專利名稱：一種喹諾酮藥物抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種喹諾酮藥物抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
喹諾酮類(4-quinolones，QNs)，又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是一類合成抗菌藥， 主要作用于革蘭陰性菌。喹諾酮按發(fā)明先后及其抗菌性能的不同，分為一、二、三、四代。第 一代喹諾酮類，具體品種有萘啶酸和吡咯酸等，因抗菌譜及臨床應(yīng)用范圍均較窄，現(xiàn)已不使 用。第二代喹諾酮類，吡哌酸是國內(nèi)主要應(yīng)用品種，在抗菌譜方面有所擴(kuò)大，但僅用于泌尿 道和腸道感染，目前已少用。第三代喹諾酮類有氟哌酸等一系列藥物，抗菌譜進(jìn)一步擴(kuò)大， 對(duì)葡萄球菌等革蘭陽性菌也有抗菌作用，對(duì)一些革蘭陰性菌的抗菌作用則進(jìn)一步加強(qiáng)。第 四代喹諾酮類抗菌藥包括恩諾沙星、諾氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、麻保沙星、 雙氟沙星、單諾沙星、培氟沙星和羅氟沙星等，已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性食品的生產(chǎn)中。隨著氟喹諾酮類抗菌藥在獸醫(yī)臨床和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其殘留問題已引起廣泛 的關(guān)注。QNs殘留除了其毒副作用對(duì)人直接危害外，更為嚴(yán)重的是其耐藥菌株正逐年上升， 新開發(fā)的氟喹諾酮類藥品的市場周期大大縮短。因此，必須重視氟喹諾酮類藥物在動(dòng)物性 食品中的殘留問題。食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)和歐盟都對(duì)于QNs的MRLs作了規(guī)定。目前 用于檢測QNs殘留的方法有微生物法、免疫分析法、高效液相色譜法(LC)、液相色譜-質(zhì) 譜(LC-MS)法和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)。目前，用于免疫檢測的抗體都是單克隆抗體或 多克隆抗體。單克隆抗體或多克隆抗體的制備必須通過細(xì)胞培養(yǎng)獲得，整個(gè)生產(chǎn)過程復(fù)雜， 消耗時(shí)間長，費(fèi)用高，且不易進(jìn)行操作。單鏈抗體是將抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因通 過一個(gè)短肽鏈連接后融合表達(dá)出來的抗體片斷，具有分子量小、特異性高、結(jié)合力強(qiáng)、易于 利用基因工程技術(shù)操作等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測喹諾酮藥物的單鏈抗體及其編碼基因。本發(fā)明所提供的單鏈抗體，由重鏈可變區(qū)、連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽、 輕鏈可變區(qū)依次連接組成，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列1自N末端起第1-121位 氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區(qū)的的氨基酸序列如序列1自N末端起第137-249位氨基 酸殘基所示。上述單鏈抗體中，所述連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽的氨基酸序列如序列 1自N末端起第122-136位氨基酸殘基所示。所述編碼基因?yàn)槿缦?)、2)、3)、4)或5)所示1)所述重鏈可變區(qū)的編碼基因?yàn)樽孕蛄斜碇行蛄?的5'末端起第1-363位核苷 酸所示的DNA分子；2)所述輕鏈可變區(qū)的編碼基因?yàn)樽孕蛄斜碇行蛄?的5'末端起第409-747位核 苷酸所示的DNA分子；
3)所述連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽的編碼基因?yàn)樽孕蛄斜碇行蛄?的 5'末端起第364-408位核苷酸所示的DNA分子；4)自序列表中序 列2所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)、2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA 分子。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和表達(dá)盒也屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述單鏈抗體在檢測喹諾酮藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所 述喹諾酮藥物為如下中的至少一種環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達(dá)氟沙星、 氟甲喹、惡喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依諾沙星。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供檢測喹諾酮藥物的免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測喹諾酮藥物的免疫試劑盒，為下述1)、2)、3)或4)中任一所 述試劑盒1)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、上述任一所述單鏈抗體 和酶標(biāo)記抗抗體；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原；2)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原的酶標(biāo)記物、上述任一所述單鏈抗體和抗抗 體；其中，所述抗抗體作為包被原；3)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原的酶標(biāo)記物、上述任一所述單鏈抗體；其中， 所述單鏈抗體作為包被原；4)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、上述任一所述單鏈抗體 的酶標(biāo)記物；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原。上述任一所述免疫試劑盒中，所述試劑盒中包括喹諾酮藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液、洗滌液 和樣品濃縮液；所述喹諾酮藥物標(biāo)準(zhǔn)品為環(huán)丙沙星；所述喹諾酮藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液為如下各濃度的溶液0 μ g/L、1 μ g/L、3 μ g/L、9 μ g/ L、27y g/L、81y g/L ；每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20，5g疊氮化鈉和 990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 005M-0. 015M, 具體為0. 01M, pH值為7. 2-7. 6，具體為7. 4 ；所述樣品濃縮液為濃度為0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，具體為 0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物是按照如下方法制備的將每 0. Immol喹諾酮藥物半抗原和0. 12mmolNHS溶解在2mL DMF和HCl的混合溶液中，DMF禾口 HCl的混合溶液中DMF與HCl的體積比為1 1，磁力攪拌，得到溶液I ；向所述溶液I中滴 力口 ImL DCC和DMF的混合溶液，DCC和DMF的混合溶液中DCC的濃度為0. 15mmol/ml, 25°C 攪拌lh，4°C冰箱攪拌12h，離心，取上清液；將所述上清液逐滴加到5mL載體蛋白的溶液中， 25°C攪拌0. 5h，透析，得到所述喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述載體蛋白的 溶液按照如下方法制備用PH值為8. 0、濃度為0. 2mol/L的碳酸緩沖液將45mg載體蛋白 溶解，并定容至5ml，得到所述載體蛋白的溶液；所述喹諾酮藥物半抗原為環(huán)丙沙星；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清白蛋白、血藍(lán)蛋白或卵清白蛋白；所述抗抗體為鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體。所述樣品稀釋液為將所述樣品濃縮液稀釋20倍得到的。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測喹諾酮藥物的膠體金試紙。本發(fā)明所提供的檢測喹諾酮藥物的膠體金試紙，包括樣品吸收墊、膠體金墊、反應(yīng) 膜和吸水墊，其依次連接；所述膠金墊包被有膠體金標(biāo)記的上述任一所述單鏈抗體；所述 反應(yīng)墊上含有檢測帶和質(zhì)控帶，檢測帶位置包被有上述任一所述喹諾酮藥物半抗原與載體 蛋白的偶聯(lián)物，質(zhì)控帶位置包被有鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測樣品中喹諾酮藥物的方法。本發(fā)明所提供的檢測樣品中喹諾酮藥物的方法，為如下I)或II)所示I)檢測樣品中喹諾酮藥物的方法包括如下步驟1)將待測樣品進(jìn)行前處理，得到待測樣本溶液；2)用上述任一所述免疫試劑盒對(duì)所述待測樣本溶液進(jìn)行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)和C)中的任一a)所述待測樣品為畜禽的肉、畜禽的肝臟或水產(chǎn)；將每3g所述待測樣品的均質(zhì)樣 品與9mL乙腈和氫氧化鈉水溶液的混合溶液混勻，4000r/min離心lOmin，取4mL上清液，加 入0. 02mol/L PBS緩沖液4mL，再加入二氯甲烷8mL，振蕩lOmin，4000r/min離心lOmin，取 下層有機(jī)相6mL，加入樣品稀釋液0. 5mL和正己烷lmL，渦動(dòng)2min，4000r/min離心lOmin，取 下層清夜，即得到待測樣本溶液；所述乙腈和氫氧化鈉水溶液的混合溶液中乙腈與氫氧化 鈉水溶液的體積比為84 16，所述氫氧化鈉水溶液中氫氧化鈉的濃度為0. lmol/L;b)所述待測樣品為蛋；用乙腈對(duì)所述待測樣品進(jìn)行提取，離心，取上清液；將所述 上清液脫脂，得到待測樣本溶液；具體為將每2g所述待測樣品的均質(zhì)樣品與SmL乙腈振 蕩混合5min，4000r/min離心5min，取上清液2mL，氮?dú)獯蹈?，用ImL正己烷溶解，渦動(dòng)lmin， 加入樣品稀釋液lmL，渦動(dòng)2min，4000r/min離心5min，取下層清夜，即得到待測樣本溶液；c)所述待測樣品為蜂蜜；將每Ig所述待測樣品與2mL PBS緩沖溶液振蕩混合 5min，再加入8mL 二氯甲烷，振蕩5min，4000r/min離心5min，取下層有機(jī)相4mL，氮?dú)獯蹈桑?用ImL樣品稀釋液溶解，得到的溶液即為待測樣本溶液；II)檢測樣品中喹諾酮藥物的方法包括如下步驟1)將待測樣品進(jìn)行前處理，得到待測樣本溶液；2)用上述任一所述膠體金試紙卡對(duì)所述待測樣本溶液進(jìn)行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)和C)中的任一a)所述待測樣品為牛奶；將樣品稀釋液和牛奶混合，得到的混合溶液即為待測樣 本溶液；所述樣品稀釋液和牛奶的體積比為(3-5) 1或4 1;b)所述待測樣品為畜禽的肉、畜禽的肝臟或水產(chǎn)；將每Ig所述待測樣品的勻漿組 織與4mL 0. 02M、pH 7. 4的PBS緩沖液混合均勻，3000轉(zhuǎn)離心5min，取上清液，即為待測樣 本溶液；c)所述待測樣品為蜂蜜；將蜂蜜與提取劑混合，得到的混合溶液為待測樣本溶 液；具體為將每Ig蜂蜜與4mL提取劑混合均勻，得到的混合溶液即為待測樣本溶液；每1 升所述提取劑由5ml Tween-20和995ml 0. 02M的PBS緩沖液組成，提取劑的pH值為7. 4 ；
所述喹諾酮藥物為如下中的至少一種環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、 達(dá)氟沙星、氟甲喹、惡喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依諾沙星；所述樣品稀釋液為將所述樣品濃縮液稀釋20倍得到的上述試劑盒既可以為酶聯(lián)免疫試劑盒，又可為發(fā)光免疫試劑盒，當(dāng)為酶聯(lián)免疫試 劑盒時(shí)，所述試劑盒中包括底物顯色液；所述底物顯色液由A液和B液組成，所述A液為濃 度為1. 5% -2. 5%的過氧化脲的水溶液，B液為濃度為0. 5% -1. 5%的四甲基聯(lián)苯胺的水 溶液；所述A液優(yōu)選為濃度為2 %的過氧化脲的水溶液，B液優(yōu)選為濃度為1 %的四甲基 聯(lián)苯胺的水溶液。本發(fā)明的單鏈抗體(scFv)是用基因工程方法將抗體重鏈可變區(qū)(VH)和 輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段連接肽(Linker)連接而成的重組抗體，是保持了親本抗體的抗 原親和活性和特異性的最小功能性抗體片段，可通過基因工程技術(shù)體外表達(dá)得到，可在細(xì) 菌中很經(jīng)濟(jì)地大規(guī)模生產(chǎn)，從而使得免疫檢測抗體的生產(chǎn)變得非常容易、簡便和經(jīng)濟(jì)，進(jìn)而 大大減少檢測試劑的費(fèi)用，比雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)得到單抗的方法要簡單得多。本發(fā)明抗體的 親和常數(shù)為3. 74X 109L/mol、半數(shù)抑制量(IC5tl)為1. 5ng/mL。本發(fā)明為食品中喹諾酮藥物 殘留檢測方法的建立提供高效價(jià)、高特異性的抗體來源。本發(fā)明試劑盒和膠體金試紙卡具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度高、成本低、操作 簡單、檢測時(shí)間短、適合各種單位使用、儲(chǔ)存簡單、保質(zhì)期長的優(yōu)點(diǎn)；能同時(shí)快速檢測大批量 樣品，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測。本發(fā)明試劑盒和膠體金試紙卡可以同時(shí)檢測環(huán)丙沙星、 恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達(dá)氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星、 依諾沙星多種藥物，將在喹諾酮類藥物的檢測中發(fā)揮重要作用。因此，本發(fā)明的抗體、試劑 盒、膠體金試紙及檢測方法在喹諾酮藥物的檢測中將發(fā)揮重大作用。


圖1為試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、抗體的制備及功能檢測一、喹諾酮藥物單鏈抗體的制備(一 )抗體的篩選取6個(gè)月雄性Balb/c小鼠，Trizol —步法提取脾細(xì)胞總RNA，純化得到mRNA，再逆 轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用全套引物，以cDNA為模板分別擴(kuò)增得到重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū) (VL)基因，經(jīng)疊加延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Overlap-PCR)將VH、VL基因隨機(jī)拼接為單鏈抗體 基因(ScFv)，然后將ScFv與載體pCANTAB5E連接得pCANTAB5E/ScFv，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl， 即得到鼠源非免疫單鏈抗體庫。用ELISA方法篩選得到帶有特異性的抗多種喹諾酮類藥物 的單鏈抗體的噬菌體顆粒，通過測序得到其相應(yīng)的核苷酸序列。該單鏈抗體的編碼基因序列如序列表中序列2所示，自序列2的5'末端起第 1-363位核苷酸編碼重鏈可變區(qū)，自序列2的5'末端起第409-747位核苷酸編碼輕鏈可變區(qū)，自序列2的5'末端起第364-408位核苷酸編碼短肽。該單 鏈抗體由重鏈可變區(qū)、連接所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽、輕鏈可變 區(qū)順次連接組成。該抗體的氨基酸序列如序列表中序列1所示，自序列1的N端起第1-121 位氨基酸殘基為重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，自序列1的N端起第137-249位氨基酸殘基為 輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，自序列1的N端起第122-136位氨基酸殘基為短肽序列。(二)抗體的制備表達(dá)載體pET20b購自德國N0VAGEN公司；大腸桿菌Escherichia coli BL21購自 德國 N0VAGEN公司；蛋白純化用 HisLink Protein Purification Resin購自美國 Promega 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為V8823。合成序列表中序列2所示基因，并在兩端引入酶切位點(diǎn)Xba I和Not I，用限制性 內(nèi)切酶Xba I和Not I酶切，回收目的基因片段；用限制性內(nèi)切酶Xba I和Not I酶切表達(dá) 載體pET20b，回收載體大片段；連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選培養(yǎng)，挑取單克??；將單 克隆接入液體培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切和測序驗(yàn)證，結(jié)果測得的序列如序列表中 序列2所示，表明重組載體中基因插入方向和序列均正確，將陽性重組載體記作重組表達(dá) 載體 pET20b/ScFv。采用氯化鈣法將重組表達(dá)載體pET20b/ScFv轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，抗性篩選，經(jīng)菌 液PCR及質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，得到含有重組表達(dá)載體pET20b/ScFv的重組大腸桿菌，記作重組大 腸桿菌 BL21/pET20b/ScFv。2XTY培養(yǎng)液的組成由胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl和水組成，每1升2XTY培養(yǎng) 液中胰蛋白胨的濃度為1.6%、酵母提取物的濃度為l%、NaCl的濃度為0.5%;各百分含量 均為質(zhì)量百分含量。含氨芐青霉素、氯霉素和葡萄糖的2XTY培養(yǎng)液是按照如下方法得到的向2XTY 培養(yǎng)液中添加氨芐青霉素、氯霉素和葡萄糖，使氨芐青霉素在溶液中的終濃度為IOOyg/ ml，使氯霉素在溶液中的終濃度為34 μ g/ml，使葡萄糖在溶液中的終濃度為1 % (質(zhì)量百分 含量)。發(fā)酵重組菌將重組大腸桿菌BL21/pET20b/ScFv的單個(gè)陽性菌落接種至含氨芐 青霉素、氯霉素和葡萄糖的2 X TY培養(yǎng)液中，37°C振搖，至培養(yǎng)體系的A6tltl為0. 6時(shí)，收集細(xì) 菌；將細(xì)菌重懸于2ml LB液體培養(yǎng)基中，按1 20的體積比將菌懸液接種至50ml含相同 濃度抗生素的LB液體培養(yǎng)基中(含相同濃度抗生素的LB液體培養(yǎng)基的組成氨芐青霉素、 氯霉素、酵母提取物、蛋白胨、NaCl和水組成；溶液中各成分的濃度為酵母提取物0. 5%, 蛋白胨1 %，NaCl 1 %，氨芐青霉素100 μ g/ml，氯霉素34 μ g/ml)，37°C振搖，至培養(yǎng)體系的 A600 為 0. 6 時(shí)，加 IPTG(0. 7mmol/L)誘導(dǎo)，30°C振搖 2. 5h，在 4°C下 5000r/min 離心 lOmin， 收獲細(xì)菌。用洗滌液(將20mmol Tris和0. 15mol NaCl用水溶解，用HCL調(diào)PH值至8. 0， 再用水定容至1L，得到1升洗滌液)洗滌1次，加溶菌液(將20mmol TrisUOml Triton Χ-100、250 μ mol PMSF、62. 5 X IO4U溶菌酶用水溶解，用HCL調(diào)PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升溶菌液)，30°C放置15min，然后在冰上超聲處理(輸出功率80% ) 10s，停10s， 反復(fù)3次，至細(xì)胞不再粘稠。在4°C 2000Xg離心20min，分別收集上清及沉淀。將沉淀用結(jié) 合緩沖液I (將20mmol Tris,0. 5mol Nacl和5_1咪唑用水溶解，用HCL調(diào)PH值至8. 0， 再用水定容至1L，得到1升結(jié)合緩沖液I)洗滌一次，而后，懸于結(jié)合緩沖液11(將20mmolTris、0. 5mol Nacl、5mmol咪唑和6mol尿素用水溶解，用HCL調(diào)PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升結(jié)合緩沖液II)中，4°C，12000 X g離心20min,收集上清，經(jīng)0. 45mm濾膜過濾， 收集濾液，得到抗體的粗制液。純化利用表達(dá)載體上帶有的組氨酸標(biāo)簽(His-tag)標(biāo)記通過親和層析純化單鏈 抗體蛋白。將 HisLink Protein Purification Resin 裝柱，以 10 倍柱體積的 binding buffer (將 lOOmmolHEPES、IOmmol 咪唑和 500mmol NaCl 用水溶解，再調(diào)節(jié) pH 值至 7. 5，然 后用水定容至1升，得到1升binding buffer)平衡純化柱，取抗體的粗制液上樣，然后用5 倍柱體積的wash buffer (將lOOmmolHEPES、IOOmmol咪唑和用水溶解，再調(diào)節(jié)pH值至7. 5， 然后用水定容至1升，得到1升wash buffer)洗脫雜蛋白，最后用10倍柱體積的elution buffer (將lOOmmolHEPES、250mmol咪唑用水溶解，再調(diào)節(jié)pH值至7. 5，然后用水定容至1 升，得到1升elution buffer)洗脫目標(biāo)蛋白，收集洗脫液，透析，得到純化的抗體。蛋白驗(yàn)證Western blot 收集上述各階段產(chǎn)物，進(jìn)行12 % SDS-PAGE電泳；將電 泳條帶印跡到NC膜上，再與HRP標(biāo)記的環(huán)丙沙星雜交，檢測發(fā)光條帶。環(huán)丙沙星購自美國 Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為33434
同時(shí)以轉(zhuǎn)入空載體pET20b的大腸桿菌BL21作為對(duì)照，并按照上述方法進(jìn)行表達(dá) 和純化，和Western blot檢測。Western blot檢測結(jié)果表明1)實(shí)驗(yàn)組得到的蛋白具有與環(huán)丙沙星結(jié)合的功能， 蛋白的分子量為29kD，與預(yù)期的蛋白分子量一致，表明目的蛋白為與環(huán)丙沙星結(jié)合的抗體。 2)對(duì)照組沒有檢測到任何與環(huán)丙沙星結(jié)合的蛋白條帶。(三)抗體的功能檢測1、用ELISA方法，檢測抗體的半抑制率(IC50)a、將實(shí)施例2中制備得到的偶聯(lián)物(CIP-BSA)用包被緩沖液溶解，得到CIP-BSA 的溶液(該溶液中CIP-BSA的濃度為1 μ g/ml)。包被緩沖液pH9. 6,0. lmol/L的碳酸鈉緩 沖液。向96孔板的孔中加入CIP-BSA的溶液，100 μ L每孔，37°C溫育2h ；傾去包被液，用 PBST溶液(PBS+0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，每次30s，甩干孔中液體；b、然后向每孔中加入200μ L2% BSA封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體；用PBST 溶液(PBS+0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，每次30s，甩干孔中液體。c、向孔中加入單鏈抗體溶液和不同濃度的CIP標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各50 μ L每孔，37°C孵 育1小時(shí)。以只加入單鏈抗體溶液不加入CIP標(biāo)準(zhǔn)品溶液的孔作陽性對(duì)照。單鏈抗體溶液的制備用樣品稀釋液稀釋實(shí)驗(yàn)(二)中的純化抗體得到溶液，抗體 在溶液中的濃度為5ng/mL ；樣品稀釋液為0. 002mol/L的磷酸鹽緩沖液。不同濃度的CIP溶液的制備用樣品稀釋液稀釋CIP得到溶液。d、用PBST溶液(PBS,0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，甩干孔中液體，力口 入HRP標(biāo)記的鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體，37°C孵育1小時(shí)；e、用 PBST 溶液(PBS，0. 05% Tween20)洗滌 3 次，250 μ L 每孔；加入 TMB 顯色，37°C 反應(yīng)10分鐘，加入2M硫酸終止顯色反應(yīng)，每孔50 μ L，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果如下
1)吸光度值與每孔所加入的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中CIP的濃度成反比；證明，所表達(dá)純化 得到的單鏈抗體具有針對(duì)CIP的結(jié)合特異性，并呈現(xiàn)線性關(guān)系，說明該抗體可用于對(duì)CIP的 免疫檢測。2)半抑制率(IC5tl)陽性對(duì)照孔(即不添加CIP標(biāo)準(zhǔn)品溶液的孔)的吸光度值為 B0,各實(shí)驗(yàn)孔的吸光度值為B，當(dāng)BziBci為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的CIP標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度即為半抑制 率(IC5tl)。該單抗的半抑制率(IC5tl)為1. 5ng/mL。2、抗體的親和常數(shù)測定方法取定量的一定稀釋度的抗體，分別加入逐漸增加 的抗原里，可使抗體的結(jié)合 達(dá)到飽和，以結(jié)合部分(B)為縱坐標(biāo)，抗原濃度(mol/L)為橫坐標(biāo)繪制飽和曲線，求出抗體 飽和程度為50%時(shí)的游離抗原濃度，其倒數(shù)即為該抗體在此稀釋度下的親和常數(shù)。結(jié)果抗體的親和常數(shù)為3· 74X 109L/mol。實(shí)施例2、檢測喹諾酮藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備本實(shí)驗(yàn)中的樣品稀釋液即為實(shí)驗(yàn)一種所述試劑盒中的樣品稀釋液。本實(shí)驗(yàn)中的洗板液即為實(shí)驗(yàn)一種所述試劑盒中的洗滌液。一、酶聯(lián)免疫試劑盒由下述物質(zhì)組成1、包被環(huán)丙沙星與載體蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板；2、喹諾酮抗體實(shí)施例1總所述單鏈抗體?？贵w工作液的濃度為5. Ong/mL，抗體 工作液是用樣品稀釋液稀釋實(shí)施例1中的純化抗體得到的到的；3、喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品為環(huán)丙沙星(CIP)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為Oyg/ L、ly g/L、3y g/L、9y g/L、27y g/L、81y g/L ；環(huán)丙沙星(CIP)購自美國 Sigma-Aldrich 公 司；產(chǎn)品目錄號(hào)為33434 ；用樣品稀釋液稀釋成上述各濃度；4、酶標(biāo)二抗辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體；購自美國 Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為A7058。5、底物顯色液由A液和B液組成，A液為2%過氧化脲的水溶液，B液為1 %四甲 基聯(lián)苯胺的水溶液；6、終止液0· 2M硫酸水溶液；7、洗滌液每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20、5g疊 氮化鈉和990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01M, PH值為7.4;8、樣品濃縮液0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；將其進(jìn)行20倍稀釋，成為樣品稀釋液
后使用。二、試劑盒組分的制備(一)包被原的制備以環(huán)丙沙星(CIP)作為喹諾酮半抗原。載體蛋白為BSA。NHS的全稱為N-羥基琥珀酰亞胺；DMF的全稱為N，N- 二甲基甲酰胺；DCC的全 稱為二環(huán)己基碳二亞胺；將0. Immol喹諾酮藥物半抗原和0. 12mmolNHS溶解在2mL DMF和HCl的混合溶液 中，DMF和HCl的混合溶液中DMF與HCl的體積比為1 1，磁力攪拌，得到溶液I ；向所述溶 液I中滴加ImL DCC和DMF的混合溶液，DCC和DMF的混合溶液中DCC的濃度為0. 15mmol/ml (DCC為固體，溶解于DMF中)，25°C攪拌lh，4°C冰箱攪拌12h，離心，取上清液；將所述 上清液逐滴加到5mLBSA的溶液中，BSA的溶液按照如下方法配制用pH值為8. O、濃度為 0. 2mol/L的碳酸緩沖液將45mg BSA溶解，并定容至5ml，25°C攪拌0. 5h，透析，得到所述環(huán) 丙沙星與BSA的偶聯(lián)物(記作CIP-BSA)。( 二 )包被有包 被原的酶標(biāo)板及其制備包被有合成抗原CIP-BSA的聚苯乙烯酶標(biāo)板用IOmM的碳酸鹽溶液將抗原作 1 50000倍稀釋(6. Oyg/mL)，包被96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，每孔100yL，37°C溫育2h，傾 去包被液，用洗板液稀釋20倍后洗滌3次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200 μ L封閉 液，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。包被緩沖液pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸鈉緩沖液；封閉液每1升封閉液按照如下方法配制將5ml馬血清、Ig疊氮化鈉、30g酪蛋 白混合，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至1000ml，得到封閉液；其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為 0. 02M, pH 值為 7. 2。三、試劑盒檢測方法(一)樣品前處理1、檢測樣本為畜禽的肉、畜禽的肝臟或水產(chǎn)取3g的均質(zhì)樣品分別加入乙 腈-0. lmol/L 氫氧化鈉水溶液(84 :16，V/V)9mL，振蕩混合 IOmin, 4000r/min 離心 IOmin, 取4mL上清液，加入0. 02mol/L PBS緩沖液4mL，再加入二氯甲烷8mL，振蕩lOmin，4000r/ min離心lOmin，取下層有機(jī)相6mL，氮?dú)獯蹈?；加入樣品稀釋?. 5mL,加入正己烷lmL，渦 動(dòng)2min，4000r/min離心lOmin，取下層清夜50 μ L進(jìn)行檢測。2、檢測樣本為雞蛋取2g的均質(zhì)樣品，加入8mL乙腈，振蕩混合5min，4000r/min 離心5min，取上清2mL，氮?dú)獯蹈桑患尤胝和閘mL，渦動(dòng)lmin，加入樣品稀釋液lmL，渦動(dòng) 2min,4000r/min離心5min，取下層清夜50 μ L進(jìn)行檢測。3、檢測樣本為蜂蜜取Ig的樣品，加入PBS緩沖溶液2mL，振蕩混合5min后，加入 二氯甲烷8mL，振蕩5min，4000r/min離心5min，取下層有機(jī)相4mL，氮?dú)獯蹈?；用ImL樣品 稀釋液復(fù)溶，取50 μ L進(jìn)行檢測。(二)用試劑盒檢測1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作向包被有包被原的酶標(biāo)板微孔中加入環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μ L，再加入環(huán)丙沙 星單鏈抗體工作液50 μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，每孔加 入250 μ L洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入酶 標(biāo)二抗工作液ΙΟΟμ L，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟，每孔加入 底物顯色液，輕輕振蕩混勻，37°C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入終止液50 μ L，輕輕振蕩 混勻，用酶標(biāo)儀，測定每孔吸光度值。用每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn)) 的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。以環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品濃度(yg/L)的半 對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。百分吸光度值(%) = (B/B0) X100%2、樣品中喹諾酮濃度的測定
向包被有包被原的酶標(biāo)板微孔中加入檢測樣本溶液50 μ L，再加入喹諾酮抗體工 作液50 μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，每孔加入250 μ L洗滌 液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶 標(biāo)記的二抗工作液100μ L，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟，每孔 加入混合底物顯色液100 μ L，輕輕振蕩混勻，37°C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入終止液 50 μ L，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀，測定每孔吸光度值。結(jié)果判斷用每個(gè)檢測樣本溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo) 準(zhǔn))的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)檢測樣本溶液的百 分吸光度值，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出檢測樣本溶液的吸光度值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度 值換算出樣本溶液中喹諾酮藥物的殘留量。四、試劑盒檢測效果評(píng)價(jià)(一)準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)向不含喹諾酮藥物的樣品(雞肉、豬肉、雞肝、魚肉、蝦肉及雞蛋、蜂蜜)中添加 如下藥物環(huán)丙沙星(CIP);使各添加藥物在樣品中的濃度為分別為20、40、6(^8/1^(或 yg/L)。蜂蜜樣品的添加濃度與雞肉一致。將添加后的樣品分別按照實(shí)驗(yàn)三中所述方法進(jìn)行前處理，得到檢測樣本溶液。從三個(gè)不同批次的試劑盒中各抽取3個(gè)試劑盒進(jìn)行檢測，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，分別 計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果分別見表1。表1精密度試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
一種單鏈抗體，由重鏈可變區(qū)、連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽、輕鏈可變區(qū)依次連接組成，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列1自N末端起第1 121位氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區(qū)的的氨基酸序列如序列1自N末端起第137 249位氨基酸殘基所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于所述連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū) 的短肽的氨基酸序列如序列1自N末端起第122-136位氨基酸殘基所示。
3.權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)、2)、3)、4) 或5)所示1)所述重鏈可變區(qū)的編碼基因?yàn)樽孕蛄斜碇行蛄?的5'末端起第1-363位核苷酸所 示的DNA分子；2)所述輕鏈可變區(qū)的編碼基因?yàn)樽孕蛄斜碇行蛄?的5'末端起第409-747位核苷酸 所示的DNA分子；3)所述連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽的編碼基因?yàn)樽孕蛄斜碇行蛄?的5'末 端起第364-408位核苷酸所示的DNA分子；4)自序列表中序列2所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)、2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子。
5.含有權(quán)利要求3或4所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和表達(dá)盒。
6.權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體在檢測喹諾酮藥物中的應(yīng)用，所述喹諾酮藥物為如下 中的至少一種環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達(dá)氟沙星、氟甲喹、惡喹酸、麻保 沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依諾沙星。
7.—種檢測喹諾酮藥物的免疫試劑盒，為下述1)、2)、3)或4)中任一所述試劑盒1)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、權(quán)利要求1或2所述單鏈抗 體和酶標(biāo)記抗抗體；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原；2)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原的酶標(biāo)記物、權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體和抗抗 體；其中，所述抗抗體作為包被原；3)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原的酶標(biāo)記物、權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體；其中， 權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體作為包被原；4)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、權(quán)利要求1或2所述單鏈抗 體的酶標(biāo)記物；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒中包括喹諾酮藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液、洗滌液和樣品濃縮液；所述喹諾酮藥物標(biāo) 準(zhǔn)品為環(huán)丙沙星；所述喹諾酮藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液為如下各濃度的溶液ο μ g/L、l μ g/L、3 μ g/L、9 μ g/L、 27μ g/L、81y g/L ；每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20，5g疊氮化鈉和990ml 磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 005M-0. 015M，具體為 0. 01M, pH 值為 7. 2-7. 6，具體為 7. 4 ；所述樣品濃縮液為濃度為0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，具體為0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物是按照如下方法制備的將每0. Immol喹 諾酮藥物半抗原和0. 12mmol NHS溶解在2mL DMF和HCl的混合溶液中，DMF和HCl的混合 溶液中DMF與HCl的體積比為1 1，磁力攪拌，得到溶液I ；向所述溶液I中滴加ImL DCC 和DMF的混合溶液，DCC和DMF的混合溶液中DCC的濃度為0. 15mmol/ml，25°C攪拌lh，4°C 冰箱攪拌12h，離心，取上清液；將所述上清液逐滴加到5mL載體蛋白的溶液中，25°C攪拌 0. 5h，透析，得到所述喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述載體蛋白的溶液按照如 下方法制備用PH值為8. 0、濃度為0. 2mol/L的碳酸緩沖液將45mg載體蛋白溶解，并定容 至5ml，得到所述載體蛋白的溶液；所述喹諾酮藥物半抗原為環(huán)丙沙星；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠 血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清白蛋白、血藍(lán)蛋白或卵清白蛋白；所述抗抗體為鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體。
9.一種檢測喹諾酮藥物的膠體金試紙，包括樣品吸收墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和吸水墊， 其依次連接；所述膠體金墊包被有膠體金標(biāo)記的權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體；所述反應(yīng) 膜上含有檢測帶和質(zhì)控帶，檢測帶位置包被有權(quán)利要求8中所述喹諾酮藥物半抗原與載體 蛋白的偶聯(lián)物，質(zhì)控帶位置包被有鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體。
10.一種檢測樣品中喹諾酮藥物的方法，為如下I )或II )所示I)檢測樣品中喹諾酮藥物的方法包括如下步驟1)將待測樣品進(jìn)行前處理，得到待測樣本溶液；2)用權(quán)利要求7或8所述免疫試劑盒對(duì)所述待測樣本溶液進(jìn)行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)和c)中的任一a)所述待測樣品為畜禽的肉、畜禽的肝臟或水產(chǎn)；將每3g所述待測樣品的均質(zhì)樣品 與9mL乙腈和氫氧化鈉水溶液的混合溶液混勻，4000r/min離心lOmin，取4mL上清液，加入 0. 02mol/L PBS緩沖液4mL，再加入二氯甲烷8mL，振蕩lOmin，4000r/min離心lOmin，取下 層有機(jī)相6mL，加入樣品稀釋液0. 5mL和正己烷lmL，渦動(dòng)2min，4000r/min離心lOmin，取下 層清夜，即得到待測樣本溶液；所述乙腈和氫氧化鈉水溶液的混合溶液中乙腈與氫氧化鈉 水溶液的體積比為84 :16，所述氫氧化鈉水溶液中氫氧化鈉的濃度為0. lmol/L ；b)所述待測樣品為蛋；用乙腈對(duì)所述待測樣品進(jìn)行提取，離心，取上清液；將所述上清 液脫脂，得到待測樣本溶液；具體為將每2g所述待測樣品的均質(zhì)樣品與SmL乙腈振蕩混 合5min，4000r/min離心5min，取上清液2mL，氮?dú)獯蹈?，用ImL正己烷溶解，渦動(dòng)lmin，加入 樣品稀釋液lmL，渦動(dòng)2min，4000r/min離心5min，取下層清夜，即得到待測樣本溶液；c)所述待測樣品為蜂蜜；將每Ig所述待測樣品與2mLPBS緩沖溶液振蕩混合5min，再 加入8mL 二氯甲烷，振蕩5min，4000r/min離心5min，取下層有機(jī)相4mL，氮?dú)獯蹈?，用ImL 樣品稀釋液溶解，得到的溶液即為待測樣本溶液；II )檢測樣品中喹諾酮藥物的方法包括如下步驟1)將待測樣品進(jìn)行前處理，得到待測樣本溶液；2)用權(quán)利要求9所述膠體金試紙對(duì)所述待測樣本溶液進(jìn)行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)和c)中的任一a)所述待測樣品為牛奶；將樣品稀釋液和牛奶混合，得到的混合溶液即為待測樣本溶液；所述樣品稀釋液和牛奶的體積比為(3-5) 1或4 1 ；b)所述待測樣品為畜禽的肉、畜禽的肝臟或水產(chǎn)；將每Ig所述待測樣品的勻漿組織與 4mL 0. 02M、pH 7. 4的PBS緩沖液混合均勻，3000轉(zhuǎn)離心5min,取上清液，即為待測樣本溶 液；c)所述待測樣品為蜂蜜；將蜂蜜與提取劑混合，得到的混合溶液為待測樣本溶液；具 體為將每Ig蜂蜜與4mL提取劑混合均勻，得到的混合溶液即為待測樣本溶液；每1升所述 提取劑由5ml Tween-20和995ml 0. 02M的PBS緩沖液組成，提取劑的pH值為7. 4 ；所述喹諾酮藥物為如下中的至少一種環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達(dá)氟 沙星、氟甲喹、惡喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依諾沙星； 所述樣品稀釋液為將所述樣品濃縮液稀釋20倍得到的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種喹諾酮藥物抗體及其應(yīng)用。該單鏈抗體由重鏈可變區(qū)、連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽、輕鏈可變區(qū)依次連接組成，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列1自N端起第1-118位氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列1自N端起第134-248位氨基酸殘基所示。本發(fā)明試劑盒和膠體金試紙卡具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度高、成本低、操作簡單、檢測時(shí)間短、適合各種單位使用、儲(chǔ)存簡單、保質(zhì)期長的優(yōu)點(diǎn)；能同時(shí)快速檢測大批量樣品，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測。因此，本發(fā)明的抗體、試劑盒、膠體金試紙及檢測方法在喹諾酮藥物的檢測中將發(fā)揮重大作用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101955540SQ20101016518
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者劉丹, 吳小平, 師偉, 徐飛, 李娜, 李杰超, 楊麗麗, 江海洋, 沈建忠, 溫凱, 王奇昌, 王戰(zhàn)輝, 程晶 申請(qǐng)人:北京維德維康生物技術(shù)有限公司