每只小鼠分離淋巴細胞活細胞總數(shù)，調整細胞密度至 3X105/ml, 370C 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)以供ELISP0T檢測。3、ELISP0T檢測嚴格按BD公司試劑盒使用說明書方法操作，認為符合以下兩條者認定為ELISP0T檢測HBsAg特異性細胞陽性(1) 一定細胞密度條件下，ELISPOT檢測板中同一樣品HBsAg與非HBsAg刺激各3個復孔斑點均數(shù)(SFC)的比值應不小于2 ； (2)免疫實驗組樣品淋巴細胞密度為3X 105/ml孔檢測是，HBsAg與非HBsAg刺激各3個復孔SFC均數(shù)的差值不小于5。作為小鼠特異性細胞免疫的陽性評價標準，HBV DNA疫苗免疫組的血
18清-HBs ^ IOmIU被認為是機體保護性有效濃度，結果見3。表3含乙肝核心Core蛋白基因與不含Core蛋白基因對健康Balb/c小鼠的體液和細胞免疫比較
HBsAgHBcAg
肺 ^體液免疫細胞免疫體液免疫細胞免疫
pRec2. O pcDNA3. 1-S2S pRec2. O-S2S pS2S-C pC-S2S
46.25 士 20.31 97.49 ±40.21 106.34± 35.29
188.67 + 91.81 379.15 ±129.25 348.21 +59.05 113.40±43.37
46.41±19.14 275.49±84.07
146.30±58.15從上表結果可以看出，空載體質粒的HBsAg、HBcAg細胞免疫和體液免疫均呈陰性，而對于對照質粒pcDNA3. 1-S2S，其HBsAg的體液免疫值為(46. 25士20. 31)mIU/ml，細胞免疫值(188. 67 士91. 81) SFU/百萬細胞，而對于經(jīng)優(yōu)化的重組質粒pRec2. 0-S2S，其體液免疫值為(97.49士40.21)111貝/1111，細胞免疫值(379. 15士 129. 25) SFU/百萬細胞，明顯要強于對照質粒(差異具有顯著性，P <0.01)。對于優(yōu)化表達HBV包膜中蛋白S2S同時表達HBV核心Core蛋白的重組質粒pS2S_C，其HBsAg的體液免疫值略高于不含Core蛋白的重組質粒pRec2. 0-S2S,細胞免疫值要低于不含Core蛋白的重組質粒pRec2. 0-S2S，其值分別為(106. 34士35. 29)mIU/ml、(348. 21 士59. 05) SFU/百萬細胞，相互間差異無顯著性， 但重組質粒還可獲得HBcAg的體液免疫水平，其值為41 士 19. 14)U/ml，但HBcAg的細胞免疫值未檢測出，呈陰性。對于優(yōu)化表達HBV核心Core蛋白同時表達HBV包膜中蛋白的重組質粒PC-S2S，其HBsAg的細胞免疫值要低于pRec2. 0-S2S,為(113. 40 士43. 37) SFU/ 百萬細胞，體液免疫值未檢測出，呈陰性，但HBcAg的體液免疫和細胞免疫值較高，分別為 (275. 49士84. 07)U/ml、(146. 30士58. 15) SFU/百萬細胞。構建的同時含HBV包膜中蛋白和 HBV核心Core蛋白的重組質粒，與不含Core蛋白的重組質粒相比，在獲得HBsAg免疫水平的同時，還可獲得HBcAg的水平，起到更全面的免疫作用。實施例10雙質粒DNA疫苗對健康Balb/c小鼠的體液和細胞免疫6-8周齡Balb/c雌性小鼠購自中國醫(yī)學科學院動物繁殖中心，清潔級飼養(yǎng)。35只小鼠分為7個組，6個免疫組分別注射質粒疫苗pS2S-C+pReC2. 0 (50+50) Pg(組 II)、pS2S-C+pmIL12 (50+50) yg(組 III)、pS2S_C+phIL12 (50+50) μ g(組 IV)、 pC-S2S+pRec2. 0(50+50) μ g(組 V)、pC_S2S+pmIL12 (50+50) μ g(組 VI)、pC_S2S+phI L12 (50+50) μ g (組VII)，和一個空白對照組(注射pRec2. 0空載體50 μ g，組I)，每只小鼠按各組劑量注射質粒DNA，體積為100μ 1，每只小鼠兩后肢脛前肌各注射50μ 1。免疫程序為0、2、4周各免疫一次，第6周殺鼠取血清并分離淋巴細胞。體液免疫檢測、細胞免疫檢測及ELISP0T檢測方法同實施例8中的方法。結果見表4表4不同疫苗質粒對正常BaLb/c小鼠HBsAg、HBcAg的免疫水平 ±S
權利要求
1.一種用于治療乙肝的重組質粒DNA疫苗，其特征是所述重組質粒攜帶乙肝表面抗原蛋白編碼基因和乙肝核心抗原蛋白編碼基因。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組質粒DNA疫苗，其特征在于所述乙肝表面抗原蛋白編碼基因為編碼乙肝病毒包膜中蛋白S2S的編碼基因，所述乙肝核心抗原蛋白編碼基因為編碼乙肝核心Core蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權利要求2所述的重組質粒DNA疫苗，其特征在于所述S2S蛋白編碼基因，其核苷酸序列與kq ID No. 5具有至少70%的同源性，所述的Core蛋白編碼基因，其核苷酸序列與Seq ID No. 11具有至少70%的同源性。
4.根據(jù)權利要求2所述的重組質粒DNA疫苗，其特征在于所述重組質粒還包括大腸桿菌復制起始點ColEl、卡那抗性基因序列Kan及兩個目的蛋白表達盒；其中處于上游位置的表達盒為優(yōu)化目的蛋白表達盒，其包括來源于SV40的增強子元件Enhancer、轉錄調控元件內含子Intronl和外顯子Exonl、以及來源于HBV的轉錄后調節(jié)元件HPRE。
5.根據(jù)權利要求1或4任意一權利要求所述的重組質粒DNA疫苗，其特征是所述重組質粒為優(yōu)化表達HBV包膜中蛋白S2S的同時表達乙肝核心Core蛋白(C)的重組疫苗質粒 PS2S-C，所述的重組疫苗質粒pS2S-C具有如kq ID No. 1所示的核苷酸序列；或為優(yōu)化表達乙肝核心Core蛋白的同時表達乙肝包膜中蛋白的S2S的重組疫苗質粒pC-S2S，所述的重組疫苗質粒PC-S2S具有如kq ID No. 2所示的核苷酸序列。
6.一種用于治療乙肝的雙質粒DNA疫苗，其特征是所述雙質粒DNA疫苗包括權利要求 1或5任意一權利要求所述的重組質粒DNA疫苗和重組佐劑質粒。
7.根據(jù)權利要求6所述的雙質粒DNA疫苗，其特征是所述重組佐劑質粒為重組白介素 12(IL12)佐劑質粒 pIL12。
8.根據(jù)權利要求7所述的雙質粒DNA疫苗，其特征是所述的重組白介素12佐劑質粒為人重組白介素12佐劑質粒phIL12或鼠重組白介素12佐劑質粒pmIL12，其中重組佐劑質粒phIL12的核苷酸序列為kq ID No. 3所示的核苷酸序列，重組佐劑質粒pmIL12的核苷酸序列Skq ID No. 4所述的核苷酸序列。
9.構建權利要求5所述重組疫苗質粒PS2S-C的方法，其特征在于包括如下步驟(1)先構建重組質粒載體骨架pOE-EKS以pDRVISVl. O為模板，以Primerl與Primer2為引物，其中引物2為5，末端磷酸化的引物，擴增獲得大小為748bp的復制子區(qū)域(Ori)，同時引入Ec0RI、KpnI及SwaI酶切位點；Primer 1 :5’ -GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAGC_3’Primer2 5’ -CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAGG-3’以pDRVISVl. O為模板，以Primerf與Primer4為引物，其中引物3為5，末端磷酸化的引物，擴增獲得大小為1056bp的卡那抗性標記基因(Kan)，同時引入EcoRI酶切位點；Primerf :5’ -tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCTC-3'Primer4 :5，-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTCT-3’將上述兩個片段分別以EcoRI進行單酶切，連接后構建重組克隆pOK-EKS ；(2)構建重組質粒DNA疫苗pRec2.0_PreS2. S將合成基因ft~eS2S通過Xhol+Xbal雙酶切與Mll+Xbal雙酶切的載體pHPRE連接，構建獲得重組克隆pHPRE_PreS2S，其中合成基因preS2S具有如kq ID No. 5所示的核苷酸序列；以pDRVISVl. 0為模板，以Primer5與Primer6為引物，擴增獲得大小為271bp的 BGHpolyA區(qū)，同時在上游引入BamHI酶切位點，下游引入Bglll-EcoRV-SalI-KpnI酶切位點；通過BamHI+Kpnl雙酶切后克隆入Bglll+Kpnl雙酶切的pHPRE-PreS2S載體中，獲得重組質粒pHPRE，-PreS2S ； Primer5 5' -CGGGATCCgctgtgccttctagttgccag-3'Primer6 5’ -GGGGTACCGTCGACAACGTTGATATCAACGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATCC-3’ 通過EcoRI+Kpnl將重組質粒pHPRE，-PreS2S的ft~eS2S表達盒克隆入載體pOK_EKS 中，構建重組質粒pRec2. 0_PreS2S，其核苷酸序列為kq No. 2所標示的核苷酸序列。(3)構建重組質粒pRec2.O-C將合成基因CPreSl通過Xhol+Xbal雙酶切與Mll+Xbal雙酶切的載體pHPRE連接，構建獲得重組克隆pHPRE-CPreSl，其中合成基因CPreSl具有如kq ID No. 6所示的核苷酸序列；以pDRVISVl. O為模板，以Primer5與Primer6為引物，擴增獲得大小為271bp的 BGHpolyA區(qū)，同時在上游引入BamHI酶切位點，下游引入Bglll-EcoRV-SalI-KpnI酶切位點；通過BamHI+Kpnl雙酶切后克隆入Bglll+Kpnl雙酶切的pHPRE-CPreSl載體中，獲得重組質粒 pHPRE，-CPreSl ；通過EcoRI+Kpnl將重組質粒pHPRE，-CPreSl的CPreSl表達盒克隆入載體pOK-EKS 中，構建重組質粒pRec2. O-CPreSl ；以pRec2. O-CPreSl為模板，以Primer7與Primer8為引物，擴增獲得大小為596bp的 Core基因(C)，并通過I^stl+Xbal雙酶切后克隆入I^stl+Xbal雙酶切的pRec2. O-CPreSl載體中，獲得重組質粒pRec2. O-C0Primer7 5' -gtcttttctgcagtcaccgtcgTCGAG-3‘ Primer8 :5’ -GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3，(4)構建重組質粒pRec2. 0-PreS2S-C(pS2S-C)以pRec2. O-C為模板，以Primer9與Primer8為引物，擴增獲得大小為579bp的Core 基因(C)，通過HindIII+Xbal雙酶切與HindIII+Xbal雙酶切的載體pcDNA3. 1進行連接，構建獲得 pcDNA3. I-C ；Primer9 :5’ -CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGATATTG-3， Primer8 :5’ -GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3，通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3. 1-C上切出C表達盒，克隆入Bglll+EcoRV雙酶切的pRec2. 0-PreS2S中，構建獲得重組質粒pRec2. 0-PreS2S_C。
10.構建權利要求5所述重組疫苗質粒PC-S2S的方法，其特征在于包括如下步驟 以權利要求7步驟(2)中構建得到的pRec2. 0_PreS2S為模板，以Primerll與Primerl2 為引物，擴增獲得大小為873bp的ft~eS2S基因，通過HindiΙΙ+XbaI雙酶切與HindiII+XbaI 雙酶切的載體pcDNA3. 1進行連接，構建獲得pcDNA3. l_PreS2S ； Primerll :5’ -CCCAAGCTTGCCGCCACCATGCAGTGGAACTC-3， Primer12 :5’ -GCTCTAGAATCAGATGTAAACCCAC-3，通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3. l_PreS2S上切出I^reSZS表達盒，克隆入Bglll+EcoRV 雙酶切的 pRec2. O-C 中，構建獲得重組質粒 pRec2. 0_C_PreS2S (pC_S2S)。
11.構建權利要求8所述的重組佐劑質粒pmIL12的方法，其特征在于包括如下步驟將合成基因mP;35通過HindIII+Xbal雙酶切與HindIII+Xbal雙酶切的載體pcDNA3. 1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3. l-mP35，其中合成基因mP35具有如kq ID No. 7所示的核苷酸序列；通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3. l_mP35中切出mP35基因表達盒，克隆入 Bglll+EcoRV 雙酶切的質粒 pRec2. 0_PreS2S 中，獲得重組質粒 pRec2. 0-PreS2S-mP35 ；將合成基因mP40通過HindIII+Xbal雙酶切與HindIII+Xbal雙酶切的載體pcDNA3. 1 進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3. l-mP40，其中合成基因mP40具有如kq ID No. 8所示的核苷酸序列；通過MlI+PvuII雙酶切出mP40基因表達盒，克隆入Sall+Swal雙酶切的質粒 pRec2. 0-PreS2S-mP35 中，獲得重組質粒 pRec2. 0-PreS2S_mIL12 ；通過NdeI酶切質粒pRec2.0-PreS2S-mIL12，共切出3個條帶 (1870bp+3448bp+3855bp)，回收1870bp片段及3855bp片段，將回收的3855bp片段進行CIP 去磷酸化后，與1870bp片段進行連接，篩選正向克隆的重組質粒pmIL12(pmIL12)。
12.構建權利要求8所述的重組佐劑質粒phIL12的方法，其特征在于包括如下步驟將合成基因hP;35通過HindIII+Xbal雙酶切與HindIII+Xbal雙酶切的載體pcDNA3. 1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3. l_hP35，其中合成基因hP35具有如kq ID No. 9所示的核苷酸序列；通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3. l_hP35中切出hP35基因表達盒，克隆入 Bglll+EcoRV 雙酶切的質粒 pRec2. 0_PreS2S 中，獲得重組質粒 pRec2. 0-PreS2S-hP35 ；將合成基因hP40通過HindIII+Xbal雙酶切與HindIII+Xbal雙酶切的載體pcDNA3. 1 進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3. l_hP40，其中合成基因hP40具有如kq ID No. 10所示的核苷酸序列；通過MlI+PvuII雙酶切出hP40基因表達盒，克隆入Sall+Swal雙酶切的質粒 pRec2. 0-PreS2S-hP35 中，獲得重組質粒 pRec2. 0_PreS2S_hIL12 ；通過NdeI酶切質粒pRec2.0_PreS2S_hIL12，共切出3個條帶 (1882bp+3446bp+3812bp)，回收1882bp片段及3812bp片段，將回收的3812bp片段進行CIP 去磷酸化后，與1882bp片段進行連接，篩選正向克隆的重組質粒phIL12。
13.一種制備權利要求5所述雙質粒疫苗的方法，將重組質粒分別轉化大腸桿菌 DH5 α，篩選陽性克隆，將含陽性克隆的單克隆經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、擴增，再經(jīng)裂解、柱純化，收集目標質粒，生理鹽水溶解目標質粒即得。
14.大腸桿菌菌株DH5α /pmIL12,其特征在于含有重組佐劑質粒pmIL12，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期2010年04月13日，建議的分類名為大腸埃希氏菌 Esherichia coli，保藏編號為CGMCC No. 3726。
15.大腸桿菌菌株DH5α /phIL12,其特征在于含有重組佐劑質粒phIL12，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期2010年04月13日，建議的分類名為大腸埃希氏菌Esherichia coli，保藏編號為CGMCC No. 3727。
16.大腸桿菌菌株DH5α /pRec2. 0_S2S_C，其特征在于含有重組疫苗質粒pS2S_C，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期2010年04月13日，建議的分類名為大腸埃希氏菌 Esherichia coli，保藏編號為CGMCC No. 3728。
17.大腸桿菌菌株DH5α /pRec2. 0_C_S2S，其特征在于含有重組疫苗質粒pC_S2S，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期2010年04月13日，建議的分類名為大腸埃希氏菌 Esherichia coli，保藏編號為CGMCC No. 3729。
18.權利要求1-5中任意一權利要求所述重組質粒DNA疫苗在制備具有預防和治療乙型病毒性肝炎藥物中的應用。
19.權利要求6-8中任意一權利要求所述雙質粒DNA疫苗在制備具有預防和治療乙型病毒性肝炎藥物中的應用。
20.根據(jù)權利要求19所述的雙質粒DNA疫苗在制備具有預防和治療乙型病毒性肝炎藥物中的應用，其特征免疫給藥方式為皮下注射、肌肉注射或借助電穿孔方式進行免疫。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組質粒DNA疫苗，本發(fā)明重組質粒DNA疫苗同時攜帶乙肝表面抗原蛋白編碼基因和乙肝核心抗原蛋白編碼基因，在所構建的重組質粒DNA疫苗上包括兩個目的蛋白表達盒，其中一個為優(yōu)化的目的蛋白表達盒，兩個基因之間彼此通過一個目的蛋白表達盒隔開，本發(fā)明還涉及一種雙質粒DNA疫苗，該雙質粒DNA疫苗包括本發(fā)明所述重組質粒DNA疫苗和重組白介素12佐劑質粒。本發(fā)明構建的重組質粒DNA疫苗和及其組合物可用于制備具有預防和治療乙型肝炎的藥物。
文檔編號C12N15/51GK102233136SQ201010164759
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權日2010年4月30日
發(fā)明者劉勇, 周德勝, 張春麗, 李鼎峰 申請人:北京凱因生物技術有限公司, 北京凱因科技股份有限公司