專利名稱：一種以肝癌相關(guān)基因dlk1為靶點的核糖核酸及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及肝癌相關(guān)基因DLK1、以其mRNA序列為靶點的一組siRNA、及其在制備診斷肝癌試劑、制備基因治療肝癌的藥物 中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前我國有慢性肝炎患者約1200萬例，每年死于肝病約30萬，其50%為原發(fā)性肝 癌，約占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%左右。絕大多數(shù)與HBV、HCV感染有關(guān)。肝癌發(fā)病率在 我國居2-3位，主要在青壯年男性發(fā)病，在華東地區(qū)的發(fā)病率明顯高于其他地區(qū)，近年來， 有持續(xù)上升趨勢。在上海，肝癌的發(fā)病率居第三位，僅次于肺癌和胃癌。最新資料顯示這個 比例還有繼續(xù)上升的趨勢?，F(xiàn)在，肝癌，特別是肝炎病毒引起的肝癌已經(jīng)嚴(yán)重危害了我國人 民生命安全。因此，非常有必要對肝癌發(fā)生的分子機制作深入的研究。隨著人類基因組測序的完成，基因組學(xué)的研究重點已經(jīng)轉(zhuǎn)移到以解析基因功能為 主的功能基因組學(xué)研究。功能基因組學(xué)的重點是以疾病為中心，全力解決人類疾病相關(guān)基 因研究中的重大科學(xué)問題。肝癌在我國素有“國病”之稱，經(jīng)過半個世紀(jì)的探索，對于肝癌 的早期診斷和治療雖然有了一定的認(rèn)識，但肝癌預(yù)后仍然很差，特別是對其發(fā)病機制的了 解及治療藥物的新靶點方面，更是知之甚少。因此，尋找與腫瘤相關(guān)的基因，特別是尋找新 的抑癌基因是近年來腫瘤研究的熱點。DLKl基因定位于染色體14q32上。DLKl是在胞外 區(qū)域包含6個EGF樣重復(fù)序列的糖基化Delta樣跨膜蛋白。DLKl首先是在脂肪前體細(xì)胞 中發(fā)發(fā)現(xiàn)，與脂肪細(xì)胞的分化緊密相關(guān)。DLKl基因具有抑制脂肪前體細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化 的功能。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)DLKl在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株等腫瘤細(xì)胞中 存在表達(dá)，表明DLKl基因可能與腫瘤發(fā)生相關(guān)；同時在老鼠的胎肝細(xì)胞和膽汁淤積引起的 肝纖維化細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)DLKl的表達(dá)。在我們的前期肝癌及癌旁表達(dá)譜分析的研究中，發(fā)現(xiàn) DLKl基因在肝癌中的表達(dá)較癌旁組織中明顯增加，提示DLKl基因可能對肝癌的發(fā)生相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種肝癌相關(guān)基因DLKl的mRNA序列，蓋基因定 位在人染色體14q32上，可用于制備治療原發(fā)性肝癌的RNA干擾藥物。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供肝癌相關(guān)基因DLKl的mRNA序列。本發(fā)明還提供一種表達(dá)載體，含有所述以DLKl上mRNA為靶點的siRNA序列。本發(fā)明還提供一種含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的再一方面，還提供了一種用于治療肝癌的試劑盒，其含有所述的以 DLKl上mRNA為靶點的siRNA。
在本發(fā)明的又一方面，還提供了一種用于治療肝癌的生物芯片，其含有以DLKl上 mRNA為靶點的siRNA。在本發(fā)明的又一方面，還提供了肝癌相關(guān)基因DLKl在制備診斷肝癌及腫瘤的試 齊U，和制備基因治療肝癌及腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明由于對DLKl基因進行了體外動物細(xì)胞試驗，證實DLKl缺失能夠?qū)е赂文[ 瘤細(xì)胞顯著縮小，認(rèn)為DLKl基因在進行制備治療肝癌的基因藥物中有巨大作用，可以成為 基因治療的靶點。



圖1是實施例1中pSUPER DLK874和pSUPER DLKlOl 1的RNA干擾效率示意圖，其 中，pSUPER為空載對照，pSUPER Luc+為陰性對照；圖2是實施例2中三次克隆實驗中的一次的實驗照片；圖3是實施例2中從上到下為H印3B、!fepG2和Huh_7細(xì)胞在三次獨立實驗中的克 隆數(shù)目統(tǒng)計圖，其中，*表示與對照組比較時ρ值< 0. 05 ；圖4是實施例3中DLKl表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的Huh_7細(xì)胞株的鑒定示意圖，其中， β -actin作為各樣品蛋白上樣量對照；圖5是實施例3中DLKl表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)Huh_7細(xì)胞株的生長曲線比較示意圖，其中， 細(xì)胞活力在450nm波長處測量，每點上下所標(biāo)的黑色刻度線標(biāo)志為其標(biāo)準(zhǔn)差；圖6是實施例4中DLKl表達(dá)下調(diào)的Huh_7細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤性降低示意圖； 上圖為4周后攜帶腫瘤的裸鼠照片，皮下的腫瘤呈圓塊狀；下圖為4周后取下的皮下腫瘤照 片，其中Huh-7 plOll A4細(xì)胞在六周后仍無腫瘤形成；圖7是實施例5中SMMC-7721瞬間轉(zhuǎn)染pcDNA3. 0和pcDNA3. O-DLKl后的生長曲 線示意圖；圖 8 是實施例 5 中 SMMC-7721 瞬間轉(zhuǎn)染 pcDNA3. 0 和 pcDNA3. O-DLKl 后的 Western Blotting分析鑒定圖，其中DLKl為轉(zhuǎn)染pcDNA3. O-DLKl質(zhì)粒，3. 0為轉(zhuǎn)染pcDNA3. 0質(zhì)粒， blank為沒有轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細(xì)胞，β -actin作為各樣品蛋白上樣量對照。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的說明。本發(fā)明的實施例如下所示實施例1構(gòu)建并鑒定DLKl的RNAi質(zhì)粒在本實施例中，引入pSUPER質(zhì)粒，以構(gòu)建能夠?qū)?xì)胞進行比較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RNAi 的質(zhì)粒。該質(zhì)粒含有Hl-RNA多聚酶III基因啟動子，將能轉(zhuǎn)錄出含有短鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA (shRNA)的cDNA序列寡核苷酸插入pSUPER質(zhì)粒的該啟動子之后，使此載體在轉(zhuǎn)染入細(xì) 胞后能在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定合成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)的shRNA，即達(dá)到比較穩(wěn)定的沉默目的基因的作用。在本實施例中所用的寡核苷酸序列如下1、pSUPER Luc+正 向 引 物:gatccccctt acgctgagta cttcgattca agagatcgaagtactcagcg taagtttttg gaaa
反 向 引 物agcttttcca aaaacttacg ctgagtactt cgatctcttgaatcgaagta ctcagcgtaa gggg2、pSUPER DLK874 正 向 引 物:gatccccggt ctcacctgtg tcaagattca agagatcttgacacaggtga gacctttttg gaaa
反 向 引 物agcttttcca aaaaggtctc acctgtgtca agatctcttgaatcttgaca caggtgagac cggg3、pSUPER DLK1011 正 向 引 物:gatccccggt gtccatgaaa gagctcttca agagagagctctttcatagg cacctttttg gaaa反 向 引 物agcttttcca aaaaggtgtc catgaaagag ctctctcttgaagagctctt tcataggcac cggg其中pSUPER Luc+質(zhì)粒，其RNAi所針對的片段為改良過的北美螢火蟲 (Photinuspyralis)螢光素酶基因的19個堿基片段。該基因Luc+是具有種屬特異性的報 告基因，在哺乳動物細(xì)胞中不存在該基因也不表達(dá)。因此，本實施例中pSUPER Luc+質(zhì)粒為 RNAi干擾體系的參照，以排除pSUPER Luc+質(zhì)粒在RNAi過程中可能出現(xiàn)的非特異的實驗 結(jié)果。而pSUPERDLK874和pSUPER DLK1011質(zhì)粒干擾的靶序列分別針對DLKl基因序列第 874和第1011個堿基開始的連續(xù)19個堿基片段。將靶序列對應(yīng)的cDNA序列分別插入到正向引物(Forward primer)和反向引物 (Reverse primer)的前段空缺內(nèi)，同時將該cDNA的互補cDNA序列插入后段空缺，形成完整 的正向引物，共64個堿基。在得到人工合成DNA序列后，對正向引物和反向引物進行退火 和磷酸化，隨后連接入pSUPER載體，再經(jīng)過轉(zhuǎn)化進行陽性克隆的篩選。利用pSUPER質(zhì)粒內(nèi)部固定的限制性內(nèi)切酶位點Ecor I和Hind III JipSUPER Luc+質(zhì)粒進行酶切鑒定。陽性克隆酶切后的條帶大小約為360bp，而陰性克隆酶切后為300bp。所挑選的8 個pSUPER Luc+克隆中左起第2和3號克隆酶切后的條帶略高于其它條帶，大小符合陽性 克隆的特征。選擇該兩個克隆經(jīng)測序鑒定發(fā)現(xiàn)3號克隆的序列完全符合目的序列片段。而 4個pSUPER DLK1011克隆中，左起1、3、4號均為陽性，測序鑒定發(fā)現(xiàn)1號克隆的序列完全 符合目的序列片段。另外，pSUPER DLK874質(zhì)粒的鑒定篩選過程同上。最終得到該三個以 pSUPER為載體的RNAi質(zhì)粒。將構(gòu)建好的pSUPER DLK874和pSUPER DLK1011瞬間轉(zhuǎn)染入內(nèi)源性表達(dá)DLKl的HCC 細(xì)胞Huh-7、H印3B 和!fepG2 中，并以 pSUPER Luc+為對照質(zhì)粒，用 Real-time Quantitative PCR鑒定其沉默DLKl基因表達(dá)的效果(見圖1)。圖1中的數(shù)據(jù)是以各樣品的管家基因β肌動蛋白(β -actin)表達(dá)量為參考經(jīng)標(biāo) 準(zhǔn)化后的相對平均值。本實施例中，DLKl的Real-timeQuantitative PCR引物如下正向弓I物5，-gtactcggga aaggactgcc-3，反向弓I物5，-ctcgcagaaa ttgcctgaga-3，^M^fff"^ 5' -FAM-aggcacccgt ggatgatgag-TAMRA-3'以上Real-time Quantitative PCR的實驗每個都至少重復(fù)進行3次。由圖1可見，由pSUPER載體介導(dǎo)的RNA干擾能使目的基因DLKl的表達(dá)在上述三種細(xì)胞內(nèi)下調(diào)50-60%。實施例2瞬間克隆形成試驗(證明HCC細(xì)胞的DLKl表達(dá)抑制后其克隆形成能力 降低)
在鑒定pSUPER載體介導(dǎo)的RNAi有效的基礎(chǔ)上，對實施例1中的三種內(nèi)源性表達(dá) DLKl的細(xì)胞進行瞬間克隆形成試驗(見圖2、圖3)，并以無內(nèi)源性DLKl表達(dá)的HCC細(xì)胞株 Bel-7402細(xì)胞作為對照細(xì)胞。將pSUPER 空載質(zhì)粒和 pSUPER DLK874、pSUPER DLKlOl 1 質(zhì)粒與 pcDNA3. 0 質(zhì)粒以 10比1的比例分別共轉(zhuǎn)染入H印3B、H印G2、Huh-7和Bel-7402細(xì)胞，此處pcDNA3. 0質(zhì)粒 為轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞提供G418抗性。在轉(zhuǎn)染后，各對照組的分別取等量細(xì)胞分入IOOmm細(xì)胞 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，并用含適當(dāng)濃度的G418的MEM或者DMEM完全培養(yǎng)液進行篩選并等待耐藥 克隆的形成。其中IfepG2和G418篩選濃度為ΙΟΟΟμ g/ml，H印3B、Huh_7和Bel-7402均為 600μ g/ml。待3-4周，克隆形成較為完全后染色并拍照保存?？梢钥吹?，在內(nèi)源性DLKl被下調(diào)后，H印3B、HepG2和Huh_7細(xì)胞形克隆形成的數(shù) 目都有明顯下降，即其克隆形成能力被顯著削弱。而沒有內(nèi)源性表達(dá)的Bel-7402細(xì)胞在同 樣的實驗中其形克隆形成的數(shù)目卻沒有明顯改變。實施例3Western Blotting分析(證明Huh_7細(xì)胞的DLKl表達(dá)被抑制后其生長 增殖能力降低)以 Huh-7 細(xì)胞為對象，將 pSUPER 空載質(zhì)粒和 pSUPER DLK874、pSUPERDLK1011 質(zhì)粒 與pcDNA3. 0質(zhì)粒以10比1的比例分別共轉(zhuǎn)染入Huh_7細(xì)胞，構(gòu)建DLKl表達(dá)抑制的Huh_7 穩(wěn)定細(xì)胞株，并用Western BlottingAnalysis對于其中的4株穩(wěn)定細(xì)胞株在蛋白水平上對 DLKl的表達(dá)進行鑒定(見圖4)。圖4中，pSUPER C5為pSUPER空載質(zhì)粒穩(wěn)定細(xì)胞株；ρ 1011 Β3和ρ1011Α4為穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染pSUPER DLK1011后形成的亞克??；p874 C2為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSUPER DLK874后形成的亞克 隆。得到兩株DLKl穩(wěn)定下調(diào)的細(xì)胞株Huh-7p874 C2和Huh_7 plOll A4，而穩(wěn)定株Huh_7 PlOll B3中DLKl的表達(dá)并沒有下調(diào)。在建立了 DLKl穩(wěn)定下調(diào)細(xì)胞株的基礎(chǔ)上，研究了這兩株穩(wěn)定株的生長屬性是否 受DLKl下調(diào)的影響而改變，為此，比較這些細(xì)胞及對照的生長曲線。如圖5所示，當(dāng)DLKl 的表達(dá)被下調(diào)后，其穩(wěn)定株的生長增殖能力明顯減弱。與之比較的空載穩(wěn)定細(xì)胞株P(guān)SUPER C5和內(nèi)源性DLKl表達(dá)沒有被下調(diào)的對照穩(wěn)定細(xì)胞株plOll B3，它們兩者的生長狀態(tài)良好。 雖然它們之間也略有差異，即pSUPER C5要比plOll B3生長增殖能力稍微更強一些，但是 這兩者總的要比P874 C2和plOll A4的生長增殖能力都要顯著得多。該實驗經(jīng)重復(fù)三次 后，得到相似的結(jié)果。實施例4無胸腺的BLAB/cA裸鼠體內(nèi)實驗(證明Huh_7細(xì)胞的DLKl表達(dá)被抑制 后其在動物體內(nèi)成瘤能力降低)本實施例共取32只裸鼠，分成四組，每組八只，分別于皮下注射相同量(2X106) 的Huh-7 pSUPER C5、pl011 B3、p874 C2和plOll A4細(xì)胞。注射后四周觀察裸鼠的生存狀 態(tài)及所成腫瘤的形態(tài)指標(biāo)(見圖6)。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，DLKl被穩(wěn)定下調(diào)的Huh-7 p874 C2細(xì)胞在裸鼠皮下所成的腫瘤要比 對照組Huh-7 pSUPER C5和plOll B3細(xì)胞在裸鼠下所成的腫瘤在體積上顯著減小，而且Huh-7 plOll A4在觀察注射腫瘤細(xì)胞后六周仍然未見肉眼可見腫瘤形成，解剖證實該注射 Huh-7 plOll A4細(xì)胞的8只裸鼠確實沒有腫瘤形成。注射Huh_7 pSUPER C5、plOll B3、 p874 C2細(xì)胞后的所有裸鼠在四周后都形成了腫瘤，而且注射了 Huh-7 pSUPER C5和plOll B3細(xì)胞所形成的腫瘤經(jīng)解剖分離后顯示其所成腫瘤實體的體積比Huh-7 p874 C2的更大 (見圖6)，并且該兩組腫瘤實體本身沒有顯著性差異。但注射了 Huh-7 pSUPER C5和ρ 1011 Β3細(xì)胞的裸鼠與注射了 Huh-7p874 C2和plOll A4細(xì)胞的裸數(shù)的體重凈重、進食能力和精 神狀態(tài)在4周后沒有顯著差異，所有裸鼠在實驗中止即解剖前全部存活。本實施例結(jié)果顯示對于內(nèi)源性表達(dá)DLKl的肝癌細(xì)胞株在模型動物皮下進行的成 瘤實驗中，DLKl對于腫瘤細(xì)胞的成瘤能力起了重要的增強作用。由于DLKl被穩(wěn)定下調(diào)的 細(xì)胞成瘤作用大幅度降低，甚至其中一例了 Huh-7 plOll A4細(xì)胞的8只裸鼠都沒有長出肉 眼可見的腫瘤，因此本實施例證明了 Huh-7細(xì)胞的DLKl表達(dá)被抑制后其在動物體內(nèi)成瘤能 力降低。實施例5DLK1促進SMMC-7721細(xì)胞的生長以上實施例均采用了 RNAi的手段使DLKl的表達(dá)受到抑制，觀察到DLKl的表達(dá)抑制后，肝癌細(xì)胞生長增殖能力、克隆形成和成瘤能力都有顯著的降低，這提示DLKl對于肝 癌細(xì)胞的生長增殖及成瘤性起著某種維持或限制的作用。本實施例用以驗證DLKl是否可 以直接起到癌基因的作用來促進腫瘤細(xì)胞的增殖。在無內(nèi)源性DLKl表達(dá)的SMMC-7721細(xì)胞中，瞬間轉(zhuǎn)入之前所構(gòu)建的過表達(dá)DLKl 全長蛋白的pcDNA3. 0-DLK1質(zhì)粒，并以pcDNA3. 0空載質(zhì)粒為對照，觀察細(xì)胞的生長增殖 曲線(見圖7)。Western Blotting Analysis中的樣品為生長曲線所用同一批轉(zhuǎn)染了 pcDNA3. 0和pcDNA3. 0-DLK1質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞，各樣品上樣量均為20g，以鑒定轉(zhuǎn)染質(zhì) 粒后DLKl在SMMC-7721細(xì)胞中表達(dá)的效率(見圖8)。在本實施例中，在SMMC-7721細(xì)胞中進行了該兩個質(zhì)粒的瞬間轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑為 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，在轉(zhuǎn)染4-5小時后將含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液撤去，更 換成新鮮的DMEM完全培養(yǎng)液，以盡量減少轉(zhuǎn)染試劑的毒性對于細(xì)胞的損傷。繼續(xù)培養(yǎng)至次 日，計數(shù)后分入96孔板內(nèi)生長，每孔均勻分入1000個細(xì)胞。經(jīng)過8天的觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了 DLKl的SMMC-7721細(xì)胞比轉(zhuǎn)染了空載質(zhì)粒的細(xì)胞生長顯著增快。本實施例結(jié)果表明DLKl能顯著增強無內(nèi)源性DLKl表達(dá)的HCC細(xì)胞株SMMC-7721 的生長增殖能力。
權(quán)利要求
一種以肝癌相關(guān)基因DLK1為靶點的核糖核酸，其特征在于它的寡核苷酸序列如下siRNASCCGCAUCCUGAAGGUGUCCAUGAAAdTdT(SEQ ID NO14)；ASUUUCAUGGACACCUUCAGGAUGCGGdTdT(SEQ ID NO15)。
2.一種如權(quán)利要求1所述的以肝癌相關(guān)基因DLKl為靶點的核糖核酸在制備治療原發(fā) 性肝癌的RNA干擾藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以肝癌相關(guān)基因DLK1為靶點的核糖核酸，它的寡核苷酸序列如下siRNASCCGCAUCCUGAAGGUGUCCAUGAAAdTdT(SEQID NO14)；ASUUUCAUGGACACCUUCAGGAUGCGGdTdT(SEQ ID NO15)。此外，本發(fā)明還公開了上述以肝癌相關(guān)基因DLK1為靶點的核糖核酸在制備治療原發(fā)性肝癌的RNA干擾藥物中的用途。
文檔編號C12N15/113GK101805736SQ201010169319
公開日2010年8月18日 申請日期2006年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日
發(fā)明者韓澤廣, 黃健 申請人:上海人類基因組研究中心