專利名稱：一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物芯片基片的制備領域，特別是涉及一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片 的制備方法。
背景技術：
生物芯片技術作為一種可以進行高通量多樣品平行分析的重要工具，已經開始廣 泛應用于基因組學研究、單核苷酸多態(tài)性分析、臨床醫(yī)學檢驗等方面。它將大量的生物大分 子探針、基因片段、寡聚核苷酸或蛋白質等按特定方式排列在特殊載體的固定位置上，在特 定條件下與待檢樣品進行作用，通過精密的掃描儀器進行記錄、檢測、分析，具有自動化程 度高、檢測目的分子數(shù)量較多、高通量等優(yōu)點。生物芯片一般來說選擇經過相應處理的硅片、玻璃片、金屬片、塑料片或聚丙烯 膜、硝酸纖維素膜等作為載體。玻璃片由于具有廉價、表面光滑、低熒光背景及性能穩(wěn)定等 優(yōu)點，已經被廣泛應用于DNA和蛋白芯片微陣列的制作。要使探針固定在玻璃片表面，必須 先對玻璃片表面進行物理化學修飾。目前玻璃片表面化學修飾的方法很多，大致可分為二 維表面修飾和三維表面修飾兩類。以玻璃片為載體的二維表面修飾有氨基修飾、醛基修飾、巰基修飾及聚賴氨酸修 飾等，這類載體大部分通過一些分子間親和力或共價鍵把基因或蛋白探針固定在其表面， 這種方法成本較低、便于制備、重復性好、熒光背景相對較低。但是仍存在一定缺陷，如探針 固定量較小、表面均一性差、點樣點不夠規(guī)整以及表面官能團與探針之間發(fā)生非特異性交 互作用使玻璃片背景增高等問題。三維表面修飾是在玻璃片表面包一層凝膠或樹突狀多聚 物，然后再引入活性基團，從而在玻璃片表面形成三維立體結構。由于三維多孔結構，載體 表面與探針接觸面積大大增加，從而固定量也增加，提高了固定效率；另外，凝膠內濕潤微 環(huán)境使固定在上面的蛋白質溶液不易蒸發(fā)，從而保持了蛋白的活性。但是由于這些納米級 的多孔材料結構較為復雜，使得微陣列上的各種生物大分子探針間的距離控制較為困難， 探針及多孔材料之間的交互作用因此增強，導致檢測時的背景增高；此外，這些大分子多孔 材料的使用給微陣列的后續(xù)洗脫也帶來了問題。因此有良好的生物分子結合能力和表面質 量高、背景低、信號強度高的生物芯片基片的發(fā)明勢在必行。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法， 該制備方法簡單，成本低，適合于工業(yè)化生產；所得基片背景低、表面均一、點樣點比較規(guī) 整、結合力強，大大提高了固定效率，它具有較高荷載和結合蛋白質分子的能力，是一類較 新的蛋白質微陣列載體。本發(fā)明的一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，包括(1)高硼硅玻璃片表面處理將超聲處理過的高硼硅玻璃片浸泡在濃硫酸、過氧 化氫和超純水(體積比為4 1 20)的混合液中，80 130°C下放置15 30分鐘，冷卻、超純水洗沖洗后浸泡于濃鹽酸和乙醇(體積比為1 1)混合溶液中3 24小時，超純水 清洗3 5次，110 140°C烘干15 30分鐘；(2)環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液的配制配制含1 3vol % GPTMS, 1 3vol %冰醋酸 的無水乙醇或異丙醇溶液，磁力攪拌，升溫至60 80°C，回流1 2小時，降至室溫，整個過 程在避光條件下進行；(3)環(huán)氧基修飾調節(jié)上述硅烷偶聯(lián)劑溶液的PH = 7，磁力攪拌3 5分鐘；迅速 加入經表面過處理后的高硼硅玻璃片，在25 30°C，相對濕度為30 50%恒溫恒濕箱中 放置2 24小時，取出后先用無水乙醇清洗，然后再用超純水沖洗，110 140°C烘干15 30分鐘，即得環(huán)氧基修飾的生物芯片基片。所述步驟(1)中的高硼硅玻璃片外形尺寸為25. Omm士0. 2_X 75. 6mm士0. 2_、 厚度為1.0mm士0. 02mm，其優(yōu)勢在于“零”熒光背景、表面被拋光達到了原子平整的程度 (士20埃)、玻璃片間差異系數(shù)(CV) < 10%。所述步驟(1)中的超聲是在超純水中超聲5 10分鐘。所述步驟(2)中環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液的配制取99.8%無水乙醇77.6ml， GPTMS2. 4ml，冰醋酸2. 4ml加入到三口燒瓶中，用油浴加熱到60°C，在磁力攪拌下回流2小 時，然后降至室溫。所述步驟(2)中環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液的配制取lmlGPTMS，98ml異丙醇，Iml醋 酸加入到三口燒瓶中，用油浴加熱到80°C，在磁力攪拌下回流1小時，然后降至室溫。所述步驟(3)中使用濃氨水調節(jié)硅烷偶聯(lián)劑溶液的pH。有益效果(1)本發(fā)明所提供的生物芯片基片的制備方法簡單易行，不僅可以用于制備環(huán)氧 基修飾的生物芯片基片，同時也可以用于氨基修飾的生物芯片基片的制備；(2)本發(fā)明所制備的生物芯片基片，由于表面環(huán)氧基的活性較強，提高了基片結合 氨基修飾的DNA探針和蛋白探針的能力，從而降低了在制備生物芯片過程中DNA探針和蛋 白探針的點樣濃度，最終降低了生物芯片的成本，推動了生物芯片產業(yè)的進一步發(fā)展；(3)本發(fā)明所得的生物芯片基片背景低、表面均一、點樣點比較規(guī)整、信號強度達 6萬左右遠高于普通氨基片、醛基片等，不僅解決了普通氨基片和普通醛基片對氨基修飾的 核酸探針固定弱或固定不上的問題，大大提高了固定效率，而且它具有較高荷載和結合蛋 白質分子的能力，是一類較新的蛋白質微陣列載體，其表面的環(huán)氧基活性很強，不但可以和 氨基反應，還可以和蛋白質表面的其他集團如羧基、巰基、羥基等反應，如圖1和2所示；本 發(fā)明的環(huán)氧基片其點的變異度較小，沒有拖尾現(xiàn)象，點較圓潤，背景較低，是一種理想的制 備生物芯片的基片；(4)本發(fā)明所得的生物芯片基片表面具有牢固的特異性結合點，能夠廣泛應用于 DNA微陣列和蛋白微陣列的載體。


圖1環(huán)氧基與氨基修飾的DNA分子的反應機理2環(huán)氧基與蛋白質表面活性基團的反應機理3環(huán)氧基片點樣試驗中點樣矩陣示意圖
圖4環(huán)氧基片點樣后的熒光掃描圖片。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。實施例1環(huán)氧基生物芯片基片的制備(1)分別量取99. 8%無水乙醇77. 6ml, GPTMS2. 4ml，冰醋酸2. 4ml加入到三口燒 瓶中，用油浴加熱到60°C，在磁力攪拌下回流2小時，然后降至室溫，整個過程在避光條件 下進行。(2)將硼硅玻璃片放入裝有超純水的染色缸中超聲10分鐘，超純水沖洗兩次，然 后浸泡于濃硫酸、過氧化氫和超純水(體積比為4 1 20)的混合液中，在130°C的鼓風 干燥箱中放置15分鐘，冷卻，用超純水沖洗3次；然后在濃鹽酸和乙醇(體積比為1 1) 混合溶液中浸泡3小時，超純水清洗3次，110°C烘干30分鐘，冷卻至室溫。(3)在配制好的硅烷偶聯(lián)劑溶液中加入濃氨水，調節(jié)溶液pH = 7，在避光條件下磁 力攪拌5分鐘，將經過表面處理的硼硅玻璃片放入環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液中，然后放入恒 溫恒濕箱中，相對濕度控制在50 %，溫度設定為30°C，分別放置2、5、8、10、15、20、24小時， 取出后用無水乙醇沖洗3次，超純水沖洗3次，110°C烘干30分鐘即得到環(huán)氧基基片。此實施例中所得到的表面處理過的高硼硅玻璃片和環(huán)氧基基片分別用原子力顯 微鏡進行了表面表征。實施例2環(huán)氧基生物芯片基片的制備(1)分別量取lmlGPTMS，98ml異丙醇，Iml醋酸加入到三口燒瓶中，用油浴加熱到 80°C，在磁力攪拌下回流1小時，然后降至室溫，整個過程在避光條件下進行。(2)首先硼硅玻璃片放入染色缸中在超純水中超聲5分鐘，超純水沖洗3次后浸 泡于濃硫酸、過氧化氫和超純水(體積比為4 1 20)的混合液中，80°C放置30分鐘，冷 卻，超純水清洗3次，然后浸泡于濃鹽酸和乙醇(體積比為1 1)混合溶液中24小時，超 純水清洗5次后140°C烘干15分鐘。(3)在配制好的硅烷偶聯(lián)劑溶液中加入濃氨水，調節(jié)溶液pH = 7，在避光條件下磁 力攪拌3分鐘，將經過表面處理的硼硅玻璃片放入環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液中，然后放入恒 溫恒濕箱中，相對濕度控制在30 %，溫度設定為25 °C，放置2、5、8、15、20、24小時，取出后用 無水乙醇清洗3次，超純水清洗3次，140°C烘干15分鐘后即得到環(huán)氧基片。實施例3環(huán)氧基生物芯片基片固定能力的檢測本實施例所用到的環(huán)氧基基片是按實施例1所述的方法制備的，本實施例是通過 Arrayit SpotBot 2點樣儀對環(huán)氧基片進行點樣試驗，點樣矩陣設計示意圖如圖3所示， 然后再通過Axon GenePix 4000B :Cy3PMT600，PowerlOO掃描儀檢測其熒光信號強度來反映環(huán)氧基片的固定能力，具體操作如下(1)準備點樣樣本a.室溫下，將DNA探針以0. 05 μ M、0. 1 μ M、0. 5 μ M、1 μ M的濃度分別到50 % DMS0/50%H20 的緩沖液中。將抗體探針以 0. 5μ g/μ 1、1μ g/μ 1、2. 5μ g/μ 1、5μ g/μ 1 的 濃度分別到20%甘油/80% H2O的緩沖液中； b.將樣本根據(jù)矩陣設計示意圖轉移到96孔板或384孔板中，輕敲微孔板使液體流 至孔底，將玻片整齊擺放在點陣儀底盤上；c.啟動點陣儀，自上而下在基片的右邊點陣5個1號緩沖液5X4的陣列到抽選 的基片上，在基片的左邊點陣5個2號緩沖液5X4的陣列到擺放好的基片上。溫度控制在 25 °C室溫，濕度控制在70%左右。(2)探針與環(huán)氧基的結合點樣后，將芯片放入芯片盒中，在37°C恒溫恒濕箱中靜 止24小時。(3)洗片a.制備洗滌液 1 (2xSSC/0. 2 % SDS)，洗滌液 2 (IxSSC)；b.將芯片置于芯片染色缸中，浸泡在洗滌液1中，室溫下輕輕地放下、提起芯片15 下；將芯片轉移到盛有洗滌液2的染色皿中，室溫下輕輕地放入、提起芯片15下；c.移出染色缸。用去離子水徹底沖洗，沖洗次數(shù)不少于2次；用離心法(200Xg for 10s)干燥芯片。(4)掃描a.將一片樣本放入掃描儀中，通過專用掃描儀軟件將光電倍增管強度調整至 Cy3/PMT600, PowerlOO,點擊啟動按鈕，開始粗掃樣本，得到掃描圖片如圖4所示；b.細掃信號最佳的2個5X4蛋白陣列、2個5X4DNA陣列。讀取Cy3背景信號中 值、點信號中值及SD值讀數(shù)，并計算其差異系數(shù)CV值和信噪比S/N值，如表1所示；c.結束掃描，取出樣本。本實施例在點樣的過程中同時放入普通氨基片、醛基片、瓊脂糖片以及 ThemoFisher環(huán)氧基片作為對比。表1環(huán)氧基片掃描數(shù)據(jù)DNA 探針 蛋白探針
權利要求
一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，包括(1)高硼硅玻璃片表面處理將超聲處理過的高硼硅玻璃片浸泡在體積比為4∶1∶20的濃硫酸、過氧化氫和超純水的混合液中，80～130℃下放置15～30分鐘，冷卻、超純水洗沖洗后浸泡于體積比為1∶1的濃鹽酸和乙醇混合溶液中3～24小時，超純水清洗3～5次，110～140℃烘干15～30分鐘；(2)環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液的配制配制含1～3vol％GPTMS、1～3vol％冰醋酸的無水乙醇或異丙醇溶液，磁力攪拌，升溫至60～80℃，回流1～2小時，降至室溫，整個過程在避光條件下進行；(3)調節(jié)上述硅烷偶聯(lián)劑溶液的pH＝7，磁力攪拌3～5分鐘；迅速加入經表面過處理后的高硼硅玻璃片，在25～30℃，相對濕度為30～50％恒溫恒濕箱中放置2～24小時，取出后先用無水乙醇清洗，然后再用超純水沖洗，110～140℃烘干15～30分鐘，即得環(huán)氧基修飾的生物芯片基片。
2.根據(jù)權利要求1所述一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，其特征在于 所述步驟(1)中的高硼硅玻璃片外形尺寸為25. Omm士0.2mmX75. 6mm士0.2mm、厚度為 1. Omm士0. 02mmo
3.根據(jù)權利要求1所述一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，其特征在于所 述步驟(1)中的超聲是在超純水中超聲5 10分鐘。
4.根據(jù)權利要求1所述一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，其特征在于所 述步驟⑵中環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液的配制取99. 8%無水乙醇77. 6ml, GPTMS2. 4ml，冰 醋酸2. 4ml加入到三口燒瓶中，用油浴加熱到60°C，在磁力攪拌下回流2小時，然后降至室
5.根據(jù)權利要求1所述一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，其特征在于所 述步驟(2)中環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液的配制取lmlGPTMS，98ml異丙醇，Iml醋酸加入到三 口燒瓶中，用油浴加熱到80°C，在磁力攪拌下回流1小時，然后降至室溫。
6.根據(jù)權利要求1所述一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，其特征在于所 述步驟(3)中使用濃氨水調節(jié)硅烷偶聯(lián)劑溶液的pH。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，包括(1)將超聲處理過的高硼硅玻璃片浸泡在濃硫酸、過氧化氫和超純水的混合液中，80～130℃下放置15～30分鐘，冷卻、沖洗后浸泡于濃鹽酸和乙醇混合溶液中，清洗，烘干；(2)配制含GPTMS、冰醋酸的無水乙醇或異丙醇溶液，磁力攪拌，升溫至60～80℃，回流；(3)調節(jié)硅烷偶聯(lián)劑溶液的pH＝7，攪拌；迅速加入經表面過處理后的高硼硅玻璃片，放置，清洗，烘干。本發(fā)明的方法簡單，成本低，適合于工業(yè)化生產；所得基片背景低、表面均一、點樣點比較規(guī)整、結合力強，大大提高了固定效率，它具有較高荷載和結合蛋白質分子的能力，是一類較新的蛋白質微陣列載體。
文檔編號C12Q1/68GK101880712SQ201010167800
公開日2010年11月10日 申請日期2010年5月6日 優(yōu)先權日2010年5月6日
發(fā)明者張青紅, 李耀剛, 王宏志, 馬董云 申請人:東華大學