專利名稱：一株高產(chǎn)3-羥基丁酮的地衣芽胞桿菌mel09的篩選及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高產(chǎn)3-羥基丁酮的地衣芽胞桿菌 (Bacillus licheniformis)MEL09 的篩選及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
3-羥基丁酮又名乙偶姻，自然界存在于玉米、可可、干酪及肉類等多種食品中， 3_羥基丁酮作為一種平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于食品、制約及化工等行業(yè)。隨著對(duì)3-羥基丁 酮的需求量的日益增加，3-羥基丁酮的生產(chǎn)方法的研究也引起了人研究者的廣泛關(guān)注。目 前，主要采用化學(xué)法、酶法利微生物發(fā)酵法合成3-羥基丁酮?；瘜W(xué)法以丁二酮及2，3- 丁二 醇為原材料，存在著副產(chǎn)物多、產(chǎn)品純度低及環(huán)境污染嚴(yán)重等問(wèn)題，且產(chǎn)品的質(zhì)量很難達(dá)到
目前3-羥基丁酮的最大消費(fèi)領(lǐng)域------食用級(jí)香料的要求。酶轉(zhuǎn)化法和化學(xué)法相似，也是
以丁二酮或2，3-丁二醇為原料，經(jīng)生物體內(nèi)的酶氧化或還原生成3-羥基丁酮。區(qū)別在于 酶法產(chǎn)物得率高、副產(chǎn)物少，并且產(chǎn)物具有旋光度，但要獲得大量特異性的酶比較困難。而 且，生產(chǎn)3-羥基丁酮的原料丁二酮及2，3- 丁二醇均來(lái)自于不可再生的石化資源石油，這勢(shì) 必會(huì)增加生產(chǎn)3-羥基丁酮的成本。因此這兩種工藝無(wú)法得到大規(guī)模地推廣應(yīng)用。以糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮的微生物主要包括克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、芽 胞桿菌屬、類芽胞桿菌屬、沙雷氏菌屬及乳球菌屬等細(xì)菌。但在大多數(shù)菌株代謝過(guò)程中， 3_羥基丁酮均是作為丁二酮，2，3-丁二醇的副產(chǎn)物而存在的，因此發(fā)酵過(guò)程中積累的3-羥 基丁酮濃度較低，直接導(dǎo)致發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。因此，篩選得到一株 高產(chǎn)3-羥基丁酮的微生物具有非常重要的意義。而關(guān)于地衣芽孢桿菌生產(chǎn)3-羥基丁酮的 研究并未見(jiàn)國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
要解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有3-羥基丁酮的生產(chǎn)方法中的技術(shù)難點(diǎn)及存在的問(wèn) 題，提供一株新型的高產(chǎn)3-羥基丁酮的地衣芽胞桿菌，利用該菌株發(fā)酵可產(chǎn)生高濃度的 3-羥基丁酮，該菌株是極具開發(fā)研究?jī)r(jià)值的3-羥基丁酮的生產(chǎn)菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人從國(guó)內(nèi)食醋廠取得土樣分離篩選獲得一株產(chǎn)3-羥基丁酮新型地 衣芽胞桿菌MEL09，對(duì)這株菌進(jìn)行了發(fā)酵研究。本發(fā)明提供的菌株是從國(guó)內(nèi)食醋廠取得土樣分離篩選獲得一株芽胞桿菌，16S rDNA結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特性，將其鑒定為Bacillus licheniformis，編號(hào)為MEL09。 該菌2009年8月7日保存于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC) 保藏，其保藏號(hào)為CCTCC N0 :M209173。本發(fā)明提供的地衣芽胞桿菌MEL09的形態(tài)特征與生理生化特征為經(jīng)過(guò)篩選獲得 的地衣芽胞桿菌(B. licheniformis)MEL09菌株形態(tài)為棒桿狀，在LB固體培養(yǎng)基上菌落圓形、邊緣不齊、毛發(fā)狀、菌苔干燥、不透明、蔓延、灰白色。產(chǎn)芽孢，V. P.反應(yīng)呈陽(yáng)性，可利用 葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇產(chǎn)酸，可水解淀粉、酪蛋白、明膠，可利用檸檬酸鹽，可在質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為的NaCl中生長(zhǎng)，可在55°C下生長(zhǎng)。生理生化特征見(jiàn)表1 : 表1

利用通用引物PCR擴(kuò)增該菌的16S rDNA，得到上述芽胞桿菌MEL09的16S
因序列1109bp，Genebank登記號(hào)為FJ715927，應(yīng)用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行相似性比較分析，MEL09菌株的基因序列(見(jiàn)序列表SEQ ID NO=D與地衣芽 胞桿菌(Bacillus licheniformis)DSM13相似性高達(dá)97%。結(jié)合生理生化分析及16S rDNA 序列分析結(jié)果，將菌株MEL09鑒定為芽胞桿菌屬地衣芽胞桿菌。本發(fā)明提供的芽胞桿菌MEL09是具有良好前景的產(chǎn)3_羥基丁酮的新型地衣芽孢 桿菌株，該菌株可在高滲LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。高滲LB培養(yǎng)基配方為葡萄糖100-500g/L;蛋 白胨5-20g/L ；酵母粉4-10g/L ；NaCl 5_20g/L ；瓊脂粉10_20g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前 調(diào)培養(yǎng)基的PH至7. 0-7. 4，在115°C高壓蒸汽下滅菌20min ；上述的地衣芽胞桿菌MEL09可以采用發(fā)酵法生產(chǎn)3_羥基丁酮。應(yīng)用上述微生物生產(chǎn)3-羥基丁酮的方法，其步驟如下(1)采用保藏號(hào)為CCTCC NO :M209173的地衣芽胞桿菌MEL09為生產(chǎn)菌種，按照常 規(guī)方法進(jìn)行活化培養(yǎng)得到種子液，將該種子液涂布到LB固體培養(yǎng)基上；(2)制備的地衣芽胞桿菌MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取步驟⑴的LB固體 培養(yǎng)基上的MEL09菌株一環(huán)，接種于裝有30-100mL LB培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，培養(yǎng)溫度 為30-40°C，置搖床上以200r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)9_12h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，即得到MEL09菌株的 細(xì)胞液體培養(yǎng)物；(3)發(fā)酵培養(yǎng)按250mL三角瓶裝20-60mL的量，投入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種步驟⑵ 的地衣芽胞桿菌MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物，接種量按體積比計(jì)為1_5%，培養(yǎng)溫度 為30-40°C，在搖床上以120-200r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)36_48h，得到發(fā)酵液；或按發(fā)酵罐容 積的40-80%投入所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，以0. 07-0. IMPa高壓蒸汽滅菌維持30min，冷卻至 300C -40°C，接入步驟(2)所述的地衣芽胞桿菌MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物，接種量按體積比計(jì)為1-5% ；培養(yǎng)溫度為30°C -40°C，控制通氣量為1 :0. 5-2vvm，控制發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn) 速為200-600r/min ；發(fā)酵時(shí)間為36_48h，得到發(fā)酵液；(4)產(chǎn)物檢測(cè)將步驟(3)的發(fā)酵液在8000-12000r/min下離心5-lOmin，收集上 清進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)分析發(fā)酵液中3-羥基丁酮的含量；以色譜純異丁醇(lg/L)作為內(nèi)標(biāo)， 測(cè)定條件使用FFAP毛細(xì)管柱，F(xiàn)ID檢測(cè)器，載氣為氮?dú)?N2)流速柱頭壓0. IMpa ；進(jìn)樣口溫 度:200°C，檢測(cè)器溫度:200°C;程序升溫:80°C保lmin，10°C /min升溫至150°C，保時(shí)2min ； 進(jìn)樣量0.2 μ L。上述條件下3-羥基丁酮的保留時(shí)間為3. lmin，丁二醇保留時(shí)間為6. 2min。其中步驟(1)或⑵中所述的LB培養(yǎng)基的成分及配比為蛋白胨5_20g/L;酵母粉 4-10g/L ；NaCl 5_20g/L;瓊脂粉10_20g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至 7. 0-7. 4，在115°C高壓蒸汽下滅菌20min ；步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為碳源 40-160g/L，有機(jī)氮源 6-30g/L，(NH4)2SO4 l_13g/L ;Κ2ΗΡ04 0. 1-5. Og/L ；MgSO4 0. l_5g/L ； NaCl 0.5-2g/L ；ZnCl2 0.05-0. 50g/L ；FeC13 0.01-0. 5g/L ；MnS04 0.005-0. lOg/L ；補(bǔ)充 蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至6. 5-7. 4，在115°C高壓蒸汽下滅菌20min。在本發(fā)明中，上述步驟(3)所述的碳源選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、D-甘露糖、木 糖、糖蜜的一種或兩種；所述的有機(jī)氮源選自玉米漿、蛋白胨或酵母粉中的一種或兩種。本發(fā)明所述的地衣芽胞桿菌MEL09可轉(zhuǎn)化碳源直接生成3_羥基丁酮，發(fā)酵液中 3-羥基丁酮濃度高，碳源轉(zhuǎn)化率高，是一株極具開發(fā)研究?jī)r(jià)值的3-羥基丁酮的生產(chǎn)菌株。


(圖或表)圖1為本發(fā)明的B. Iicheniformis MEL09菌株在葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn) 3_羥基丁酮的結(jié)果。有益效果提供了一種具有工業(yè)應(yīng)用潛力的生產(chǎn)3-羥基丁酮的優(yōu)良菌株。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1地衣芽胞桿菌MEL09的分離鑒定以及菌株的保存(1)芽胞桿菌MEL09的分離、篩選本發(fā)明從國(guó)內(nèi)食醋廠取得土樣，稱取1. 0-2. Og土樣于250mL三角瓶中，用10_50mL 無(wú)菌水懸浮，然后置于水浴鍋中，60°C處理lOmin，冷卻后進(jìn)行梯度稀釋，取0. 2mL稀釋液涂 布于LB固體平板上，301-401培養(yǎng)24-3611后，挑取單菌落，進(jìn)行￥. .實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。挑選 V. P.反應(yīng)陽(yáng)性的菌株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。挑取V. P.反應(yīng)陽(yáng)性的菌株單菌落接種到新鮮的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后，細(xì)胞液體培養(yǎng)物以3%的體積比的接種量接于裝有30mL發(fā)酵培 養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，30°C -40°C,以200r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)，36h后收集發(fā)酵液， 8000-12000r/min離心5-lOmin，收集上清液，采用氣相色譜法檢測(cè)3-羥基丁酮產(chǎn)量。(2)芽胞桿菌MEL09的鑒定生理生化鑒定參照伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)第8版菌株形態(tài)為棒桿狀，在LB固體培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣不齊，毛發(fā)狀，菌苔干燥， 不透明，蔓延，灰白色。產(chǎn)芽孢，V.P.反應(yīng)呈陽(yáng)性，可利用葡萄糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇產(chǎn) 酸，可水解淀粉，酪蛋白，明膠，可利用檸檬酸鹽。
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16S rRNA基因序列分析進(jìn)行菌種鑒定芽孢桿菌MEL09基因組DNA抽提將篩選得到的菌株在LB固體平板上劃線， 置37°C過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取少量菌體，轉(zhuǎn)接于LB搖瓶培養(yǎng)，于37°C以200r/min振蕩培養(yǎng)到 0D600 的值約為 0. 2-0. 3 ；離心收集菌體，以 STE(100mmol/L NaCl, 10mmol/L Tris HCl, ρΗ 8. 0, lmmol/L EDTA)洗滌菌體 1 次；加 100L 溶液 I (50mmol/L 蔗糖，25mmol/LTris HCl, pH 8. 0，lOmmol/LEDTA)懸浮菌體，再加30mg/mL的溶菌酶20 μ L，冰浴放置過(guò)夜；加200 μ L 2% SDS,輕緩混勻后置60°C水浴30min ；加100 μ L的5mol/LNaCl溶液，輕緩混勻后置冰浴 上IOmin ；以12000r/min離心5min，吸取上清液到一個(gè)新的Eppendorf管，用苯酚氯仿異戊 醇溶液(24 24 1，ν/ν)抽提2次；上清液加2倍體積的95%乙醇，于室溫下放5-lOmin 后，把溶液吸除后，以12000r/min離心5min，棄上清液，再用70%乙醇離心洗滌沉淀1次； 真空干燥沉滌，用20 μ L ddH20,加入10mg/mL的RNase溶液1-2 μ L，混勻后置37°C 0. 5h以 上，即為制備的總DNA溶液。取指數(shù)生長(zhǎng)期新鮮菌液，離心收集菌體，按基因組抽提試劑盒 提取基因組DNA。擴(kuò)增用引物為原核生物通用引物，引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。Primer 1 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3‘Primer 2:5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3‘PCR反應(yīng)采用25 μ L的體系10 X buffer (含 Mg2+)25 μ LdNTPs (1 Ommo 1/L)2. 5 μ LP1(IOpmoVL)1 μ LP2 (IOpmo 1/L)1 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0. 25 μ LTemplate DNA(l_3ug)1 μ LddH2016. 75 μ LPCR擴(kuò)增條件94 V預(yù)變性5min ；94 V變性lmin、57 °C退火lmin、72 V延伸 1. 5min、28個(gè)循環(huán)；72°C補(bǔ)平末端5min ；4°C保溫lOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化按上海華舜生 物技術(shù)公司的小量膠回收PCR產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明，測(cè)序由北京奧科生物技術(shù)公司完成。 經(jīng)測(cè)序后獲得的16S rDNA序列，在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)確定其種屬。菌株保存挑取本發(fā)明菌株MEL09接于LB液體培養(yǎng)基中，30-40°C，200r/min振蕩 培養(yǎng)24-30h后，取0. SmL的細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入裝有0. SmL的80%的甘油保藏管中，-70°C冷 凍保藏。該菌2009年8月7日保存于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心(CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為CCTCC N0 :M209173。實(shí)施例2 利用葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮(1)制備地衣芽胞桿菌MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取固體LB培養(yǎng)基上的地衣芽胞桿菌MEL09菌株一環(huán)，接種在裝有50mL LB培養(yǎng) 基的250mL錐形瓶中，在30°C _40°C條件下，置于搖床上以200r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)9_12h至 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，即制得地衣芽胞桿菌MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為葡萄糖60g/L ；蛋白胨5g/L ；酵母膏6g/L ； (NH4)2SO4 5g/L ；K2HPO4O. 5g/L ；MgSO4 0. 5g/L ；NaCl 2. 0g/L ；ZnCl2 0. 05g/L ；FeCl3 0. Olg/ L ；MnSO4 0. 005g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 0-7. 4，在115°C高壓蒸汽下滅菌20min。將上述地衣芽胞桿菌MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以體積比3%的接種量接種在 裝有滅菌的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在37°C條件下，置于搖床上以200r/min的 轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，接種后36h，3-羥基丁酮的產(chǎn)量達(dá)到18. 02g/L。實(shí)施例3 改變發(fā)酵條件，利用葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn) 3_羥基丁酮(1)制備上述地衣芽胞桿菌MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物同實(shí)施例1。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為葡萄糖140g/L;蛋白胨9g/L;酵母膏8g/L; (NH4)2SO4 9g/L ；K2HPO4L Og/L ；MgSO4 1. Og/L ；NaCl 0. 5g/L ；ZnCl2 0. 40g/L ；FeCl3 0. 50g/ L ；MnSO4 0. 10g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 0-7. 4，在115°C高壓蒸汽 下滅菌20min。將上述地衣芽胞桿菌MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以體積比3%的接種量接種在 裝有滅菌的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在37°C條件下，置于搖床上以200r/min的 轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，接種后36h，3-羥基丁酮的濃度達(dá)到40. 66g/L。實(shí)施例4:改變發(fā)酵條件，利用葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn) 3_羥基丁酮(1)制備上述地衣芽胞桿菌MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物同實(shí)施例1。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為葡萄糖100g/L;蛋白胨llg/L;酵母膏IOg/ L5(NH4)2SO4 8g/L ；K2HPO4 1. 5g/L ；MgSO4 1. 5g/L ；NaCl 1. 0g/L ；ZnCl2 0. 35g/L ；FeCl3 0. 45g/L ；MnSO4 0. 05g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 0-7. 4，在115°C高 壓蒸汽下滅菌20min。將上述地衣芽胞桿菌MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以體積比3%的接種量接種在 裝有滅菌的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在37°C條件下，置于搖床上以200r/min的 轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，接種后48h，3-羥基丁酮的濃度達(dá)到34. 83g/L。實(shí)施例5 改變發(fā)酵條件，利用葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn) 3_羥基丁酮(1)制備上述地衣芽胞桿菌MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物同實(shí)施例1。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為葡萄糖80g/L;蛋白胨3g/L;酵母膏12g/ L ； (NH4)2SO4 3g/L ；K2HPO4 2. 5g/L ；MgSO4 2. 5g/L ；NaCl 1. 5g/L ；ZnCl2 0. 10g/L ；FeCl3 0. 02g/L MnSO4 0. 01g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 0-7. 4，在115°C高 壓蒸汽下滅菌20min。將上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以體積比3%的接種量接 種在裝有滅菌的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在37°C條件下，置于搖床上以200r/ min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，接種后36h，3-羥基丁酮的濃度達(dá)到22. 32g/L。實(shí)施例6 改變發(fā)酵條件，利用葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn) 3_羥基丁酮(1)制備上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物同實(shí)施例1。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為葡萄糖120g/L;蛋白胨5g/L;酵母膏9g/L; (NH4)2SO4 7g/L ；K2HP042. 0g/L MgSO4 2. 0g/L ；NaCl 0. 5g/L ；ZnCl2 0. 15g/L ；FeCl3 0. 05g/
8L ；MnSO4 0. 015g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 0-7. 4，在115°C高壓蒸汽 下滅菌20min。將上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以體積比3%的接 種量接種在裝有滅菌的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在37°C條件下，置于搖床上以 200r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，接種后36h，3-羥基丁酮的濃度達(dá)到38. 62g/L。實(shí)施例7 利用蔗糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮(1)制備上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物同實(shí)施例1。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為蔗糖60g/L;蛋白胨9g/L;酵母膏14g/L ； (NH4)2SO4 6g/L ；K2HP043. Og/L ；MgSO4 3. Og/L ；NaCl 2. Og/L ；ZnCl2 0. 20g/L ；FeCl3 0. IOg/ L ；MnSO4 0. 020g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 0-7. 4，在115°C高壓蒸汽 下滅菌20min。將上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以體積比3%的接種量接 種在裝有滅菌的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在37°C條件下，置于搖床上以200r/ min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，接種后36h，3-羥基丁酮的濃度達(dá)到11. 23g/L。實(shí)施例8 利用麥芽糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮(1)制備上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物同實(shí)施例1。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為麥芽糖60g/L ；蛋白胨7g/L ；酵母膏7g/ L ； (NH4)2SO4 llg/L ；K2HPO4O. 5g/L ；MgSO4 0. 5g/L ；NaCl 2. Og/L ；ZnCl2 0. 25g/L ；FeCl3 0. 15g/L ；MnSO4 0. 025g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 0-7. 4，在115°C高 壓蒸汽下滅菌20min。將上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以體積比3%的接種量接 種在裝有滅菌的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在37°C條件下，置于搖床上以200r/ min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，接種后36h，3-羥基丁酮的濃度達(dá)到19. 15g/L。實(shí)施例9 利用甘露糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮(1)制備上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物同實(shí)施例1。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為甘露糖60g/L;蛋白胨5g/L;酵母膏Sg/ L5(NH4)2SO4 13g/L ；K2HP043. 5g/L ；MgSO4 0. 5g/L ；NaCl 2. 0g/L ；ZnCl2 0. 30g/L ；FeCl3 0. 20g/L ；MnSO4 0. 030g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 0-7. 4，在115°C高 壓蒸汽下滅菌20min。將上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以體積比3%的接種量接 種在裝有滅菌的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在37°C條件下，置于搖床上以200r/ min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，接種后36h，3-羥基丁酮的濃度達(dá)到16. 17g/L。實(shí)施例10 利用木糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮(1)制備上述Blicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物同實(shí)施例1。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為木糖60g/L ；蛋白胨3g/L ；酵母膏6g/L ； (NH4)2SO4 llg/L ；K2HP044. 5g/L ；MgSO4 5g/L ；NaCl 2. 0g/L ；ZnCl2 0. 30g/L ；FeCl3 0. 25g/ L ；MnSO4 0. 025g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 0-7. 4，在115°C高壓蒸汽 下滅菌20min。將上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以體積比3%的接種量接 種在裝有滅菌的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在37°C條件下，置于搖床上以200r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，接種后36h，3-羥基丁酮的濃度達(dá)到6. 25g/L。實(shí)施例11 利用玉米漿為有機(jī)氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮(1)制備上述Blicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物同實(shí)施例1。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為葡萄糖120g/L;玉米漿25g/L; (NH4)2SO4 5g/ L ；K2HPO4 4. Og/L ；MgSO4 4. 5g/L ；NaCl 0. 5g/L ；ZnCl2 0. 25g/L ；FeCl3 0. 05g/L ；MnSO4 0. 015g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 0-7. 4，在115°C高壓蒸汽下滅菌 20mino將上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以體積比3%的接種量接 種在裝有滅菌的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在37°C條件下，置于搖床上以200r/ min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，接種后36h，3-羥基丁酮的濃度達(dá)到35. 60g/L。實(shí)施例12 利用糖蜜為碳源玉米漿為有機(jī)氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn) 3-羥基丁酮(1)制備上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物同實(shí)施例1。(2)糖蜜的處理粗糖蜜用蒸餾水稀釋2倍，再用5mol/L硫酸調(diào)整其pH為3. 0， 在100°C處理lh，然后在室溫下過(guò)夜放置，過(guò)夜處理的粗糖蜜在SOOOg下離心15min，上清用 10mol/L NaOH調(diào)整其pH為6. 5放置于冰箱中待用；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為糖蜜上清液200-300mL ；玉米漿20g/L ； (NH4)2SO4 5g/L ；K2HPO4 4. Og/L ；MgSO4 4. 5g/L ；NaCl 0. 5g/L ；ZnCl2 0. 25g/L ；FeCl3 0. 05g/L ；MnSO4 0. 015g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 0-7. 4，在115°C高壓蒸汽下滅菌 20mino將上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以體積比3%的接種量接 種在裝有滅菌的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在37°C條件下，置于搖床上以200r/ min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，接種后36h，3-羥基丁酮的濃度達(dá)到25. 18g/L。實(shí)施例13 利用木糖與葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁 酮(1)制備上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物同實(shí)施例1。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為葡萄糖45g/L;木糖15g/L;玉米漿25g/L; (NH4)2SO4 8. Og/L ；K2HP042. 5g/L ；MgSO4 2. 0g/L ；NaCl 1. 0g/L ；ZnCl2 0. 30g/L ；FeCl3 0. 025g/L ；MnSO4 0. 025g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 0-7. 4，在115°C 高壓蒸汽下滅菌20min。將上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以體積比3%的接種量接 種在裝有滅菌的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在37°C條件下，置于搖床上以200r/ min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，接種后36h，3-羥基丁酮的濃度達(dá)到13. llg/L。實(shí)施例14 利用葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中生產(chǎn)3-羥基丁酮(1)制備上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物同實(shí)施例1。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為葡萄糖100g/L蛋白胨3g/L;酵母膏Sg/ L ； (NH4)2SO4 10g/L ；K2HPO4O. 5g/L ；MgSO4 0. 5g/L ；NaCl 1. 5g/L ；ZnCl2 0. 20g/L ；FeCl3 0. 04g/L ；MnSO4 0. 020g/L ；補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 0-7. 4，在115°C高 壓蒸汽下滅菌20min。
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將上述B. Iicheniformis MEL09菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以體積比3%的接種量接 種在裝有滅菌的2. IL發(fā)酵培養(yǎng)基的3L發(fā)酵罐中，通氣量1 l(vvm)，轉(zhuǎn)速600r/min，溫度 37°C，發(fā)酵至36h結(jié)束發(fā)酵。氣相色譜檢測(cè)分析所得到的3-羥基丁酮的濃度為36. 28g/L。
權(quán)利要求
一株高產(chǎn)3 羥基丁酮的地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)MEL09，該菌株保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC NO M209173。
2.如權(quán)利要求1的MEL09屬地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)，其分離篩選條 件從國(guó)內(nèi)食醋廠取得土樣，稱取1. 0-2. Og 土樣于250mL三角瓶中，用10_50mL無(wú)菌水懸 浮，60°C處理lOmin，冷卻后進(jìn)行梯度稀釋，取0. 2mL稀釋液涂布于LB固體平板上，30_40°C 培養(yǎng)24-361!，挑取單菌落，進(jìn)行￥. .實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。挑選V.P.反應(yīng)陽(yáng)性的菌株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。
3.如權(quán)利要求1的MEL09屬地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)，其形態(tài)及生理 生化特征為棒桿狀、在LB固體培養(yǎng)基上菌落圓形、邊緣不齊、毛發(fā)狀、菌苔干燥、不透明、 蔓延、灰白色，產(chǎn)芽孢。MEL09的生理生化特征 核甘酸序列分析利用通用引物PCR擴(kuò)增該菌的16S rDNA，得到上述芽胞桿菌MEL09 的16S rRNA基因序列1109bp，Genebank登錄號(hào)為FJ715927，應(yīng)用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中 的已有細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行相似性比較分析，MEL09菌株的基因序列與地衣芽胞桿菌 (Bacillus licheniformis)DSM13相似性高達(dá)97%。結(jié)合生理生化分析及16S rDNA序列 分析結(jié)果，將菌株MEL09鑒定為芽胞桿菌屬地衣芽胞桿菌。
4.如權(quán)利要求1的MEL09屬地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)，其生產(chǎn)3-羥 基丁酮的發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)碳源 50-150，有機(jī)氮源 6-30，(NH4)2SO4 1-13, K2HPO4O. 1-5. 0, MgSO4O. 1-5，NaCl 0. 5-2, ZnCl2 0. 05-0. 50，F(xiàn)eCl3O. 01-0. 5，MnSO4O. 005-0. 10，補(bǔ)充蒸溜水 至1L，調(diào)pH至6. 5-7. 4，115°C高壓蒸汽下滅菌20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的碳源選自葡萄糖，蔗糖，麥芽糖， D-甘露糖，木糖，糖蜜的一種或兩種；所述的有機(jī)氮源選自玉米漿，蛋白胨，酵母粉中的一 種或兩種。
6.如權(quán)利要求1的MEL09屬地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)，其發(fā)酵生產(chǎn) 3_羥基丁酮的條件250mL 二角瓶裝20-60mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為(體積比)，培 養(yǎng)溫度30-40°C，搖床轉(zhuǎn)速120-200r/min，發(fā)酵時(shí)間36_48h ；或按發(fā)酵罐容積的40-80%投 入所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，以0. 07-0. IMpa滅菌30min，冷卻至30_40°C，接種量為(體積 比)，培養(yǎng)溫度為30-400C，通氣量為1 0. 5-2 (vvm)，發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為200-600r/min ；
7.如權(quán)利要求1的MEL09屬地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)作為生產(chǎn)3-羥 基丁酮的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高產(chǎn)3-羥基丁酮的地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)MEL09的篩選及應(yīng)用。該菌株保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC NOM209173。其生物學(xué)特性為形態(tài)為棒桿狀，在LB固體培養(yǎng)基上菌落圓形、邊緣不齊、毛發(fā)狀、菌苔干燥、不透明、蔓延、灰白色，產(chǎn)芽孢，V.P.反應(yīng)呈陽(yáng)性。利用該菌株葡萄糖為碳源，在37℃搖瓶培養(yǎng)36h可產(chǎn)生40.66g/L的3-羥基丁酮。由該菌株產(chǎn)生的3-羥基丁酮是一種重要的化工原料，可廣泛應(yīng)用于食品化工醫(yī)藥等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12P7/26GK101899407SQ201010166969
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日
發(fā)明者冀志霞, 史勁松, 張曉梅, 竇文芳, 許正宏, 陳守文, 陳敬華, 馬昕 申請(qǐng)人:江南大學(xué)