專利名稱:一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞dna快速定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種新型基因組DNA定量檢測(cè)用方法及試劑盒,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
隨著生物技術(shù)發(fā)展和健康水平提高,對(duì)各種病毒性疫苗和治療性抗體需求增加, 其中以哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的各種產(chǎn)物逐漸增加,由于各種細(xì)胞系如VER0、CH0、MDCK、 PER. C6等在高代次培養(yǎng)時(shí)有致腫瘤的擔(dān)憂,所以根據(jù)中華人民共和國藥典(二〇〇五年版)要求,各種屬此類細(xì)胞生產(chǎn)的產(chǎn)物,其宿主細(xì)胞DNA殘留量都有具體規(guī)定,如純化狂犬疫苗每劑不超過lOOpg,所以在生產(chǎn)、研發(fā)、質(zhì)量檢定過程中都需要進(jìn)行宿主細(xì)胞DNA含量檢測(cè)。目前所用的檢測(cè)方法為隨機(jī)引物,DNA聚合酶合成隨機(jī)探針,在生產(chǎn)實(shí)踐中我們發(fā)現(xiàn),這種探針檢測(cè)方法在雜交溫度提高,即特異性提高時(shí),靈敏度下降,常常不能達(dá)到應(yīng)用目的,檢測(cè)限在納克級(jí),只好增加探針使用量、降低雜交溫度,結(jié)果,靈敏度提高了,但特異性下降,且成本提高;另一個(gè)方面,從合成探針到雜交顯色完成需2. 5天時(shí)間,時(shí)間太長。Alu重復(fù)序列是哺乳動(dòng)物基因組中SINE家族的一員,約有50萬份拷貝。也就是說平均4 61Λ中就有一個(gè)Alu序列,約占人基因組序列10. 7%。由于這種DNA序列中有限制性內(nèi)切核酸酶Alu的識(shí)別序列AGCT,所以稱為Alu重復(fù)序列。典型的人基因組Alu序列長約300bp,由兩個(gè)同源但有差別的亞基構(gòu)成。限制性內(nèi)切酶AluI可將其剪切成130bp和 170bp兩段,因此將其定名為Alu序列。亞基來源于有缺失突變和點(diǎn)突變的7SLRNA基因。 兩個(gè)亞基間由腺嘌呤核苷酸密集的序列連接。右邊的亞基中有無關(guān)的31bp插入片段,稱為 IH。Alu序列兩端各有一個(gè)正向重復(fù)序列,末端有一個(gè)poly(A)尾。Alu序列一般散在分布,少數(shù)呈簇狀分布。在細(xì)胞遺傳學(xué)水平上觀察,Alu重復(fù)序列集中在基因轉(zhuǎn)錄最活躍的染色體區(qū)段內(nèi)。在所有已知的基因內(nèi)含子中,幾乎都發(fā)現(xiàn)了 Alu 序列。Alu家族不同成員之間的一致序列(consensus sequence)的同一性平均達(dá)87%。 小鼠基因組內(nèi)約有5萬份拷貝的Bl重復(fù)序列,長130bp,與Alu的一個(gè)亞基的同源性達(dá) 70% -80%。Alu序列的這些特點(diǎn)使得其成為替代隨機(jī)探針雜交方法進(jìn)行基因組DNA定量檢測(cè)的最佳選擇之一。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用于哺乳動(dòng)物基因組DNA分子定量檢測(cè)方法及試劑盒。本發(fā)明中檢測(cè)目的序列是在基因組中拷貝數(shù)高于1000的重復(fù)序列,其中最優(yōu)選人Alu重復(fù)序列及其同源的重復(fù)序列。本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方法是獲得所檢測(cè)宿主細(xì)胞的重復(fù)序列,設(shè)計(jì)并合成分子標(biāo)記引物,通過摻入標(biāo)記堿基, 以樣本中DNA為模板,按本專業(yè)人員熟知的DNA聚合酶方法合成含有2種以上分子標(biāo)記的
3目的序列。例如引物以生物素標(biāo)記,摻入地高辛或熒光素標(biāo)記的脫氧核苷酸,如此目的序列即含生物素-地高辛標(biāo)記或地高辛-熒光素標(biāo)記,由于其中標(biāo)記1 (生物素)與標(biāo)記2 (如地高辛或熒光素)在目的序列中是1對(duì)多的關(guān)系,信號(hào)可因此放大。標(biāo)記1用于固定在固相載體上,如表面包被標(biāo)記1配體(如親和素)的塑料、聚酯、 尼龍、玻璃、云母等材料。而對(duì)于標(biāo)記2可通過酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行檢測(cè),如標(biāo)記2為地高辛,則可通過酶標(biāo)記地高辛抗體,或者地高辛抗體+酶標(biāo)記二抗進(jìn)行檢測(cè)。如果標(biāo)記2為熒光素,則可通過熒光檢測(cè)設(shè)備直接進(jìn)行檢測(cè),或者化學(xué)發(fā)光物質(zhì)激活,其信號(hào)可反應(yīng)出樣本中DNA量,通過制備標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣本中DNA含量進(jìn)行定量檢測(cè)。將引物、DNA聚合酶、緩沖液、(標(biāo)記的)脫氧核糖核酸混合液,標(biāo)記物抗體或二抗, 酶學(xué)方法檢測(cè)底物,固定用配體包被孔板制備成試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
圖1目的序列合成;圖2檢測(cè)方法;圖3與隨機(jī)探針檢測(cè)限比較(VER0細(xì)胞DNA分析) 具體實(shí)施例以下實(shí)例是進(jìn)一步詳述本發(fā)明,但本發(fā)明內(nèi)容并非限定于此。1、引物合成 從GENBANK中查取非洲綠猴Alu序列,合成引物PBIOALUl :5’ -BI0TIN-AGGCCGGGCGCAGTGGCTCA-3’PBI0ALU2 :5’ -BIOTIN-GGACTGCAGTGGCGCAATCTC-3‘2、樣本DNA提取取VERO細(xì)胞狂犬疫苗,按標(biāo)定量加入1倍體積提取液(0. lmol/L NaOH, 0. Imo 1/ LNaCl,5g/L SDS),再行酚-氯仿抽提,DNA沉淀后,溶于50 μ 1 TE緩沖液中。3、目的序列合成取2μ 1實(shí)例2產(chǎn)物作為模板,取引物稀釋成1(^11,按?8々1^15 4 1,Taq酶5U, 10XPCR 緩沖液 5 μ l,dNTPs(10mMol/L)4y 1,地高辛標(biāo)記 dig-ll-Dutp (ImMol/L) 40 μ 1,模板100叫,純水加至5(^1。按95°C 5分鐘,然后95°C 30秒、54°C 30秒、72°C 10分鐘,然后加入IOOmM EDTA 5 μ 1終止反應(yīng)。4、目的序列檢測(cè)實(shí)例3反應(yīng)溶液1 μ 1加入有45 μ 1雜交液的微孔中,于37°C放置lOmin,然后用 370C的PBS/T洗板3次,加入50 μ 1 (1 X 105U/L)的抗地高辛過氧化物酶酶聯(lián)物,37°C放置 IOmin,然后棄去孔中液體,用PBS/T洗-板3次,再另入1滴TMB溶液和1滴0. 3ml/L H2O2, 避光放置IOminJnA 0. 5mol/L H2SO4終止顯色反應(yīng),測(cè)定A45(lnm。
權(quán)利要求
1.一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA定量檢測(cè)方法,用于以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為基質(zhì)的生物制品中殘留宿主細(xì)胞DNA檢測(cè)。采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中多拷貝基因?yàn)闄z測(cè)標(biāo)志序列模板,以及 DNA聚合酶、分子標(biāo)志物標(biāo)記引物、和分子標(biāo)記脫氧核糖核酸合成檢測(cè)目的核酸序列,并對(duì)其進(jìn)行標(biāo)志物定量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述多拷貝基因指這些基因序列在基因組序列中多于1000拷貝,優(yōu)選為Alu超家族基因序列,或1種以上該類基因的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)目的核酸序列特征為同時(shí)具有2種以上的分子標(biāo)志物組合,其中一種用于把分子標(biāo)志物固定在固相載體上,另一種用于信號(hào)放大檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述分子標(biāo)志物具體為生物素、地高辛、熒光素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、可用于標(biāo)記堿基的抗原;這些標(biāo)志物之間的組合優(yōu)選為生物素-地高辛、生物素-熒光素組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述固定指通過分子標(biāo)志物-配體之間的分子作用力把目的核酸序列連接到固相載體,以便于去除未標(biāo)記序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述信號(hào)放大檢測(cè)指把用于固定外的另一標(biāo)志物結(jié)合于帶有可檢測(cè)標(biāo)記的配體,具體為酶標(biāo)記抗體,通過對(duì)底物的催化轉(zhuǎn)換成可檢測(cè)產(chǎn)物,便于檢測(cè)。
7.一種試劑盒,包含權(quán)利要求1所述的目的核酸序列和合成條件,以及權(quán)利要求6所述的檢測(cè)條件。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA定量檢測(cè)方法,用于以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為基質(zhì)的生物制品中殘留宿主細(xì)胞DNA檢測(cè)。采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中多拷貝基因?yàn)闄z測(cè)標(biāo)志序列模板,以及DNA聚合酶、分子標(biāo)記引物、和分子標(biāo)記脫氧核糖核酸合成檢測(cè)目的序列,并對(duì)其進(jìn)行定量分析。與分子雜交方法比較具有檢測(cè)時(shí)間短(可在2小時(shí)內(nèi)完成)、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、靈敏度高的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102234688SQ20101016562
公開日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:北京心意圓成生物科技有限公司