專利名稱：甘藍型油菜粒重相關(guān)基因的特異分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于油菜分子育種和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及甘藍型油菜粒重相關(guān)基岡的 發(fā)現(xiàn)、克隆和鑒定，以及相關(guān)基因的特異分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甘藍型油菜(Brassica napus L.，以下簡稱油菜)是世界上最重要的油料作物之 一。油菜的種子不僅是油和蛋白質(zhì)的儲藏器官，同時也是植物生命周期延續(xù)的器官。種子大 小或重量是非常重要的經(jīng)濟性狀。首先粒重是構(gòu)成植物單株產(chǎn)量的三大因素之一(單株有 效角果數(shù)、每角果粒數(shù)、粒重)，因此也決定著產(chǎn)量(Clarke and Simpson, 1978 ；Butruille et al. ,1999 ；Shi et al. ,2009)；其次，種子大小也與含油量和蛋白質(zhì)含量有關(guān)系(Morgan et al. ,1998 ；Lionneton et al. ,2004)；再次，大種子通常在萌發(fā)過程中有更好的適應(yīng)性。 因此，弄清種子大小或重量形成的遺傳基礎(chǔ)，對油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的改良十分重要。此外，從 進化的角度來看，弄清種子大小的變化也有著非常重要的意義。盡管油菜的種子大小非常重要，但目前對其遺傳控制仍缺乏深入的了解。和 其它產(chǎn)量相關(guān)性狀相比，粒重的遺傳力較高(Liu et al. ,1987 ；Qi et al. ,2004 ；Shi et al.，2009)。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，目前也定位了一些油菜粒重的數(shù)量性狀位點 (Quantitative Trait Loci，QTL)。Quijada et al. (2006)利用四個群體的二年二點試驗 定位了三個與粒重有關(guān)的QTLs (位于N7，N17和附9)，但在不同群體間沒有相同的QTL存 在；Udall et al. (2006)分別在 Hua Double Haploid(DH)群體、SYN DH群體和測交群體等 三個不同群體間分別檢測到6個、4個和5個粒重有關(guān)的QTLs，只有一個位于N14上的QTL 能在不同群體和不同環(huán)境間穩(wěn)定檢測到；最近，Shi et al. (2009)利用油菜的二個群體在 10個不同環(huán)境下一共檢測到159個粒重QTLs，這些QTLs分布在除了 Cl以外的其它所有染 色體上。利用模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)，在過去的十多年中利用突變體 分析等手段，對種子大小的分子調(diào)控機理進行了研究。Alonson-Blanco et al. , (1999) 定位了 11個和種子大小有關(guān)的QTLs，第一次揭示了這個性狀在不同材料間的遺傳復(fù) 雜性。最近，對大量突變體的分析，進一步闡明了許多決定種子大小的分子機理。例如 TTG2 (Transparent Testa Glabrous 2)基因突變體，影響種皮中的類黃酮素的積累，通常 會減少粒重(Debeaujon et al.，2000，2003)。而AP2 (APETELA2)或者ARF2 (Auxin Response Factor 2)等轉(zhuǎn)錄因子的突變可使種子變大(Jofuku et al. ,2005 ；Ohto et al. ,2005 ； Schruff et al. ,2005) Luo et al. (2005)鑒定 了二個小種子突變體 IKU2 (HAIKU2)和 MINI3 (MINISEED3)，并首次提出種子大小遺傳控制的可能代謝途徑。鑒于油菜和擬南芥非 常相近的同源關(guān)系，預(yù)期可以利用擬南芥的信息，從油菜基因組中獲得有關(guān)控制種子大小 的同源基因。目前在油菜中未見對粒重有關(guān)基因的克隆和分析的報道。鑒于粒重性狀的重要 性，對油菜中粒重有關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)、克隆和鑒定，以及基因特異分子標(biāo)記的開發(fā)對促進油菜產(chǎn)量和品質(zhì)育種是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供甘藍型油菜粒重相關(guān)基R MINI3和TTG2及上述2個基因特 異的分子標(biāo)記，并將其用于油菜粒重性狀的選育封面。這些分子標(biāo)記及方法可為甘藍型油 菜粒重育種提供新的手段，從而加速甘藍型油菜粒重性狀的改良進程，提高甘藍型油菜育 種的準(zhǔn)確性和選擇效率。本發(fā)明是通過以下方案實現(xiàn)的。a)甘藍型油菜甲A254(大粒純系，該材料的種子已于2009年11月20日送交湖 北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO P200909)與甘藍型油菜甲A177(小粒純系，該材料的種子已于2009年11月20日送交湖 北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO P200908)雜交，得到Fl ；b)由雜種Fl的花蕾通過小孢子培養(yǎng)(余風(fēng)群等，1997)獲得分離的雙單倍體系 (DH系)群體；C)對DH系群體的每一個株系進行分子標(biāo)記分析，并對每個株系的基因型進行描 述；具體方法分離DH群體每一個系的基因組DNA，采用SSR引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物 在6% (100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5. 7克丙烯酰胺和0.3克甲叉-雙丙烯酰胺)的聚 丙烯酰胺凝膠上電泳分離，經(jīng)銀染、顯影后，獲得每個株系基因型；d)基于孟德爾和摩爾根遺傳連鎖和分離規(guī)律，用獲得的分子標(biāo)記信息構(gòu)建甘藍型 油菜遺傳連鎖圖。遺傳連鎖圖的構(gòu)建采用MAPMAKER 3.0 (Lincoln et al. , 1992)軟件進 行；e)測定DH群體每個系的成熟種子的千粒重數(shù)值；f)將DH群體每個株系的千粒重與甘藍型油菜遺傳連鎖圖中的分子標(biāo)記進行連鎖 和QTL分析，QTL檢測采用QTL Cartographer V2. 0 (Wang et al. ,2007)軟件中的復(fù)合區(qū)間 作圖法(CIM)進行，以2.0為LOD閾值，大于2.0說明存在一個QTL位點。得到和粒重有關(guān) 的 QTL 位點=TSffU TSW2、TSW5a、TSW5b、TSW5c、TSW7a、TSW7b、TSfflO 和 TSW14 等 9 個 QTLs 位點，其中TSW7a和TSW7b是主效QTLs位點，一共能解釋所有粒重變異的27. 64-37. 90%。g)在擬南芥中，MINI3和TTG2是已經(jīng)被證明控制種子大小和粒重的重要基因。通 過搜尋 NCBI 核苷酸數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nucleotide/)，找到了二個分 別和擬南芥MINI3和TTG2基因序列高度同源的白菜BAC克隆AC189531和AC232555，根 據(jù)基因序列信息，設(shè)計了二對擴增基因全長的引物MINI3F/R和TTG2F/R。從甘藍型油菜甲 A254和甘藍型油菜甲A177中分別擴增出這二個基因的基因組片段，克隆，測序。經(jīng)過仔細 驗證后，基于二個親本基因組核苷酸序列的不同，開發(fā)了 MINI3基因的一個CAPs標(biāo)記(Pst I酶切)MINI3a和TTG2基因的一個SNP標(biāo)記TTG2a，這二個標(biāo)記分別定位在上述DH群體的 A5連鎖群上。MINI3a正好定位在檢測到的粒重QTL位點TSW5b的峰值處，能解釋千粒重變 異的7%。TTG2a離檢測到的另一個粒重QTL位點TSW5c的QTL峰值處5cM并處在其置信 區(qū)間內(nèi)，能解釋千粒重變異的7%，TSW5c是相鄰于TSW5b并表現(xiàn)出相似的加性效應(yīng)。因此 可以認為MINI3基因即為QTL位點TSW5b的候選基因；TTG2基因為QTL位點TSW5c的候選基因。MINI3a和TTG2a是控制千粒重的基因MINI3和TTG2的基因特異性分子標(biāo)記；h)利用TSW7a、TSW7b、TTG2a和MINI3a對DH系的基因型進行分析，同時存在上述 四個標(biāo)記帶紋均和甘藍型油菜甲A254 —致的為大粒材料；相反同時存在上述四個標(biāo)記帶 紋均和甘藍型油菜甲A177 —致的為小粒材料。在上述方法中，所用分子標(biāo)記引物對的核苷酸序列如下所示引物對(1)，編號為MINI3F/R:正向引物5' -ATGAATGCTTTTGATGGAACCTAC-3‘，反向引物5' -CTAAAGGTTGAGACCAAAGTTGAGA-3‘。引物對(2)編號為TTG2F/R 正向引物5' -ATGGATGTGAAAGAGAGTGAAAGAA-3‘，反向引物5' -TTAAATGGCTTGATTAGAATGTTGTG-3‘。引物對(3)編號為MINI3a 正向引物5' -AGACCATAACAATCACCGAACC-3‘，反向引物5' -ACACGATCAATCTCTGGTTCATT-3‘。引物對(4)編號為TTG2a 正向引物5' -CCGCGGGTGATTCATCTAAG-3‘，反向引物5' -GGAAGCTAAAAAATAAAGAGTTAAA-3‘。其中，引物對MINI3F/R擴增序列表中SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的核苷酸序 列，為甘藍型油菜甲A177和甲A254的MINI3基因的A基因組核苷酸序列；引物對TTG2F/ R擴增序列表中SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6的核苷酸序列，為甘藍型油菜甲A177和甘藍 型油菜甲A254的TTG2基因的A基因組核苷酸序列；MINI3a為CAPs標(biāo)記，是根據(jù)MINI3F/ R擴增出的甘藍型油菜甲A177和甘藍型油菜甲A254的MINI3基因A基因組的核苷酸序列 的差異位點設(shè)計的引物，引物對MINI3a擴增序列表中SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的核苷 酸序列，用Mmi3a引物對進行PCR擴增后，利用Pst I酶進行酶切，如果能夠被酶切的判定 為與甘藍型油菜甲A177 —致的基因型，如果不能夠被酶切的判定為與甘藍型油菜甲A254 一致的基因型(見圖1)，即定為MINI3基因A基因組的分子標(biāo)記；TTG2a為SNP標(biāo)記，是根 據(jù)TTG2F/R擴增出的甘藍型油菜甲A177和甘藍型油菜甲A254的TTG2基因A基因組的核 苷酸序列的差異位點設(shè)計的引物，利用引物對TTG2a擴增序列表中SEQ ID NO :7的核苷酸 序列，能夠進行PCR擴增有帶紋出現(xiàn)的為和甲A254 —致的基因型，不能夠進行PCR擴增的 為和甲A177 —致的基因型(圖1)。即為TTG2基岡A基因組的分子標(biāo)記。在上述制備方法中，步驟a)至步驟f)的方法與申請人華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的在先專利 申請(專利申請?zhí)枮?01010120725.6，申請日為2010年3月10日)的制備步驟相同。從 步驟g)至h)的方法是本發(fā)明的附加特有步驟(即，區(qū)別技術(shù)特征)。本發(fā)明的積極效果本發(fā)明成功得到和千粒重性狀相關(guān)基因TTG2和MINI3的基因特異性分子標(biāo)記，運 用這些標(biāo)記可分離、鑒別、克隆千粒重相關(guān)基因，從而可以克服傳統(tǒng)育種中依靠表型進行選 擇的缺點。利用本發(fā)明制備的分子標(biāo)記可進行油菜粒重性狀的分子標(biāo)記輔助選擇，可以明 顯減少育種工作量，縮短育種年限，加快油菜育種的進程。


序列表SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2是本發(fā)明分離克隆的MINI3基因的核苷酸序 列。SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4是本發(fā)明制備的分子標(biāo)記MINI3a的核苷酸序列。SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6是本發(fā)明分離克隆的TTG2基因的核苷酸序列。SEQ ID NO 7是本發(fā)明制備的分子標(biāo)記TTG2a的核苷酸序列。SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9是擴增MINI3基岡的引物對MINI3F/R的核苷酸序 列。SEQ ID N0:10和SEQ ID NO :11是擴增TTG2基因的引物對TTG2F/R的核苷酸序 列。SEQ ID N0:12和SEQ ID NO :13是擴增MINI3基因的分子標(biāo)記MINi3a的引物對 的核苷酸序列。SEQ ID N0:14和SEQ ID NO :15是擴增TTG2基因的分子標(biāo)記TTG2a的引物對的 核苷酸序列。圖1 是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2 是利用引物對MINI3a、TTG2a在甘藍型油菜甲A254和甘藍型油菜甲A177及 其Fl的基因組DNA中的擴增結(jié)果。圖中MINI3a引物對的PCR擴增產(chǎn)物的Pst I酶切產(chǎn)物 和TTG2a引物對的PCR擴增產(chǎn)物是在2%瓊脂糖凝膠(每IOOml的TAE buffer中含2g的 Agarose)上電泳分離的圖片。圖3 是利用引物對MINI3F/R在甘藍型油菜純系甲A177和甲A254的基因組DNA 中擴增出的核苷酸序列比對結(jié)果。圖中下劃線位置為引物對Mmi3a的結(jié)合位點，箭頭所示 的位點為序列的第1751位點的核苷酸突變，從而造成了 Pst I酶的酶切位點的突變。利用 引物對MINI3a在甘藍型油菜純系甲A177和甲A254的基因組DNA中PCR擴增的產(chǎn)物，甲 A177的能進行Pst I酶切，而甲A254的不能進行Pst I酶切。圖4 是利用引物對TTG2F/R在甘藍型油菜純系甲A177和甲A254的基因組DNA中 擴增出的核苷酸序列比對結(jié)果。圖中下劃線位置為引物對TTG2a的結(jié)合位點，三角形表示 序列的第223位的6個核苷酸的插入突變和第461位的6個核苷酸的插入突變，從而利用 這二個插入突變位點設(shè)計了 TTG2a的引物對。利用引物對TTG2a在甘藍型油菜純系甲A177 和甲A254的基因組DNA中進行擴增，甲A254能進行PCR擴增，而甲A177不能進行PCR擴
+飽
+曰ο圖5 是DH群體A5染色體的遺傳連鎖圖和粒重QTLs的定位結(jié)果。圖中為檢 測到的QTLs位點，A5染色體上從上往下依次為TSW5a、TSW5b和TSW5c。其中 ‘，’為QTL 峰值所在位置；|}，，為QTL的置信區(qū)間。
具體實施例方式實施例1 甘藍型油菜中粒重QTLs的定位(1)甘藍型油菜粒重定位群體甲A254/甲A177的DH群體的構(gòu)建及田間試驗和千 粒重分析
采用以甘藍型油菜甲A254(大粒純系，該材料的種子已于2009年11月20日送 交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO :P200909)為母本、以甘藍型油菜甲A177(小粒純系，該材料的種子已于2009年11月 20日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為 CCTCC NO :P200908)為父本進行雜交得到Fl，對Fl的花蕾進行小孢子培養(yǎng)得到DH分離群 體。一共得到238個系的DH系，隨機選取190個系用于全基因組的遺傳連鎖圖的構(gòu)建和粒 重QTL的定位。DH系和其親本、Fl種植于2007-2008年度和2008-2009年度的二個連續(xù)的年份，
田間試驗采取完全隨機區(qū)組設(shè)計，三次重復(fù)，每一個系種二行，每行11-12個單株，株距平 均24cm左右，行間距30cm。所有材料種植于武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜試驗田，為冬油菜種植
環(huán)境。田間管理按一般育種大田管理。每年5月份從田間收割回成熟的試驗材料，從自由授粉的單株上脫下種子，清理 掉雜質(zhì)和不飽滿的種子，至少放置4周以上，在空氣中自然干燥。每個單株隨機取500粒飽 滿種子，三次重復(fù)，單株內(nèi)誤差不超過0. Ig,超過后放回混勻再取，然后算取平均值折算成 千粒重(1000粒種子的重量)數(shù)值，親本、Fl和DH每個系取10-15個單株，算取平均值為 其千粒重值(相關(guān)數(shù)據(jù)見表1)。(2) DH群體的遺傳連鎖圖構(gòu)建和粒重QTL分析選取在二個親本間具有擴增多態(tài)性的SSR引物對190個DH系根據(jù)已有方法 (Plieske and Struss,2001 ；Suwabe et al.，2002 ；Lowe et al.，2004 ；Chen et al.，2009) 進行分析。分離每個DH系的基因組DNA，采用上述篩選得到的有多態(tài)性的SSR引物進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物在6% (100ml聚丙烯酰胺溶液中含有5. 7克丙烯酰胺和0. 3克甲叉-雙丙 烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，經(jīng)銀染、顯影后，獲得每個株系基因型和群體的分 子標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)，將獲得的群體基因型數(shù)據(jù)構(gòu)建甘藍型油菜遺傳連鎖圖。遺傳連鎖圖的 構(gòu)建采用MAPMAKER 3.0 (Lincoln et al.，1992)軟件進行，連鎖群劃分的參數(shù)設(shè)置為LOD 值為9. 0，最大距離為30cM，每一個連鎖群的確定利用order，try和ripple等命令。作圖 群體中連鎖群中的共同標(biāo)記和鉚定標(biāo)記來自Parkin et al. (1995)，Lowe et al. (2004)， Piquemal et al. (2005)，Qiu et al. (2006)and Chen et al. (2009)等文章中的信息，二 個位點間的遺傳距離的計算采用“Kosambi”參數(shù)。將DH群體每個株系的千粒重數(shù)據(jù)與甘藍型油菜遺傳連鎖圖中的分子標(biāo)記進行連 鎖和QTL分析，QTL的檢測采用QTL Cartographer V2. 0 (Wang et al. ,2007)軟件中的復(fù) 合區(qū)間作圖法(CIM)進行，QTL檢測前，其參數(shù)設(shè)定為選擇“forward-backward stepwise regression”模式，檢測間隔的窗口大小選擇10cM，參數(shù)設(shè)定為模式6 :Pin = 0. 05,Pout = 0. 05，檢測時，LOD值默認為2. 0，QTL的置信區(qū)間的確定以在峰值所在的L0D-1所包含的峰 值二端所對應(yīng)在遺傳連鎖圖上的位置。置信區(qū)間有重疊部分認為是在不同的環(huán)境和群體間 有相似位置的QTL。在二年的試驗中，一共在6條染色體上(Al，A2，A5，A7，AlO和C4)檢測到9個千 粒重的QTLs，這些QTLs分別能解釋3. 66-20. 76%的表型變異(表2)。來自甲A254的等位 基因?qū)SW5a，TSW5b, TSW5c, TSfflO和TSW14起正向作用，對TSffl和TSW2起負向作用。實施例2 甘藍型油菜中千粒重性狀的基因特異性分子標(biāo)記的獲得
在擬南芥中，MINI3和TTG2基因已被證明是控制種子大小和粒重的重要基因。為 了探究在甘藍型油菜中利用粒重有關(guān)基因MINI3和TTG2的基因特異性標(biāo)記的可能性，設(shè) 計了分離甘藍型油菜中同源序列的實驗，通過搜尋NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/nucleotide/)，找到了二個分別和擬南芥MINI3和TTG2基因序列高度同源的 白菜BAC克隆AC189531和AC232555，而且這二個BAC克隆均定位在A5染色體上。根據(jù)基 因序列信息，設(shè)計了二對擴增基因全長的引物MINI3F/R和TTG2F/R。從DH群體的二個親 本甲A254和甲A177中擴增出這二個基因的基因組片段，克隆，測序。經(jīng)過仔細驗證后，基 于二個親本基因組核苷酸序列的不同開發(fā)了 TTG2基因的一個SNP標(biāo)記和MINI3基因的一 個CAPs標(biāo)記(分別命名為TTG2a和MINI3a)，這二個標(biāo)記分別定位在了 DH群體的A5連鎖 群上。MINI3a正好定位在了檢測到的粒重QTL位點TSW5b的峰值處，能解釋千粒重變異的 7%。TTG2a離檢測到的另一個粒重QTL位點TSW5c的QTL峰值處5cM并在其置信區(qū)間內(nèi)， 能解釋千粒重變異的7%。TSW5c是相鄰于TSW5b并表現(xiàn)出相似的加性效應(yīng)效應(yīng)。因此可 以認為MINI3基因即為QTL位點TSW5b的候選基因；TTG2基因為QTL位點TSW5c的候選基 因。TTG2a和MINI3a是控制千粒重的基因TTG2和MINI3的基因特異性分子標(biāo)記；實施例3 甘藍型油菜中千粒重性狀基因特異性分子標(biāo)記的有效性驗證(1)甘藍型油菜中千粒重性狀基因特異性分子標(biāo)記的驗證和A7上的二個位點相比，TTG2a和MINI3a位點對表型變異的貢獻較小，為了檢測 TTG2a和MINI3a位點對表型變異的遺傳效應(yīng)，以這二個位點的基因型對DH群體的系進行分 組并計算其千粒重的平均值，在DH群體的TTG2a和MINI3a 二個位點的每一個的二種基因 型上千粒重數(shù)值都有明顯的不同(表3)。(2)甘藍型油菜中粒重QTLs位點的組合效應(yīng)驗證 在DH群體中檢測粒重QTLs位點的組合效應(yīng)，DH群體的系以A5和A7上的QTLs的 基因型進行分組并比較其粒重的變化(表4)。由于A5上的三個QTLs緊密的連鎖在一起， 在DH群體中很少獲得重組系，則將A5上的三個位點簡化為一個位點用于基因型的分類。 從而三個位點在DH群體中應(yīng)有8中基因型的組合(表4)。從表4的數(shù)據(jù)可以得到一個結(jié) 論雖然A5上的QTLs位點效應(yīng)較小，但其對千粒重的貢獻不能被忽視，通過表4的數(shù)據(jù)可 以看出，第一組的千粒重數(shù)據(jù)(包含所有的三個正向加性等位基因)比其它所有組的數(shù)值 都要高。利用TSW7a、TSW7b、TTG2a和MINI3a對DH系的基因型進行分析，同時存在上述四 個標(biāo)記帶紋均和甲A254 —致的為大粒材料，帶有TTG2和MINI3基因的千粒重正向效應(yīng)；相 反同時存在上述四個標(biāo)記帶紋均和甲A177 —致的為小粒材料，帶有TTG2和MINI3基因的 千粒重負向效應(yīng)。通過檢查DH群體所有千粒重QTLs位點的基因型，第75#系擁有所有正向效應(yīng)的 QTLs位點，其在二年的表型值中都具有最大的千粒重數(shù)值(表5)。相反，第87#系擁有所 有反向效應(yīng)的QTLs位點，其在二年中都具有最小的千粒重數(shù)值。以上的結(jié)果說明可以利用這些標(biāo)記的信息用于粒重性狀的分子標(biāo)記輔助選擇，并 且應(yīng)用這些標(biāo)記對粒重的基因型選擇也是非常準(zhǔn)確的。表1 :DH群體的親本、Fl和分離群體的千粒重數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
一種與甘藍型油菜粒重相關(guān)的MINI3和TTG2的基因的特異性分子標(biāo)記MINI3a和TTG2a，其特征在于，所述分子標(biāo)記MINI3a的核苷酸序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示；所述分子標(biāo)記TTG2a的核苷酸序列如SEQ ID NO7所示。
2.一種分離的與甘藍型油菜粒重相關(guān)的基因MINI3，它是通過如下方法獲得的用甘 藍型油菜葉片分離的DNA，采用引物對MINI3F/R 5' -ATGAATGCTTTTGATGGAACCTAC-3‘和 5 ‘ -CTAAAGGTTGAGACCAAAGTTGAGA-3 ‘，從甘藍型油菜甲A177和甘藍型油菜甲A254中分別 擴增出這二個材料的基因組片段，克隆，測序，分別得到甘藍型油菜甲A177和甘藍型油菜 甲A254的MINI3基因序列，所述的MINI3基因的核苷酸序列分別如序列表SEQID NO :1和 SEQ ID NO 2 所示。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其中擴增MINI3基因的引物對MINI3F/R的核苷酸序列如 序列表 SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO 9 所示。
4.一種分離的與甘藍型油菜粒重相關(guān)的基因TTG2，它是通過如下方法獲得的用甘藍 型油菜葉片分離的DNA，采用引物對TTG2F/R 5' -ATGGATGTGAAAGAGAGTGAAAGAA-3‘和 5' -TTAAATGGCTTGATTAGAATGTTGTG-3 ‘，從甘藍型油菜甲A177和甘藍型油菜甲A254中分別擴 增出這二個材料的基因組片段，克隆，測序，分別得到甘藍型油菜甲A177和甘藍型油菜甲 A254的TTG2基因序列，所述TTG2基因的核苷酸序列分別如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6 所示。
5.如權(quán)利要求4所述的基因，其中擴增TTG2基因的引物對TTG2F/R的核苷酸序列如 SEQID NO 10 和 SEQ ID NO 11 所示。
6.擴增與甘藍型油菜粒重相關(guān)的MINI3基因的特異性分子標(biāo)記MINI3a的引物對，它的 核苷酸序列如SEQ ID NO 12禾口 SEQ ID NO 13所示。
7.擴增與甘藍型油菜粒重相關(guān)的TTG2的基因特異性分子標(biāo)記TTG2a的引物對，它的核 苷酸序列如SEQ IDNO 14和SEQ IDNO 15所示。
8.一種與甘藍型油菜粒重相關(guān)的MINI3和TTG2的基因特異性分子標(biāo)記的制備方法，其 步驟包括a)用甘藍型油菜甲A254為母本與甘藍型油菜甲A177為父本雜交，得到Fl；b)種植步驟a)的F1，從所述的Fl植株的花蕾中通過小孢子培養(yǎng)獲得分離的雙單倍體 (DH)群體；c)對步驟b)的DH群體中的每一個株系進行分子標(biāo)記分析，分離DH群體每一個株系的 基因組DNA，采用SSR引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用體積為6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分 離，經(jīng)銀染、顯影后，獲得每個株系的基因型；d)用步驟c)中獲得基因型構(gòu)建甘藍型油菜遺傳連鎖圖；e)測定步驟b)中的DH群體的每個株系的成熟種子的千粒重數(shù)值；f)將步驟e)中所述的千粒重數(shù)值與步驟d)中所述的甘藍型油菜遺傳連鎖圖中的分子 標(biāo)記進行連鎖和QTL分析，得到與粒重的QTL位點；其特征在于，步驟如下a)搜尋NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫，找到二個分別和擬南芥控制種子大小的相關(guān)基因MINI3和 TTG2基因序列高度同源的白菜BAC克隆AC189531和AC232555，根據(jù)AC189531和AC232555 的序列信息，設(shè)計二對擴增MINI3和TTG2基因全長的引物對MINI3F/R和TTG2F/R，其中MINI3F/R的核苷酸序列如SEQ ID NO 12和13所示；TTG2F/R的核苷酸序列如SEQ ID NO 14和15所示；從甘藍型油菜甲A177和甲A254中分別擴增出MINI3和TTG2基因的基因組 片段，克隆和測序；b)根據(jù)步驟g)中甘藍型油菜甲A177和甲A254基因組核苷酸序列的差異，分別設(shè)計 MINI3基因的CAPs標(biāo)記MINI3a和TTG2基因的SNP標(biāo)記TTG2a，其中所述的MINI3a的核苷 酸序列如SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13所示；所述的TTG2a的核苷酸序列如SEQID NO 14和SEQ ID NO 15所示；利用所述的分子標(biāo)記MINI3a和TTG2a，重復(fù)步驟c)的方法，獲 得每一個株系的基因型；重復(fù)步驟f)的連鎖分析方法，將所述的分子標(biāo)記MINI3a和TTG2a 分別定位在步驟b)的DH群體的A5連鎖群上；c)根據(jù)SEQID N0:12和SEQ ID NO :13所示的引物對進行PCR擴增，得到能夠區(qū)分 甘藍型油菜大粒種子與小粒種子的MINI3基因的特異性分子標(biāo)記MINI3a，所述的分子標(biāo)記 MINI3a的核苷酸序列分別如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示；其中能夠被Pst I酶切的 判定為小粒材料，不能被Pst I酶切的判定為大粒材料；根據(jù)SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15所示的引物對進行PCR擴增，得到能夠區(qū)分甘藍型油菜大粒種子與小粒種子的TTG2基因 的特異性分子標(biāo)記TTG2a，所述分子標(biāo)記TTG2a的核苷酸序列如SEQ ID NO :7所示；其中能 夠進行PCR擴增的判定為大粒材料，不能進行PCR擴增的判定為小粒材料。
9.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在甘藍型油菜粒重性狀標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2或4所述的基因在甘藍型油菜粒重性狀的遺傳改良中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求3或5所述的基因的引物對在甘藍型油菜粒重性狀標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求6或7所述的引物對在甘藍型油菜粒重性狀標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于油菜分子育種領(lǐng)域，涉及一種甘藍型油菜粒重相關(guān)基因MINI3和TTG2的特異性分子標(biāo)記的制備。以甘藍型油菜甲A254為母本與甘藍型油菜甲A177為父本雜交構(gòu)建雙單倍體群體(DH)，對該DH群體基因型和千粒重數(shù)據(jù)進行分析，獲得粒重性狀的QTLs位點。通過同源序列法克隆了甲A254和甲A177的MINI3和TTG2基因，根據(jù)序列差異位點設(shè)計MINI3和TTG2基因的特異分子標(biāo)記MINI3a和TTG2a，將分子標(biāo)記MINI3a和TTG2a定位在A5連鎖群的二個粒重QTLs位點上，進行了相關(guān)的驗證和應(yīng)用，證明本發(fā)明制備的分子標(biāo)記是一種新的遺傳標(biāo)記。所述的基因序列也是本發(fā)明首次獲得的。本發(fā)明為油菜粒重的分子育種提供了新的標(biāo)記，也為甘藍型油菜的千粒重性狀位點的候選基因克隆和標(biāo)記輔助選擇提供了有用的信息。
文檔編號C12N15/29GK101962640SQ20101016904
公開日2011年2月2日 申請日期2010年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月4日
發(fā)明者傅廷棟, 周永明, 范楚川, 蔡光勤 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)