專利名稱：一種高效分解合成染料的真菌及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于環(huán)境保護、防治污染技術領域，具體涉及使用微生物法高效降合成染 料方法及其用途。
背景技術：
1、染料污染的特點合成染料是印染工業(yè)廢水中常見的水體污染物，組分復雜、濃度高(COD為1000 10萬mg/L)、色度深(500 50萬倍)。廢水中的有機組分大多以芳烴及雜環(huán)化合物為母體， 并帶有顯色基團(如-N = N-、-N = 0)及極性基團(如-S03Na、-0H、-NH2)。廢水中還含有 較多的原料和副產(chǎn)品，如鹵化物、硝基物、苯胺、酚類等，以及無機鹽如NaCl、Na2S04、Na2S，還 有如蒽醌染料、偶氮染料、三芳基甲烷染料、酞菁染料等，這些染料大多數(shù)是具有毒性、致突 變、致癌的。2、染料廢水的脫色方法物理化學方法和生物方法都可以用于染料廢水的脫色處理，如絮凝沉淀、吸附、離 子交換、超濾、滲析、化學氧化、光氧化、電解及生物處理方法。目前工業(yè)上常用的方法有絮 凝沉淀(氣浮)、電解、吸附、生物降解、離子交換、膜過濾臭氧化等方法，染料廢水的處理難 點一是COD高，而B0D/C0D值較小，可生化性差；二是色度高，且組分復雜。COD的去除與脫 色有相關性，但脫色問題困難更大。然而由于這些方法大多數(shù)存在成本高、耗時長等問題， 沒有被廣泛地應用。目前，許多研究開始集中到具有高效脫色與分解染料的微生物方面。本菌種分離于海南省吊羅山熱帶雨林地區(qū)，我們研究了 Cladosporium CladOSpOriOidesTXJ13021對不同的化學合成染料如橙黃G、甲基橙、茜素紅、孔雀石綠等 的脫色能力。目前還沒有關于Cladosporium cladosporioides TXJ13021能降解上述染料 的報道，我們利用真菌Cladosporium cladosporioides TXJ13021重點對茜素紅與甲基橙 色兩種染料進行了降解分析，研究PH值，碳源、氮源對脫色的影響，找出該菌的最優(yōu)脫色條 件，期望使用這種真菌來降解含有茜素紅或甲基橙和其他有關結構染料的工業(yè)廢水。

發(fā)明內容
本發(fā)明的針對現(xiàn)有有關染料污染及毒害防治技術的不足，采用微生物法處理降解 化學合成染料的污染，有效保護環(huán)境，是一項清潔工程。此外還可以為環(huán)境保護相關研究者 提供參考。1、本發(fā)明獲得一株能高效降解染料的微牛物菌種，該微牛物為枝孢樣枝孢霉，拉 丁名Cladosporium cladosporioides TXJ13021，分離于海南省吊羅山熱帶雨林地區(qū)，保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2007年3月，保藏號為 CGMCC No. 1987。2、本發(fā)明優(yōu)化出培養(yǎng)枝孢樣枝孢霉，Cladosporium cladosporioides TXJ13021 最優(yōu)條件和方法。其中條件包括
(1)最適宜的培養(yǎng)基配方，碳氮比為5 1 25 1 ；碳源最佳為蔗糖，其次為葡 萄糖，淀粉，濃度為1 10% ；氮源可以是硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、尿素1 10%。(2)最適宜的培養(yǎng)溫度為28°C -32°C。(3)菌體培養(yǎng)最適pH值為pH4. 0-pH6. 0。(4)培養(yǎng)培養(yǎng)方法為“兩級菌體發(fā)酵培養(yǎng)”。一級菌體發(fā)酵培養(yǎng)“種子”，按上述培 養(yǎng)基配方生產(chǎn)大量能進行色素降解活菌體；二級菌體發(fā)酵培養(yǎng)，實質為菌體進一步擴大培 養(yǎng)，同時兼顧染料降解脫色。在一個具體的實施方案中，用土豆汁葡萄糖液體培養(yǎng)基(每1000mL培養(yǎng)基含200g 土豆的浸出液、20g葡萄糖)，獲得一級發(fā)酵的菌體(菌膜)，在將菌膜處理化學合成色素茜 素紅和甲基橙，二者在此條件下脫色率均達到90%以上。3、本發(fā)明提供一系列枝孢樣枝孢霉Cladosoorium cladosporioides TXJ13021 降 解不同染料色素的條件和方法。即“菌體發(fā)酵、染料降解兩步法”。其中第一步為菌體發(fā)酵 純培養(yǎng)，按上述培養(yǎng)菌體方法生產(chǎn)大量能進行色素降解活菌體；第二步為菌體染料降解脫 色，同時兼顧菌體擴大培養(yǎng)。在一個具體的實施方案中，首先將該枝孢樣枝孢霉CladosDorium CladOSporioidesTXJ13021接種于裝有土豆汁葡萄糖液體培養(yǎng)基的平板中，培養(yǎng)出菌膜，利 用菌膜針對該菌的PH值、碳源及其濃度、氮源及其濃度進行單因素試驗，測出其最優(yōu)的培 養(yǎng)條件，結果顯示，經(jīng)過96h的培養(yǎng)，對于茜素紅，當pH值為3，以蔗糖為碳源(5g/L)，硝酸 銨為氮源(0. 2g/L)時，脫色效果達到最佳狀態(tài)，脫色率達到90%以上。在另一個具體的方案中，當pH值為9，以蔗糖為碳源(7g/L)，尿素為氮源(0. 8g/L) 時，對于甲基橙脫色效果達到最佳，脫色率達到90%以上。技術效果本發(fā)明的優(yōu)點及效果本發(fā)明真菌對蒽醌、三苯基甲烷及偶氮類染料有很好的降 解效果，尤其對偶氮染料甲基橙可以在堿性條件下達到很好的脫色效果，這是很多真菌所 不具備的。由于含有偶氮染料的工業(yè)廢水很多都是堿性的，所以使用此種真菌降解具有很 大的優(yōu)越性，不僅可以為工業(yè)生產(chǎn)節(jié)約降低廢水PH值所耗費的時間，而且可以減少工業(yè)成 本，具有很高的應用價值。具體實施實例 實施例1 枝孢樣枝孢霉的篩選從各地采集土壤樣品，采用不同的培養(yǎng)基進行篩選，篩選到多個菌株，逐一進行降 解染料實驗，得到降解染料菌株，進行菌種簽定。實施例2 枝孢樣枝孢霉的保藏保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2007年3 月，保藏號為CGMCC No. 1987。實施例3 枝孢樣枝孢霉的培養(yǎng)和降解染料的條件優(yōu)化菌種培養(yǎng)按200g/L 土豆浸出液、20g/L葡萄糖的比例配制液體土豆培養(yǎng)基，并在 121°C、0. IMPa條件下滅菌25min。取滅菌培養(yǎng)皿，向每個培養(yǎng)皿中無菌操作加入液體土豆 培養(yǎng)基10mL。待培養(yǎng)基冷卻到室溫，將分離的Cladosporium cladosporioides TXJ13021 菌種接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)6 7d，形成菌膜后以備隨后實驗使用。
降解所選用的染料實驗選用常用染料如甲基橙(特征波長476nm)、甲基紅(特 征波長430nm)、孔雀石綠(特征波長617nm)、結晶紫(特征波長583nm)、苯胺藍(特征波 長585nm)、茜素紅(特征波長420nm)、橙黃G(特征波長478nm)等，進行廣譜降解試驗， 所用培養(yǎng)基為染料-Kirk液體培養(yǎng)基(組成(g/L)葡萄糖，5;酒石酸銨，0.22 ；KH2P04, 0. 2 ；MgS04 7H20，0. 05 ；CaCl2，0. 01 ；維生素 Bl，lmg/L ； 10mg/L 的 10 % 吐溫 80 ； 10mL/L lOOmM 藜蘆醇；10mg/L 微量元素溶液(g/L :CuS04，0. 08 ;H2Mo04，0. 05 ；MnS04 4H20，0. 07 ； ZnS04 7H20，0. 043 ；Fe2 (S04) 3,0. 05))，染料濃度為100mg/L，將菌膜接種于該培養(yǎng)基中進行 為期5天的觀察，結果表明，該菌能夠分解甲基橙、甲基紅、孔雀石綠、茜素紅、橙黃G，5天的 降解率均超過85%，而對結晶紫、苯胺藍具較弱降解僅達到30%左右。脫色率(％) = [ (A0-At) /A0] X 100 %At為時間t時染料的吸光值，A0染料降解前的初始吸光值。降解條件的優(yōu)化A_pH值、B-碳源、C-氮源A-pH值對脫色效果的影響取五只250mL的錐形瓶，分別標記為A、B、C、D、E、F。 向五只錐形瓶中分別量取lOOmL濃度為0. lg/L的茜素紅-Kirk培養(yǎng)基，并用0. lmol/LHCl/ NaOH進行調節(jié)，使其pH值依次為1、3、5、7、9、11。另取五只250mL的錐形瓶，分別標記為a、 b、c、d、e。向五只錐形瓶中分別量取100mL的0. lg/L甲基橙-Kirk培養(yǎng)基，并用0. lmol/ L HCl/NaOH進行調節(jié)，使其pH值依次為1、3、5、7、9、11。將培養(yǎng)好的菌膜接種到各組錐形 瓶中，恒溫培養(yǎng)96h，取各組溶液進行過濾，測出各組濾液的吸光值；得出在不同pH值的情 況下，各組的脫色率如表一所示表一 pH對茜素紅和甲基橙脫色的影響 B-不同碳源對脫色效果的影響分別取十二只250mL的錐形瓶，分別標記為▲ A2 A3>B1 B2 B3、Ci C2 C3、Di D2 D3。以蔗糖，果糖，麥芽糖等量取代Kirk培養(yǎng)基中的葡萄糖配制 0. lg/L茜素紅-Kirk培養(yǎng)基。用0. lmol/L HCl/NaOH調節(jié)培養(yǎng)基，使其達到最優(yōu)pH 3。另 取十二只250mL錐形瓶，分別標記為洱E2 E3> F2 F3, G2 G3、氏H2 H3。以蔗糖，果糖， 麥芽糖等量取代Kirk培養(yǎng)基中的葡萄糖配制0. lg/L甲基橙-Kirk培養(yǎng)基，并用0. lmol/L HCL/NaOH調節(jié)培養(yǎng)基，使其達到最優(yōu)pH 9。向、 3，3，Q 3， 3錐形瓶中對應加入含 有葡萄糖，蔗糖，果糖，麥芽糖的茜素紅-Kirk培養(yǎng)基100mL ；向 3、& 3、& 3、氏 3錐形 瓶中對應加入含有葡萄糖，蔗糖，果糖，麥芽糖的甲基橙-Kirk培養(yǎng)基100mL。將分裝好的培 養(yǎng)基在121°C，0. 1MPA的條件下滅菌12 15min。待滅菌好的培養(yǎng)基冷卻到室溫，將培養(yǎng)好 的菌膜接種到各組錐形瓶中，恒溫培養(yǎng)96h后，取各瓶溶液過濾，測得各組脫色率如表二所 示表二不同碳源對茜素紅和甲基橙脫色的影響 B-碳源(蔗糖)濃度對脫色效果的影響取五只250mL的錐形瓶，分別標記為I\、T3、T5、T7、T9。配制0. lg/L茜素紅，蔗糖濃 度分別為 lg/L、3g/L、5g/L、7g/L、9g/L 的 Kirk 培養(yǎng)基，并用 0. lmol/L HCl/NaOH 進行調節(jié)， 使得培養(yǎng)基的PH值為3。6. 2另取五只250mL的錐形瓶，分別標記為C1,C3>C5,C7>C90配制 0. lg/L甲基橙，蔗糖濃度分別為lg/L、3g/L、5g/L、7g/L、9g/L的Kirk培養(yǎng)基，并用0. lmol/ L HCl/NaOH進行調節(jié)，使得培養(yǎng)基的pH值為9。分別量取100mL的各組培養(yǎng)基加到各組對 應的錐形瓶中，在121°C，0. IMPa條件下滅菌15min。冷卻后將菌膜接種到各組培養(yǎng)基中，恒 溫培養(yǎng)96h，取各組溶液進行過濾，測出各組的吸光值，得出不同碳源濃度下的脫色率如表 三所示表三不同蔗糖濃度下對茜素紅與甲基橙脫色的影響 C-不同氮源對脫色效果的影響取十五只250mL的錐形瓶，分別標記為 a2 a3、 b2 b3、Cl c2 c3、屯d2 d3、ei e2 e3。以蔗糖為碳源，并分別用硝酸銨，硫酸銨，蛋白胨，尿 素等量取代酒石酸銨為氮源配制0. lg/L茜素紅-Kirk培養(yǎng)基，用0. lmol/L HCl/NaOH調節(jié) 培養(yǎng)基，使其pH值為3。另取十五只250mL的錐形瓶，分別標記為f2 f3> gl g2 g3、h2 h3>m1 m2 m3、ni n2 n3。以蔗糖為碳源，并分別用硝酸銨，硫酸銨，蛋白胨，尿素等量取代酒石 酸銨為氮源配制0. lg/L甲基橙-Kirk培養(yǎng)基，并用0. lmol/L HCl/NaOH調節(jié)培養(yǎng)基，使其 pH值為9。向 3、分別對應加入含有酒石酸銨、硝酸銨、硫酸銨、 蛋白胨、尿素的茜素紅-Kirk培養(yǎng)基100mL ；向 3、gl 3、h卜3、分別對應加入 含有酒石酸銨、硝酸銨、硫酸銨、蛋白胨、尿素的甲基橙-Kirk培養(yǎng)基100mL。將分裝好的培 養(yǎng)基在121°C，0. IMPa條件下，滅菌12 15min。待滅菌好的培養(yǎng)基冷卻到室溫，將培養(yǎng)好 的菌膜接種到各組錐形瓶中，恒溫培養(yǎng)96h后，取各瓶溶液過濾，測得各組脫色率如表四所
不表四不同氮源對茜素紅和甲基橙脫色的影響 C-氮源(尿素)濃度對脫色效果的影響取五只250mL的錐形瓶，分別標記為Na(15、Nai、Na2、Na4、NQ.8。配制尿素濃度分 別為 0. Ig/L、0. 2g/L、0. 4g/L、0. 8g/L 的 0. lg/L 茜素紅-Kirk 培養(yǎng)基，并用 0. lmol/L HC1/ NaOH進行調節(jié)，使得培養(yǎng)基的PH值為3。另取7只250mL的錐形瓶，分別標記為nai、na2、 n0.4>n0.8>nL2,nL6,n2.0O 配制尿素濃度分別為 0. Ig/L、0. 2g/L、0. 4g/L、0. 8g/L 的 0. lg/L 甲 基橙-Kirk培養(yǎng)基，并用0. lmol/L HCl/NaOH進行調節(jié)，使得培養(yǎng)基的PH值為9。分別量取 100mL的各組培養(yǎng)基加到各組對應的錐形瓶中，封口 ；在121°C，0. IMPa滅菌25min。將菌膜 接種到各組培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)96h，取各組溶液進行過濾，測出各組的吸光值，得出不同氮 源濃度下的脫色率如表五所示表五不同尿素濃度對茜素紅和甲基橙脫色的影響 實施例4 從印染廠取廢水(色度約為50000倍，pH 9. 5) 200公斤，直接將預先培養(yǎng)好的 Cladosporiumcladosporioides TXJ13021 菌膜“種子液” 20L(干菌體含量 1% )倒入其 中，自然條件下處理15天，溫度20 35°C，脫色率為67%，色度降為8100倍。而沒有加 入Cladosporium cladosporioidesTXJ13021的對照組，脫色率僅為5%左右，色度僅降為 43000 倍。實施例5 從印染廠取廢水(色度約為50000倍，pH 9. 5)200公斤，直接將預先培養(yǎng)好的 Cladosporiumcladosporioides TXJ13021 菌膜“種子液” 80L (干菌體含量 1% )倒入其 中，自然條件下處理15天，溫度20 35 °C，脫色率為67%，色度降為2100倍。而沒有加 入Cladosporium cladosporioidesTXJ13021的對照組，脫色率僅為5%左右，色度僅降為 43000 倍。實施例6 從印染廠取廢水(色度約為50000倍，pH 9. 5) 200公斤，直接將預先培養(yǎng)好的 Cladosporiumcladosporioides TXJ13021 菌膜“種子液” 60L (干菌體含量 1% )倒入其 中，自然條件下處理15天，溫度20 35 °C，脫色率為67%，色度降為3500倍。而沒有加 入Cladosporium cladosporioidesTXJ13021的對照組，脫色率僅為5%左右，色度僅降為 43000 倍。實施例7 從印染廠取廢水(色度約為50000倍，pH 9. 5) 200公斤，直接將預先培養(yǎng)好的Cladosporiumcladosporioides TXJ13021 菌膜“種子液” 40L (干菌體含量 1% )倒入其 中，自然條件下處理15天，溫度20 35°C，脫色率為67%，色度降為4000倍。而沒有加 入Cladosporium cladosporioidesTXJ13021的對照組，脫色率僅為5%左右，色度僅降為 43000 倍。
權利要求
本發(fā)明獲得一株能高效降解染料的微生物菌種，該微生物為枝孢樣枝孢霉，拉丁名Cladosporium cladosporioides TXJ13021，分離于海南省吊羅山熱帶雨林地區(qū)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2007年3月，保藏號為CGMCC No.1987。
2.一種包含權利要求1所述枝孢樣枝孢霉的微生態(tài)染料降解菌劑。
3.權利要求2所述的微生態(tài)染料降解菌劑，其中還包括該菌株所代謝的產(chǎn)物。
4.權利要求1所述的芽孢桿菌或權利要求2或3所述的染料降解菌劑在生產(chǎn)加工中用 于染料降解的用途。
5.權利要求4所述的用途，其中用微生態(tài)染料降解菌劑與印染廢水適量混合工藝，自 然條件下處理，可降解染料，使其廢水色度顯著下降。
全文摘要
本發(fā)明的針對現(xiàn)有有關染料污染及毒害防治技術的不足，提供一整套微生物法防止染料污染環(huán)境的工程技術，從而有效降低蒽醌染料、偶氮染料、三芳基甲烷染料、酞菁等染料對環(huán)境的污染，有效保護環(huán)境，是一項清潔工程技術。
文檔編號C12R1/645GK101851586SQ20101016795
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月11日 優(yōu)先權日2010年5月11日
發(fā)明者何興兵, 何瑤慶, 林永慧, 田啟建, 肖竹平, 胡文勇, 陳亮 申請人:林永慧