專利名稱：一種制備沒食子酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備沒食子酸的方法，以工業(yè)單寧酸為原料，采用全細胞生物催 化法制備沒食子酸，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
沒食子酸(Gallic Acid,GA)又名倍酸、五倍子酸，化學(xué)名稱為3、4、5_三羥基苯甲 酸，為白色或淡黃色針狀結(jié)晶或粉末，通常是從一種水合物的形式存在。沒食子酸作為一種 重要的化工產(chǎn)品，具有廣闊的應(yīng)用市場；可用于有機合成、涂料、染料、醫(yī)藥、食品、化工、制 革、日化、農(nóng)業(yè)、礦產(chǎn)等領(lǐng)域，主要用于藥物、染料、食品、化妝品、飼料等領(lǐng)域。此外，在半導(dǎo) 體感光樹脂方面也有一定的應(yīng)用市場。制備沒食子酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝是以五倍子、塔拉為原料用化學(xué)水解法 (CN1706790)，即將五倍子用熱水浸提、濾除殘渣，得五倍子單寧酸溶液；經(jīng)濃縮至濃度為 20%左右的單寧溶液后加入堿進行直接水解，得到?jīng)]食子酸鹽和葡萄糖的反應(yīng)混合物再經(jīng) 中和分離、脫色、精制結(jié)晶、干燥得成品沒食子酸，該工藝的主要缺點是酸堿用量大、廢水量 多、環(huán)境污染嚴重、能耗大、對設(shè)備要求高、水解副產(chǎn)物葡萄糖無法除去而加大了廢水的污 染負荷等。與傳統(tǒng)的化學(xué)水解法相比，酶法最顯著的特點是底物水解安全，水解副產(chǎn)物葡 萄糖可作為碳源被生物催化劑代謝，不僅提高了資源的有效利用率，而且發(fā)酵液比水解易 于處理。采用生物發(fā)酵法制備沒食子酸在國內(nèi)外均有報道如生物工程學(xué)報2000，16 (5) 614-617《利用固定化黑曲霉單寧酶法制備沒食子酸》，但沒食子酸的得率偏低，僅為61%。 并且在一般發(fā)酵法生產(chǎn)工藝中，單寧酶的生成和水解單寧的反應(yīng)，都是在同一個反應(yīng)器 (發(fā)酵罐)中進行。由于兩個反應(yīng)要求的最佳條件不同，在發(fā)酵過程中，總是顧此失彼、相互 制約，兩者都不能達到最佳反應(yīng)狀態(tài)，導(dǎo)致水解不完全。^083532《酶法生產(chǎn)沒食子酸的工 藝》將發(fā)酵制酶與水解制酸分別在不同容器中分開進行，克服了以上缺陷，簡化了流程，改 善了生產(chǎn)環(huán)境，降低了原料的消耗，提高了產(chǎn)品收率。但采用五倍子和塔拉粉為原料，在產(chǎn)酶和產(chǎn)酸過程中均采用氨水調(diào)節(jié)PH值，由于 氨水存在易揮發(fā)、味濃等缺點，污染環(huán)境。在產(chǎn)酸階段沒有微生物的生長和產(chǎn)酶過程，所用 酶量大，產(chǎn)酶和產(chǎn)酸生產(chǎn)各需40小時以上，水解還不夠安全，收率還不夠高。本發(fā)明的目的是提供一種能克服上述缺點的制備沒食子酸的方法。以單寧酸為原 料，不用氨水調(diào)節(jié)PH值，選擇各種最佳的工藝參數(shù)和培養(yǎng)基的合理配伍比，從而降低了原 料消耗，縮短了反應(yīng)時間，改善了生產(chǎn)環(huán)境，提高了產(chǎn)品的收率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用以單寧酸為原料全細胞催化法制備沒食子酸。包括兩個階段。第一 階段利用微生物在含單寧和少量外碳源的水溶液中進行發(fā)酵，以單寧酸水解后產(chǎn)生的葡 萄糖作為后續(xù)碳源，供微生物生長、繁殖，與此同時微生物在溶液中經(jīng)單寧酸誘導(dǎo)產(chǎn)生單寧 酶；第二階段將第一階段產(chǎn)生的發(fā)酵液加入單寧酸溶液中，使單寧酸水解生成沒食子酸，同時添加無碳源培養(yǎng)基，使微生物生長和產(chǎn)酶過程得以延續(xù)，既保證了高效的產(chǎn)酸過程，同 時由于微生物的生長消耗了產(chǎn)酸過程產(chǎn)生的葡萄糖，降低了產(chǎn)酸液的粘度，有利于沒食子 酸的分離。
在發(fā)酵制酶過程中，各項發(fā)酵參數(shù)及培養(yǎng)基的配比十分重要，必須嚴格控制，適宜 溫度為23-38°C ；起始PH值為4. 0，反應(yīng)過程中加堿(如用10N的NaoH)調(diào)節(jié)在3. 0-5. 5之 間；溶氧量控制在3.0-6.00g02/lh之間。采用黑曲霉NO. 316作為產(chǎn)酶菌種。制酶培養(yǎng)基中，C/N比為2-10，單寧酸濃度為8-15 % ；單寧以外碳源加入量為單寧 量的0. 2-0. 8倍。外加碳源可用蔗糖或葡萄糖；外加氮源可以用硫酸銨、氯化銨或尿素等。 培養(yǎng)基中還應(yīng)有少量的硫、磷、鉀、鈉、鋅、鎂的無機鹽和酵母膏或復(fù)合維生素B族化合物作 為營養(yǎng)添加劑。用上述發(fā)酵條件和培養(yǎng)基配比制成的單寧溶液可用于水解制酸，以單寧酸為原 料加入溶解，制酸適宜溫度為22-38°C ；起始PH值為4.0，反應(yīng)過程中加lONnaoH調(diào)節(jié)在 3.0-5. 5之間；溶氧量控制在3.0-6.00g02/lh之間。以單寧為原料，單寧濃度為8-15% (W/ V)。使用本發(fā)明全細胞催化法生產(chǎn)沒食子酸，使用單寧酸，作為原料，反應(yīng)時間比普通 發(fā)酵法短，總共縮短了的30h，原料單耗低，產(chǎn)品得率高，達到90%以上，純度高達99%。外 加碳源僅為單寧用量的0. 2倍左右，節(jié)約了成本，又能使微生物生長和產(chǎn)酶過程得以延續(xù)， 還保證了高效的產(chǎn)酸過程，微生物的生長消耗了產(chǎn)酸過程中產(chǎn)生的葡萄糖，降低了酸液的 粘度，有利于沒食子酸的分離，改善了生產(chǎn)環(huán)境，本發(fā)明的生產(chǎn)工藝反應(yīng)緩和，無高溫、高壓 操作，“三廢”污染小，容易治理；酸堿及活性碳的消耗量比化學(xué)水解法和現(xiàn)有的發(fā)酵法均有 明顯降低?？s短了生產(chǎn)流程，水解后省去結(jié)晶和脫色操作各一次。


圖1為本發(fā)明制備沒食子酸的方法工藝流程圖。
具體實施例方式經(jīng)過菌種種子預(yù)培養(yǎng)，然啟轉(zhuǎn)入經(jīng)滅菌后培養(yǎng)基溶液中發(fā)酵制酶，經(jīng)測定酶活性 合格后，即用于水解制酸。水解反應(yīng)結(jié)束后，加硫酸或鹽酸調(diào)節(jié)PH經(jīng)過過濾除去濾渣，然后 將濾液濃縮，冷卻后得到粗結(jié)晶。將粗結(jié)晶分離，重新溶于水，加活性炭脫色，重結(jié)晶，然后 再次分離，回收母液，再干燥、粉碎、計量、包裝得沒食子酸產(chǎn)品。制酶實施例1
按以下成份配制培養(yǎng)基(g/1)
(nh4)2so42
kh2po42
MgSo47H201
ZnSo40. 6
酵母膏1
蔗糖15
單寧酸100
將配制好的培養(yǎng)基分裝在幾個1000ml的三角瓶中滅菌。為避免單寧高溫氧 化，單寧酸在滅菌后加入用lOmol/LNaOH調(diào)節(jié)溶液起始PH值為4. 0 ；接著立即接入黑曲 霉菌NO. 316，放置在ZHWY-2102C恒溫振蕩器上反應(yīng)。設(shè)定溫度為23_38°C，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為 120-128r/min，用10mol/L NaOH調(diào)節(jié)數(shù)次，使反應(yīng)液的PH值保持在3. 0-5. 5左右，連續(xù)反 應(yīng)30h，測定酶活性或單寧酸殘留變化趨緩，即用于制酸。制酶實施例2 按以下成份配制培養(yǎng)基(g/L)NH4cl2KH2P042MgS047H201ZnS040. 6酵母膏1葡萄糖15單寧酸100復(fù)合維生素B 8mg/L將配制好的培養(yǎng)基分裝在幾個1000ml的三角瓶中，滅菌后加入單寧。余下步驟按 照制酶實施例1進行。制酸實施例按以下成份配制培養(yǎng)基(g/L)(NH4) 2S042KH2P042MgS047H201ZnS040. 6酵母膏1將配制好的培養(yǎng)基加入帶有半自動流加堿裝置和外接酸度計和溶氧儀的發(fā)酵罐 中，滅菌。將單寧酸加入溶解，使溶液單寧濃度為8-15% (w/v)，初始PH4. 0。冷卻至室溫后 加入15-20% (v/v)新制好的全細胞發(fā)酵酶液，設(shè)定溫度為22-38°C，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為lOOr/min， 溶氧量3. 0-6. 00g 02/L. h。用lOmol/L NaOH流加調(diào)節(jié)，使反應(yīng)液的PH值保持在3. 0-5. 5左 右，連續(xù)反應(yīng)40h，直至單寧全部水解為止。反應(yīng)產(chǎn)物用鹽酸調(diào)節(jié)PH至2. 6-3. 5，經(jīng)過過濾、 濃縮、粗結(jié)晶、粗晶和母液分離、脫色、二次結(jié)晶、二次結(jié)晶分離、干燥、粉碎、得純度為99%， 得率達90. 8%的成品。
權(quán)利要求
一種制備沒食子酸的方法，加堿使五倍子或塔拉中的單寧水解，再經(jīng)過濾、濃縮、結(jié)晶、脫色、干燥而制得沒食子酸，其特征在于以單寧酸為原料，將微生物發(fā)酵制酶和水解制酸，分段在兩個不同的容器進行，確定制酶和制酸工藝中各項適宜的工藝條件和培養(yǎng)基的組份，在制酶制酸工藝中均采用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備沒食子酸的方法，其特征在于發(fā)酵制酶過程中，適宜溫 度為23-38°C;起始PH值為4. 0，用10N的NaOH調(diào)節(jié)至PH3. 0-5. 5 ；溶氧量控制在3. 0-6. 00g 02/L h之間，微生物采用黑曲霉NO. 316。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備沒食子酸的方法，其特征在于制酶培養(yǎng)基中，C/N比為 2-10、單寧酸濃度為8-15% ；單寧以外碳源加入量為單寧的0. 2-0. 8倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備沒食子酸的方法，其特征在于外加碳源可用蔗糖或葡 萄糖，外加氮源可用硫酸銨、氨化銨或尿素；培養(yǎng)基中還有硫、磷、鉀、鈉、鋅、鎂的無機鹽和 酵母膏或復(fù)合維生素B族化合物作為營養(yǎng)添加劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備沒食子酸的方法，其特征在于水解制酸中，以單寧酸為 原料加入溶解，溶液單寧的濃度為8-15% (w/v)，制酸適宜溫度22-38°C;起始PH值為4. 0 ； 反應(yīng)過程中加10N的NaOH調(diào)節(jié)至PH3. 0-5. 5之間；溶氧量控制在3. 0-6. 00g 02/L .h之間。
全文摘要
一種制備沒食子酸的方法，將制酶和制酸工藝分為兩個不同容器和分階段進行，在制酶和制酸工藝中，均采用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，目的是提供一種縮短反應(yīng)時間，降低原料及輔料消耗，由于不采用氨水調(diào)節(jié)pH值，消除了氨水味濃、易揮發(fā)、易污染環(huán)境的弊端，降低了對環(huán)境污染的方法。并且由于本發(fā)明在產(chǎn)酸階段仍有微生物的生長和產(chǎn)酶過程，水解安全、產(chǎn)品純度和得率均高于普通酶法，有較好的社會和經(jīng)濟效益。
文檔編號C12P7/42GK101864459SQ20101016515
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者張基明, 李迅, 王石發(fā), 谷文, 鄧厚璋 申請人:遵義市倍緣化工有限責(zé)任公司