專利名稱：一種肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
肝臟是藥物代謝的主要場(chǎng)所，大部分藥物經(jīng)口服或肌注后經(jīng)血液傳輸首先到達(dá)肝 臟進(jìn)行代謝然后進(jìn)入血液循環(huán)，這就是肝臟的首過(guò)效應(yīng)。因?yàn)楦闻K是重要的體內(nèi)代謝部位， 藥物的轉(zhuǎn)化大部分在肝臟內(nèi)完成，所以新藥的初期研發(fā)必需要研究肝臟對(duì)藥物代謝的影 響。其主要內(nèi)容包括藥物在肝臟內(nèi)的代謝分解速度，主要的代謝途徑，主要代謝產(chǎn)物以及參 與該化合物代謝主要肝臟酶體系。同時(shí)藥物對(duì)肝臟的毒性作用也需做出相應(yīng)的評(píng)估，所有 這些信息對(duì)于藥物的早期篩選都有著重要的意義。肝原代細(xì)胞有以下優(yōu)點(diǎn)可同時(shí)獲得大量性狀同一的標(biāo)本，與體內(nèi)情況保持一致， 可以在接近生理狀態(tài)的情況之下研究藥物的代謝等等。經(jīng)過(guò)夾心培養(yǎng)處理的長(zhǎng)期培養(yǎng)的單 層肝原代細(xì)胞可形成類似膽小管結(jié)構(gòu)并表達(dá)出肝細(xì)胞特有的載體，從而可進(jìn)一步用于化合 物經(jīng)膽汁排泄的可能性進(jìn)行評(píng)價(jià)。特別是人肝原代細(xì)胞可以作為藥物早期篩選的最佳模型 來(lái)研究藥物對(duì)肝細(xì)胞的活性影響。肝原代細(xì)胞的分離國(guó)外已經(jīng)有報(bào)道，通過(guò)進(jìn)行肝灌流獲得肝原代細(xì)胞，采用膠原 凝膠夾層法培養(yǎng)肝原代細(xì)胞。國(guó)內(nèi)現(xiàn)在原代肝細(xì)胞的分離只能在完整的肝臟組織下才能操 作，對(duì)于肝臟組織塊或者細(xì)小的肝組織的灌流未見報(bào)道，對(duì)于夾心法培養(yǎng)原代肝細(xì)胞也只 采用膠原凝膠的方法。肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)在國(guó)內(nèi)還沒有形成一套特定而成熟的分離和培養(yǎng)體系， 特別是對(duì)肝臟組織塊的肝細(xì)胞分離還沒有報(bào)道，國(guó)內(nèi)制備肝原代細(xì)胞還屬空白領(lǐng)域，僅僅 具備活體原位灌流技術(shù)無(wú)法滿足作為藥物篩選的需求，特別是人的肝原代細(xì)胞由于倫理方 面的限制，獲得整塊人肝的可能性幾乎為零，但藥物篩選最好的載體就是人的肝原代細(xì)胞， 最接近藥物作用的實(shí)際情況，國(guó)內(nèi)在人肝細(xì)胞的研究這方面幾乎為零，這對(duì)國(guó)內(nèi)藥物研發(fā) 領(lǐng)域的企業(yè)和科研院所來(lái)說(shuō)成為了一個(gè)阻礙其藥物研發(fā)進(jìn)度的關(guān)鍵點(diǎn)，通過(guò)對(duì)肝原代細(xì)胞 的分離和培養(yǎng)技術(shù)難點(diǎn)的突破，將極大的促進(jìn)藥物研發(fā)的進(jìn)度和效率，也可以降低研發(fā)的 成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，它能解決國(guó)內(nèi)制備肝原 代細(xì)胞領(lǐng)域的空白，肝細(xì)胞的培養(yǎng)采用“三明治膠”夾層法，能夠使其保持較長(zhǎng)時(shí)間的活力， 解決了肝細(xì)胞沒有像細(xì)胞系那樣的增殖性而活性無(wú)法保持的問(wèn)題。為了解決背景技術(shù)所存在的問(wèn)題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案(a)將切除的不 完整肝臟組織塊通過(guò)粘性溶劑封閉多余的血管管路，只保留一個(gè)可供灌流的進(jìn)液血管口和 一個(gè)出液血管口 ；(b)插入合適大小的針頭，用粘性溶劑封住，等粘性溶劑干之后再涂一 層粘性溶劑以防漏液；(c)放入36 42°C水浴鍋內(nèi)漂浮的容器中，開始灌輸36 42°C的3無(wú)鈣灌流液，控制灌流速度和灌流時(shí)間；(d)清空無(wú)鈣灌流液，灌輸36 42°C的0.03 0. 10%膠原酶灌流液，控制灌流速度和灌流時(shí)間；(e):將完全消化好組織分離出肝細(xì)胞， 通過(guò)Percoll溶液離心獲得純化的仍保持活性的原代肝細(xì)胞。所述的無(wú)鈣灌流液(ρΗ7·4)配方為=NaCl 8. 0 9. Og · Γ1 KC10. 4 0. 6g · Γ1 HEPES2. 0 4. Og · L-1 NaOH 0. 2 0. 4g · L-1 維生素 C 50 100 μ g · mL_1 胰島素 2 4μ g · mL-1，流速 25 50ml/min，時(shí)間 5 20min。所述的酶灌流液(ρΗ7·6)配方為NaCl 3. 0 5. Og · L—1 KC10. 2 0. 6g · Γ1 CaCl2O. 5 1. Og · L-1 HEPES 20 30g · L-1 Na0H2. 5 5. Og ·廠1 膠原酶濃度 0. 04 0. 08% 維生素 C 50 ~ 100 μ g · mL_1 胰島素 2 4 μ g · mL-1，流速 25 50ml/min，時(shí)間 5 20min。所述的Percoll分離液是90 % Percoll配制是9體積的Percoll力卩1體積的 PBS(10*)，然后加入培養(yǎng)液配成20 70% Percoll溶液。本發(fā)明具有以下以下有益效果解決國(guó)內(nèi)制備肝原代細(xì)胞領(lǐng)域的空白，肝細(xì)胞的 培養(yǎng)采用“三明治膠”夾層法，能夠使其保持較長(zhǎng)時(shí)間的活力，解決了肝細(xì)胞沒有像細(xì)胞系 那樣的增殖性而活性無(wú)法保持的問(wèn)題。


圖1是本發(fā)明狗肝細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)貼壁的示意圖；圖2是本發(fā)明狗肝細(xì)胞培養(yǎng)M小時(shí)后的示意圖；圖3是本發(fā)明猴肝細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)后的示意圖；圖4是本發(fā)明猴肝細(xì)胞培養(yǎng)M小時(shí)后的示意圖；圖5是本發(fā)明人肝細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)后的示意圖；圖6是本發(fā)明人肝細(xì)胞培養(yǎng)M小時(shí)后的示意圖。
具體實(shí)施例方式本具體實(shí)施方式
采用以下技術(shù)方案(a)將切除的不完整肝臟組織塊通過(guò)粘性 溶劑封閉多余的血管管路，只保留一個(gè)可供灌流的進(jìn)液血管口和一個(gè)出液血管口 ；(b)插 入合適大小的針頭，用粘性溶劑封住，等粘性溶劑干之后再涂一層粘性溶劑以防漏液；(C) 放入36 42°C水浴鍋內(nèi)漂浮的容器中，開始灌輸36 42°C的無(wú)鈣灌流液，控制灌流速度 和灌流時(shí)間；(d)清空無(wú)鈣灌流液，灌輸36 42°C的0.03 0. 10%膠原酶灌流液，控制灌 流速度和灌流時(shí)間；(e)將完全消化好組織分離出肝細(xì)胞，通過(guò)Percoll溶液離心獲得純 化的仍保持活性的原代肝細(xì)胞。所述的無(wú)鈣灌流液(ρΗ7·4)配方為=NaCl 8. 0 9. Og · Γ1 KC10. 4 0. 6g · Γ1 HEPES2. 0 4. Og · L-1 NaOH 0. 2 0. 4g · L-1 維生素 C 50 100 μ g · mL_1 胰島素 2 4μ g · mL-1，流速 25 50ml/min，時(shí)間 5 20min。所述的酶灌流液(pH7.6)配方為NaCl 3. 0 5. Og · Γ1 KC10. 2 0. 6g · Γ1 CaCl2O. 5 1. Og .171 HEPES 20 30g·!^ Na0H2. 5 5. Og 膠原酶濃度 0· 04 0· 08% 維生素 C 50 100 μ g · mL_1 胰島素 2 4 μ g · mL-1，流速 25_50ml/min，時(shí)間 5_20min。所述的Percoll分離液是90 % Percoll配制是9體積的Percoll加1體積的PBS(10*)，然后加入培養(yǎng)液配成20 70% Percoll溶液。本具體實(shí)施方式
解決國(guó)內(nèi)制備肝原代細(xì)胞領(lǐng)域的空白，肝細(xì)胞的培養(yǎng)采用“三明 治膠”夾層法，能夠使其保持較長(zhǎng)時(shí)間的活力，解決了肝細(xì)胞沒有像細(xì)胞系那樣的增殖性而 活性無(wú)法保持的問(wèn)題。實(shí)施例1 狗肝原代細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法分離和培養(yǎng)方法1)稱重；幻用事先預(yù)冷的無(wú)鈣灌流液沖洗肝臟，一方面沖洗肝 臟中的血液殘留，另一方面尋找合適的血管，能夠作為主要沖洗肝臟組織塊的血管，為下一 步無(wú)鈣和膠原酶灌流液的灌流做準(zhǔn)備；幻用無(wú)菌紗布擦干肝臟組織塊周圍和切面的水分， 灌流插管采用剪去尖端的黃槍頭插入事先選擇好的血管中，采用膠水把切面包裹起來(lái)，使 其成為一個(gè)不漏液的肝組織塊，然后在前端剪一個(gè)小口，排出所灌流的液體，無(wú)鈣和膠原酶 灌流液兩種先后沖洗10 15min，然后停止灌流，撕下膠皮，放入含5%胎牛血清的F12高糖 DMEM培養(yǎng)液中，用鑷子撕掉肝包膜慢慢晃動(dòng)使肝細(xì)胞脫落，用15、30和150目篩子過(guò)濾所 消化后的培養(yǎng)液，去除未消化的肝組織；4)消化細(xì)胞的培養(yǎng)液放入離心管中，400 500轉(zhuǎn) 離心％iin，去除上清液，然后加入所配好的Percoll分離液，700 800轉(zhuǎn)離心％iin，輕輕 吸取上層死細(xì)胞和上清液，留下下層活的肝細(xì)胞，再用含5 10%胎牛血清的F12高糖DMEM 培養(yǎng)液重懸肝細(xì)胞，放入離心管中400 500轉(zhuǎn)離心％iin，清洗肝細(xì)胞，最終獲得純化的肝 原代細(xì)胞；5)用臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)活的肝細(xì)胞數(shù)量及存活率，按照1*106個(gè)/ml接種到鋪有鼠 尾膠的培養(yǎng)板中，在37°C和5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后，加入含0. 25 5. Omg/ml Matrigen的無(wú)血清培養(yǎng)液，使肝原代細(xì)胞的培養(yǎng)采用夾層法培養(yǎng)，每天換無(wú)血清培養(yǎng)液。解 決國(guó)內(nèi)制備肝原代細(xì)胞領(lǐng)域的空白，肝細(xì)胞的培養(yǎng)采用“三明治膠”夾層法，能夠使其保持 較長(zhǎng)時(shí)間的活力，解決了肝細(xì)胞沒有像細(xì)胞系那樣的增殖性而活性無(wú)法保持的問(wèn)題。實(shí)施例2 猴肝原代細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法分離和培養(yǎng)方法1)稱重；幻用事先預(yù)冷的無(wú)鈣灌流液沖洗肝臟，一方面沖洗肝 臟中的血液殘留，另一方面尋找合適的血管，能夠作為主要沖洗肝臟組織塊的血管，為下一 步無(wú)鈣和膠原酶灌流液的灌流做準(zhǔn)備；幻用無(wú)菌紗布擦干肝臟組織塊周圍和切面的水分， 灌流插管采用剪去尖端的黃槍頭插入事先選擇好的血管中，采用膠水把切面包裹起來(lái)，使 其成為一個(gè)不漏液的肝組織塊，然后在前端剪一個(gè)小口，排出所灌流的液體，無(wú)鈣和膠原酶 灌流液兩種先后沖洗10 15min，然后停止灌流，撕下膠皮，放入含5%胎牛血清的!^12高糖 DMEM培養(yǎng)液中，用鑷子撕掉肝包膜慢慢晃動(dòng)使肝細(xì)胞脫落，用15、30和150目篩子過(guò)濾所 消化后的培養(yǎng)液，去除未消化的肝組織；4)消化細(xì)胞的培養(yǎng)液放入離心管中，400 500轉(zhuǎn) 離心％iin，去除上清液，然后加入所配好的Percoll分離液，700 800轉(zhuǎn)離心％iin，輕輕 吸取上層死細(xì)胞和上清液，留下下層活的肝細(xì)胞，再用含5 10%胎牛血清的F12高糖DMEM 培養(yǎng)液重懸肝細(xì)胞，放入離心管中400 500轉(zhuǎn)離心％iin，清洗肝細(xì)胞，最終獲得純化的肝 原代細(xì)胞；5)用臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)活的肝細(xì)胞數(shù)量及存活率，按照1*106個(gè)/ml接種到鋪有鼠 尾膠的培養(yǎng)板中，在37°C和5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后，加入含0. 25 5. Omg/ml Matrigen的無(wú)血清培養(yǎng)液，使肝原代細(xì)胞的培養(yǎng)采用夾層法培養(yǎng)，每天換無(wú)血清培養(yǎng)液。解 決國(guó)內(nèi)制備肝原代細(xì)胞領(lǐng)域的空白，肝細(xì)胞的培養(yǎng)采用“三明治膠”夾層法，能夠使其保持 較長(zhǎng)時(shí)間的活力，解決了肝細(xì)胞沒有像細(xì)胞系那樣的增殖性而活性無(wú)法保持的問(wèn)題。實(shí)施例3 人肝原代細(xì)胞分離方法
分離和培養(yǎng)方法1)稱重；幻用事先預(yù)冷的無(wú)鈣灌流液沖洗肝臟，一方面沖洗肝 臟中的血液殘留，另一方面尋找合適的血管，能夠作為主要沖洗肝臟組織塊的血管，為下一 步無(wú)鈣和膠原酶灌流液的灌流做準(zhǔn)備；幻用無(wú)菌紗布擦干肝臟組織塊周圍和切面的水分， 灌流插管采用剪去尖端的黃槍頭插入事先選擇好的血管中，采用膠水把切面包裹起來(lái)，使 其成為一個(gè)不漏液的肝組織塊，然后在前端剪一個(gè)小口，排出所灌流的液體，無(wú)鈣和膠原酶 灌流液兩種先后沖洗10 15min，然后停止灌流，撕下膠皮，放入含5%胎牛血清的!^12高糖 DMEM培養(yǎng)液中，用鑷子撕掉肝包膜慢慢晃動(dòng)使肝細(xì)胞脫落，用15、30和150目篩子過(guò)濾所 消化后的培養(yǎng)液，去除未消化的肝組織；4)消化細(xì)胞的培養(yǎng)液放入離心管中，400 500轉(zhuǎn) 離心％iin，去除上清液，然后加入所配好的Percoll分離液，700 800轉(zhuǎn)離心％iin，輕輕 吸取上層死細(xì)胞和上清液，留下下層活的肝細(xì)胞，再用含5 10%胎牛血清的F12高糖DMEM 培養(yǎng)液重懸肝細(xì)胞，放入離心管中400 500轉(zhuǎn)離心％iin，清洗肝細(xì)胞，最終獲得純化的肝 原代細(xì)胞；5)用臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)活的肝細(xì)胞數(shù)量及存活率，按照1*106個(gè)/ml接種到鋪有鼠 尾膠的培養(yǎng)板中，在37°C和5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后，加入含0. 25 5. Omg/ml Matrigen的無(wú)血清培養(yǎng)液，使肝原代細(xì)胞的培養(yǎng)采用夾層法培養(yǎng)，每天換無(wú)血清培養(yǎng)液。解 決國(guó)內(nèi)制備肝原代細(xì)胞領(lǐng)域的空白，肝細(xì)胞的培養(yǎng)采用“三明治膠”夾層法，能夠使其保持 較長(zhǎng)時(shí)間的活力，解決了肝細(xì)胞沒有像細(xì)胞系那樣的增殖性而活性無(wú)法保持的問(wèn)題。
權(quán)利要求
1.一種肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于(a)將切除的不完整肝臟組織塊 通過(guò)粘性溶劑封閉多余的血管管路，只保留一個(gè)可供灌流的進(jìn)液血管口和一個(gè)出液血管 口 ；(b)插入合適大小的針頭，用粘性溶劑封住，等粘性溶劑干之后再涂一層粘性溶劑以 防漏液；(c)放入36 42°C水浴鍋內(nèi)漂浮的容器中，開始灌輸36 42°C的無(wú)鈣灌流液，控 制灌流速度和灌流時(shí)間；(d)清空無(wú)鈣灌流液，灌輸36 42°C的0. 03 0. 10%膠原酶灌 流液，控制灌流速度和灌流時(shí)間；(e)將完全消化好組織分離出肝細(xì)胞，通過(guò)Percoll溶液 離心獲得純化的仍保持活性的原代肝細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于所述的無(wú)鈣 灌流液(pH7. 4)配方為NaCl 8. 0 9. Og 'L-1KCl 0. 4 0. 6g .171 HEPES2. 0 4. Og .Γ1 NaOH 0. 2 0. 4g · L-1 維生素 C 50 100μ g Γ1 胰島素 2 4μ g ·πι Λ 流速 25_50ml/ min,時(shí)間 5-20min ；酶灌流液(ρΗ7· 6)配方為=NaCl 3. 0 5. Og · Γ1 KC10. 2 0. 6g · Γ1 CaCl2O. 5 1. Og .171 HEPES 20 30g·!^ Na0H2. 5 5. Og 膠原酶濃度 0· 04 0· 08% 維生素 C 50 100μ g · mL_1 胰島素 2 4μ g · mL-1，流速 25_50ml/min，時(shí)間 5_20min ； Percoll分離液是90% Percoll配制是9體積的Percoll加1體積的PBS (10*)，然后加入 培養(yǎng)液配成20 70% Percoll溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于通過(guò)在細(xì)胞 上下層鋪上相應(yīng)的膠使其能建立類似活體肝臟實(shí)質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)并保持長(zhǎng)時(shí)間的活力及其 穩(wěn)定的代謝功能；(a)在空白培養(yǎng)板上鋪上0. 01 0. lmg/ml鼠尾膠，體積按照培養(yǎng)板每孔 表面積的大小加入；(b)在鋪上細(xì)胞等待4 10小時(shí)之后，加入Matrigel膠或鼠尾膠，形 成一個(gè)夾層，使肝細(xì)胞能模擬肝板樣生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于經(jīng)過(guò)鼠尾膠 處理的培養(yǎng)板表面會(huì)形成一層蛋白薄膜，有利于肝細(xì)胞貼壁。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于加入上層 Matrigel膠或鼠尾膠之后，可以固定肝細(xì)胞的形狀，形成肝板樣結(jié)構(gòu)，使肝細(xì)胞具有較長(zhǎng)的 生存周期。
全文摘要
一種肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，它涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。解決國(guó)內(nèi)制備肝原代細(xì)胞領(lǐng)域的空白，肝細(xì)胞的培養(yǎng)采用“三明治膠”夾層法，能夠使其保持較長(zhǎng)時(shí)間的活力，解決了肝細(xì)胞沒有像細(xì)胞系那樣的增殖性而活性無(wú)法保持的問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102041242SQ201010169838
公開日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月12日
發(fā)明者劉鴻君, 沈國(guó)林 申請(qǐng)人:北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司