專利名稱：一種生物轉(zhuǎn)化甜菊糖中甜菊苷為甜菊雙糖苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用生物轉(zhuǎn)化甜菊糖中的甜菊苷為甜菊雙糖苷的方法，屬于甜味 劑或醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甜菊苷(stevioside，SS)為甜菊中所含有的主要強甜味成份，又稱斯替維苷，是 一種雙萜配糖體，屬于四環(huán)二萜類化合物，在C-4位的羧基上連接一個葡萄糖，C-13位上連 接有二糖。甜菊具有甜味則是因其存在一些糖苷如甜菊苷和萊鮑迪甙。甜菊苷常態(tài)下為白 色或微黃色松散粉末或結(jié)晶，常溫下穩(wěn)定，甜度約為蔗糖的300倍，味感與蔗糖相似，甜味 純正，無異味，殘味存留的時間比蔗糖長，熱量僅為蔗糖的三分之一，非酵解，熱穩(wěn)定性好， 毒性低而且適用范圍廣。被稱為是繼蔗糖、甜菜糖之后的第三種天然糖源(李曉瑜.甜菊 糖苷的安全性研究進展[J].中國食品添加劑，2003,2:5-11.)。從甜菊中提取的甜菊糖是八種雙萜糖甙的混合物，結(jié)構(gòu)通式見式1，
0—fc
1式1R1和R2位可連接不同種類和數(shù)量的單糖構(gòu)成不同成分，其八種成分分別為 甜菊苷、甜菊雙糖苷(steviolbioside)、萊包迪甙A(rebaudioside A, RA)、萊包迪甙 B(rebaudiosideB, RB) >C (rebaudioside C, RC) > It^ifift D (rebaudioside D, RD)、萊包迪甙E(rebaudioside E，RE)、杜爾可甙A (dulcoside A，Dul_A)。其不同種類的糖 甙在甜度和味質(zhì)上存在較大的差異。其中以RA 口感最好，其甜度超過蔗糖的300倍，且甜 味純正無后味，是非常理想的天然甜味劑。而SS的甜度為蔗糖的200倍并帶有一定的后苦 味道，且呈味比蔗糖慢，SS和RA是甜菊葉中主要甜菊糖苷成分，約占總甜菊糖含量的90% (曹強譯，甜菊糖的特征與有效利用.杭州食品科技，1993，29 (2) :8-11.)。葡萄糖苷酶(EC3.2. 1.21)存在于許多植物、昆蟲、酵母、霉菌及細菌體內(nèi)，
1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中發(fā)現(xiàn)了該酶，該酶分布較為廣泛，特別是植物
的種子和微生物中尤為普遍，黑櫻桃、水稻、大豆、木薯作物中純化出葡萄糖苷酶。對微
3生物中的葡萄糖苷酶的研究主要在酵母、細菌、真菌、鏈霉等(李遠華.葡萄糖苷酶 的研究進展.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，29 (4) =421-425. )00 -葡萄糖苷酶能參與生物體的糖代謝，對維持生物體的正常生理功能起著重要 作用，能夠水解結(jié)合于底物末端的非還原性0-D-葡糖苷鍵，釋放出3-D-葡萄糖和相應(yīng)的 配基。葡萄糖苷酶的生物學(xué)功能使它在生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用。首先是作為食品風味 酶應(yīng)用，目前，葡萄糖苷酶的主要應(yīng)用是在食品工業(yè)中。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，風味化 學(xué)的研究也引人關(guān)注。運用該酶可以提高果制品的天然風味。另外葡萄糖苷酶還在青 梅脫苦、降解纖維素、水解大豆異黃酮方面有著廣泛的應(yīng)用(許晶，張永忠，孫艷梅.葡 萄糖苷酶的研究進展.食品研究與開發(fā)，2005，26 (6) :183-186.)?；碧鞘悄久箤?Trichoderma)纖維素酶主要的天然強力誘導(dǎo)物(Hrmova' M， 1991 ；Takanori Furukawa，2008)，具有很高的應(yīng)用價值，異甜菊醇為降血糖調(diào)血脂的藥物 (陳育如，劉虎，姜中玉，劉友芬.一種同時制備異甜菊醇和槐糖的方法[P].中國專利，公開 號CN 101497633A，2009. 3. 10.)，甜菊雙糖苷為制備槐糖和異甜菊醇的最佳原料。酶的固定化是用一定的材料將活性酶束縛或限制于一定的區(qū)域內(nèi)，但仍能進行酶 所特有的催化反應(yīng)，并可回收及重復(fù)使用的一種技術(shù)。與游離酶相比，固定化酶具有產(chǎn)物分 離簡單、可重復(fù)使用、操作連續(xù)及可控、工藝簡便等一系列優(yōu)點，在食品、制藥、化學(xué)分析、環(huán) 境保護等方面具有越來越廣泛的應(yīng)用(韓文靜.固定化酶的新型制備方法及其在食品工業(yè) 中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技，2009，30 (2) :345-347.)。有報道利用海藻酸鈉固定化葡 萄糖苷酶(王瑾，李默馨，李紅玲，等.殼聚糖/海藻酸鈉固定化葡萄糖苷酶的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2009，30 (3) 164-167)。本發(fā)明利用巨大芽孢桿菌J2 (Bacillus megateriumJ2) CCTCC NO: M209201 (CN200910036066. 5)菌液或酶液或固定化酶，對甜菊苷進行轉(zhuǎn)化，從而達到制備甜 菊雙糖苷的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備甜菊雙糖苷的方法。本發(fā)明具體的技術(shù)方案是將巨大芽孢桿菌J2 (Bacillus megaterium J2) CCTCC NO :M209201 菌種產(chǎn)酶培養(yǎng)， 用獲得的菌液或游離酶或固定化酶轉(zhuǎn)化甜菊苷，轉(zhuǎn)化后的液體經(jīng)除雜處理后，分離純化得 到甜菊雙糖苷。產(chǎn)酶培養(yǎng)為利用培養(yǎng)基對J2菌培養(yǎng)，得到的菌液即為轉(zhuǎn)化菌液，分離的酶液即為 游離酶，如果用固定化材料對酶進行固定化即得到固定化酶。固定化酶制備方法將一定量的固定化劑(如海藻酸鈉或其他固定化材料)在一 定的溫度使固定化劑溶化或溶解，使含固定化劑的溶液與酶溶液充分混勻，用制粒設(shè)備將 混合液逐滴注入到質(zhì)量分數(shù)2%氯化鈣溶液(對海藻酸鈉)中，形成凝膠球。后處理(如冰 箱中靜置硬化)并洗滌后，貯存于4°C冰箱中備用。將菌液加入到甜菊苷含量不同(0. 1% _100%，重量比)的甜菊糖轉(zhuǎn)化液中，在一 定轉(zhuǎn)化條件下轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的液體經(jīng)除雜等處理后，常規(guī)分離純化得到甜菊雙糖苷。將游離酶加入到甜菊苷含量不同(0. 1% _100%，重量比)的甜菊糖轉(zhuǎn)化液中，在
4一定轉(zhuǎn)化條件下轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的液體經(jīng)除雜等處理后，常規(guī)分離純化得到甜菊雙糖苷。將固定化酶加入到甜菊苷含量不同(0. 1% _100%，重量比)的甜菊糖轉(zhuǎn)化液中， 在一定轉(zhuǎn)化條件下轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的液體經(jīng)除雜等處理后，常規(guī)分離純化得到甜菊雙糖苷。上述方法中，甜菊糖在轉(zhuǎn)化液中的重量比為0.01% 10%，優(yōu)選0. 3%。上述方法中，轉(zhuǎn)化體系中的pH值為2. 0 9. 0。轉(zhuǎn)化體系的溫度為常溫(0-30°C )或20 60°C。固定化酶用量為轉(zhuǎn)化液重量的0.01% 10%，優(yōu)選0. 1% 3%。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用微生物產(chǎn)酶的特點，使化學(xué)高溫水解無法定向水解的過程得到高效、 專一、定向、常溫或接近于常溫的轉(zhuǎn)化，通過對菌或酶進行游離轉(zhuǎn)化或固定化，固定化處理 增加了菌與酶的利用次數(shù)和使用效率，與游離細胞或游離酶轉(zhuǎn)化相比，使產(chǎn)品分離得到了 簡化，減小了分離成本，酶使用效率的提高可降低甜菊苷酶法轉(zhuǎn)化的成本。得到的固定化酶 與游離酶相比，對溫度和PH的適應(yīng)性范圍更寬，在適宜溫度和pH值時，固定化酶的轉(zhuǎn)化率 比游離細胞的轉(zhuǎn)化效率分別提高到120%和150%，具有極好的應(yīng)用價值。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物甜菊雙糖苷是甜菊糖中原先含量極低的有用成份，作為制備異甜菊醇和 槐糖的最佳原料，具有很強的應(yīng)用價值，本發(fā)明通過微生物定向轉(zhuǎn)化法，可以使甜菊苷以接 近于100%的效率轉(zhuǎn)化為甜菊雙糖苷，極大地擴展了甜菊雙糖苷的來源，從根本上解決了甜 菊雙糖苷的原料來源問題。


圖1 轉(zhuǎn)化時間對甜菊苷轉(zhuǎn)化為甜菊雙糖苷產(chǎn)量的影響圖2 甜菊苷轉(zhuǎn)化前原液的HPLC3 用固定化酶部分轉(zhuǎn)化甜菊苷后的HPLC圖
具體實施例方式巨大芽孢桿菌的選育中國專利申請200910036066. 5公開了一株巨大芽孢桿菌J2 (Bacillus megaterium J2)^ J2 (Bacillus megaterium J2) CCTCC NO :M209201。巨大芽孢桿菌 J2 (Bacillus megaterium J2) CCTCC NO :M209201 菌體為桿狀，G+, 單個或成串排列，菌落圓形、扁平。在含2%氯化鈉的牛肉膏培養(yǎng)基或PDA培養(yǎng)基上生長。 經(jīng)測定，其16S rDNA序列全長為1513bp。用Blast與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進行比對分 析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與數(shù)據(jù)庫中的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的相似性達100%。所以 J2菌被鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)。巨大芽孢桿菌 J2 (Bacillus megaterium J2) CCTCC NO :M209201 的菌液或酶液制 備培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌J2 (Bacillus megaterium J2) CCTCC NO :M209201 發(fā)酵液即 為菌液。將發(fā)酵菌液經(jīng)除菌后，經(jīng)常規(guī)的酶液制備方法處理，即為酶液。經(jīng)固定化材料處 理，即為固定化酶。
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酶的固定化將巨大芽孢桿菌J2 (Bacillus megaterium J2) CCTCC NO :M209201 發(fā)酵獲得的酶 液，經(jīng)常規(guī)的固定化酶制備方法即可得到固定化酶。將固定化酶加入甜菊糖轉(zhuǎn)化液中，在一定條件下轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化液經(jīng)常規(guī)的分離純化 可得高純度甜菊雙糖苷產(chǎn)品。時間對甜菊糖SS轉(zhuǎn)化的影響在(W/W)甜菊糖轉(zhuǎn)化液中加一定量的固定化酶，相同轉(zhuǎn)化條件下轉(zhuǎn)化6d，考察 轉(zhuǎn)化時間對固定化酶轉(zhuǎn)化的影響。由圖1可見，在0至4d時，SS的轉(zhuǎn)化速率相對穩(wěn)定，在 第5d時轉(zhuǎn)化速度降低，此時甜菊糖SS轉(zhuǎn)化率達到91. 92%，至第6d時轉(zhuǎn)化率達到93. 5%。固定化酶的回收及再利用回收轉(zhuǎn)化液濾出固定化酶，0. 9%氯化鈉溶液洗滌。再利用甜菊糖轉(zhuǎn)化液加固定化酶，在一定轉(zhuǎn)化條件下轉(zhuǎn)化5d，比較與初次利用 固定化酶相比轉(zhuǎn)化SS的性能。表1固定化酶回收次數(shù)對甜菊糖轉(zhuǎn)化的影響 由表1可見，經(jīng)4次的固定化酶的回收，SS轉(zhuǎn)化率由96. 45%降到55. 72%，而RA 相對含量由29. 19%分別增加到91. 95%和48. 19%，相對酶活力降為原來的57. 77%，表明 固定化酶經(jīng)重復(fù)使用4次后仍保有較高的轉(zhuǎn)化活力。實施例1 將一定量的甜菊糖溶解到一定量的水中，即成為甜菊糖轉(zhuǎn)化液，具體濃度見各實 施例。0. 5% (ff/ff)、pH 5. 0甜菊糖轉(zhuǎn)化液(SS純度約為85% )，不滅菌或滅菌冷卻后接 5% (W/W)巨大芽孢桿菌J2 CCTCC N0:M209201固定化酶，37°C轉(zhuǎn)化72h，經(jīng)轉(zhuǎn)化后SS被大 部分降解，RA含量不變。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，5000r/min離心，上清液經(jīng)絮凝沉淀除雜、大孔樹脂吸 附分離，純化液結(jié)晶后獲得甜菊雙糖苷。實施例2 0.01% (ff/ff)、pH 4. 5甜菊糖轉(zhuǎn)化液(SS純度約為75% )，加2% (W/W)巨大芽孢 桿菌J2CCTCC NO :M209201的固定化酶，37°C培養(yǎng)36h后，按常規(guī)的分離純化獲得純度約為 90%的甜菊雙糖苷。實施例3:3% (ff/ff)、pH 5. 5甜菊糖轉(zhuǎn)化液(SS純度約為70% )，加10% (ff/ff)巨大芽孢桿 菌J2CCTCC NO :M209201產(chǎn)的固定化酶，60°C轉(zhuǎn)化20h。結(jié)束后，分離純化獲得純度約為75% 的甜菊雙糖苷。
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實施例4 5% (ff/ff)、pH 5.0甜菊糖轉(zhuǎn)化液(SS純度約為80 % )，加0. 1 % (W/W)巨大芽孢 桿菌J2CCTCC N0:M209201產(chǎn)的固定化酶，28°C轉(zhuǎn)化100h。結(jié)束后，分離純化獲得純度約為 92%的甜菊雙糖苷。實施例5 3% (ff/ff)、pH 2.0甜菊糖轉(zhuǎn)化液(SS純度約為45% )，加10% (W/W)固定化酶， 28°C培養(yǎng)120h。結(jié)束后，分離純化獲得純度約為55%的甜菊雙糖苷。實施例6 4% (ff/ff)、pH 9. 0甜菊糖轉(zhuǎn)化液(RA純度約為75% )，加0. 1 % (ff/ff)固定化酶， 45°C轉(zhuǎn)化60h。結(jié)束后，分離純化獲得純度約為80%的甜菊雙糖苷。實施例7 0. 1 % (ff/ff)、pH 5. 0甜菊糖轉(zhuǎn)化液(SS純度約為70% )，加10% (ff/ff)固定化酶， 40°C培養(yǎng)150h。結(jié)束后，分離純化獲得純度約為85%的甜菊雙糖苷。實施例8:2 % (ff/ff)、pH 5.0甜菊糖轉(zhuǎn)化液(SS純度約為60 % )，加2 % (ff/ff)固定化酶， 50°C轉(zhuǎn)化2h。結(jié)束后，分離純化獲得純度約為62%的甜菊雙糖苷。實施例9 2 % (ff/ff)、pH 5.0甜菊糖轉(zhuǎn)化液(SS純度約為58 % )，加2 % (ff/ff)固定化酶， 30°C培養(yǎng)150h后，分離純化獲得純度約為90%的甜菊雙糖苷。實施例10 1. 5% (ff/ff)、pH 5.5甜菊糖轉(zhuǎn)化液(SS純度約為65% )，加0. 1 % (ff/ff)固定化 酶，30°C培養(yǎng)30h后，分離純化獲得純度約為88%的甜菊雙糖苷。實施例11 2% (ff/ff)、pH 5. 0甜菊糖轉(zhuǎn)化液(SS純度約為72% )，加0. 1 % (ff/ff)固定化酶， 40°C轉(zhuǎn)化40h后，分離純化獲得純度約為87%的甜菊雙糖苷。實施例12 3% (ff/ff)、pH 5. 4甜菊糖轉(zhuǎn)化液(SS純度約為38% )，加2. 5% (ff/ff)固定化酶， 35°C培養(yǎng)100h后，分離純化獲得純度約為95%的甜菊雙糖苷。實施例13 2% (ff/ff)、pH 5. 0甜菊糖轉(zhuǎn)化液(SS純度約為10% )，加0. 1 % (ff/ff)固定化酶， 35°C培養(yǎng)120h后，分離純化獲得純度約為92%的甜菊雙糖苷。實施例14 10% (ff/ff)、pH 5.0甜菊糖轉(zhuǎn)化液，加0. 5% (ff/ff)固定化酶，35°C培養(yǎng)120h后， 分離純化獲得純度約為93%的甜菊雙糖苷。實施例15 6% (ff/ff)、pH 5. 0甜菊糖轉(zhuǎn)化液，加0. 3% (ff/ff)固定化酶，35°C培養(yǎng)120h后，分 離純化獲得純度約為93%的甜菊雙糖苷。實施例16 與實施例1相似，所不同的是轉(zhuǎn)化液所加入的為游離菌。
7實施例17
與實施例1相似，所不同的是轉(zhuǎn)化液所加入的酶為游離酶。 實施例18
與實施例1相似，所不同的是所用高分子材料為殼聚糖。 實施例19
與實施例1相似，所不同的是所用聚合材料為聚乙烯醇。 實施例20
與實施例1相似，所不同的是所用高分子材料為卡拉膠。 實施例21
與實施例1相似，所不同的是所用高分子材料為明膠。
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權(quán)利要求
一種生物轉(zhuǎn)化甜菊糖為甜菊雙糖苷的方法，包括將巨大芽孢桿菌J2(Bacillus megaterium J2)CCTCC NOM209201菌種接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，進行產(chǎn)酶發(fā)酵，用菌或游離酶或固定化酶，轉(zhuǎn)化甜茶糖中的甜菊苷，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離菌或酶、除雜處理后，經(jīng)進一步分離純化得到甜菊雙糖苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化甜菊糖為甜菊雙糖苷的方法，其特征在于，用固定 化酶進行轉(zhuǎn)化，固定化酶所使用的固定化材料是海藻酸鈉、聚乙烯醇、卡拉膠、殼聚糖、明膠 或其他固定化酶或固定化細胞所用的來源于生物或合成的材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化甜菊糖為甜菊雙糖苷的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化體 系中的pH值為2.0 9.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化甜菊糖為甜菊雙糖苷的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化體 系的溫度為常溫或20 60°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化甜菊糖為甜菊雙糖苷的方法，其特征在于，溶液中 甜菊苷的重量比0.01 10%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化甜菊糖為甜菊雙糖苷的方法，其特征在于所用轉(zhuǎn)化 體系是用游離菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化甜菊糖為甜菊雙糖苷的方法，其特征在于所用轉(zhuǎn)化 體系是用游離酶。
全文摘要
本發(fā)明利用微生物或酶對甜菊苷轉(zhuǎn)化得到甜菊雙糖苷產(chǎn)品，可利用微生物或游離酶或固定化酶的方法，在甜菊糖濃度0.01％～10％(W/W)、溫度28～60℃、固定化酶量0.1％～10％(W/W)、pH2.0～9.0的條件下轉(zhuǎn)化2h～120h，使甜菊糖原料以96.45％的轉(zhuǎn)化率得到甜菊雙糖苷產(chǎn)品，轉(zhuǎn)化工藝具有較好的反應(yīng)穩(wěn)定性，固定化酶具有重復(fù)利用及可回收性。該方法操作簡單、成本低，在應(yīng)用甜菊糖制備甜菊雙糖苷方面具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/11GK101857890SQ20101017078
公開日2010年10月13日 申請日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者劉潤薇, 劉虎, 周惠, 姜中玉, 鄭丹, 陳育如 申請人:南京師范大學(xué)