專利名稱：一種紫杉醇產(chǎn)生菌發(fā)酵紅豆杉枝葉生產(chǎn)紫杉醇新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紫杉醇產(chǎn)生菌株的分離選育方法和利用該菌株發(fā)酵紅豆杉枝葉 轉(zhuǎn)化紫杉醇前體物，提高紫杉醇得率的工藝技術(shù)。
背景技術(shù)：
紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，由紅豆杉樹干、樹皮或針 葉中提取或半合成的有效成分，也是目前所了解的惟一一種可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚 合微管的藥物。通過II-III臨床研究，紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸 癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。由于其作用機制獨特，對很多耐藥 病人有效，成為目前最熱門的抗腫瘤藥物之一。紅豆杉是一種生長緩慢的喬木，分布于北半球的溫帶至亞熱帶地區(qū)，我國有四種 和一個變種(南方紅豆杉)，但是全世界資源總量卻極其有限，散生分布于天然林中。目前 全世界的紫杉醇需求量在每年數(shù)十至數(shù)百噸紫杉醇純品，尋求新的來源成為主要的研究方 向。1、從紅豆杉的不同部位提取紫杉醇主要通過紅豆杉樹皮提取生產(chǎn)紫杉醇，但是對野生資源破壞巨大，人們試圖從紅 豆杉植株的其他部位提取以擴大紫杉醇來源，Keith Witherup測定了 6種紅豆杉枝葉和莖 中的紫杉醇含量，發(fā)現(xiàn)針葉中的紫杉醇含量較高。2、良種繁育、人工栽培為彌補天然資源的奇缺，國內(nèi)外的工作人員進(jìn)行紅豆杉良種選育和扦插快繁技術(shù) 研究，其中賓夕法尼亞大學(xué)國家天然產(chǎn)物技術(shù)中心已篩選出高紫杉醇含量的植株供人工栽 培，美國農(nóng)業(yè)部和密西西比大學(xué)聯(lián)合栽培紅豆杉規(guī)模達(dá)數(shù)百萬株，3 5年即可收割。3、化學(xué)合成紫杉醇①全合成紫杉醇美國佛羅里達(dá)州立大學(xué)的化學(xué)教授豪頓以樟腦為起始材料，采用線性合成法，于 1993年12月完成紫杉醇全合成；Scipps研究所1992年報告先合成兩個六元環(huán)，再將其連 續(xù)形成以八元環(huán)為中心的中間體，然后再合成四元環(huán)，從而完成紫杉醇的全合成。但是兩種 全合成途徑都包括25 30步的化學(xué)反應(yīng)復(fù)雜過程，距工業(yè)化生產(chǎn)尚有很大距離。②半合成紫杉醇1988年，法國Denis首次報道了從歐洲紅豆杉的針葉中獲得10-乙酰漿果赤 霉素IlKbaccatin-III)，以此為原料半合成了紫杉醇及其同系物texotere。隨后美國 Rhone-Poulene Rorer化學(xué)公司也實現(xiàn)了紫杉醇的半合成，并申請了以baccatin-III為原 料半合成紫杉醇的專利。美國BMS公司計劃在獲得美國FDA批準(zhǔn)后，停止從樹皮中萃取紫 杉醇的生產(chǎn)活動，利用半合成法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇。4、利用植物細(xì)胞工程方法生產(chǎn)紫杉醇利用植物細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)紫杉醇，該方法曾經(jīng)一度是各種研究方向中十分有吸引力的一個方向，也是1990年美國NCI主持召開的紫杉醇研討會上，得到NCI投資的方向之 一，但是十年來沒有突破性進(jìn)展。5、紫杉醇類似物目前世界各國科學(xué)家從紅豆杉屬植物中分離得到200多種化合物，都具有紫杉烷 三環(huán)二萜的基本骨架，部分具有抗腫瘤活性。綜合分析，目前國內(nèi)外對紫杉醇的研究方向很多，但是沒有成型的可進(jìn)行工業(yè)化 生產(chǎn)，主要原因為紅豆杉資源不足，栽培的樹種生長緩慢，不能短時間內(nèi)提供足夠原料；紫 杉醇分子式結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難進(jìn)行化學(xué)合成的工業(yè)化生產(chǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)方法由于發(fā)酵周期長且 高產(chǎn)細(xì)胞株選育耗時長，中試投產(chǎn)都有一定困難。于是，國內(nèi)外學(xué)者開始轉(zhuǎn)向真菌發(fā)酵法生 產(chǎn)紫杉醇，目前遇到的關(guān)鍵問題是紫杉醇產(chǎn)生菌的分離和發(fā)酵液中紫杉醇含量的提高成為 技術(shù)瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
為進(jìn)行紫杉醇的工業(yè)化生產(chǎn)，本發(fā)明通過生產(chǎn)實踐，研究出一種新型的紫杉醇生 產(chǎn)工藝。包括以下步驟1、紫杉醇產(chǎn)生菌的選育采用分離自南方紅豆杉韌皮部的真菌，經(jīng)過紫外線誘變， 篩選出紫杉醇前體物轉(zhuǎn)化活性強、增殖速度快的“WM20094001”號菌株作為生產(chǎn)菌株。2、"WM20094001，，號菌株斜面培養(yǎng)基配方為固體MS培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)基為液體MS 培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基為液體MS培養(yǎng)基。3、紫杉醇生產(chǎn)菌發(fā)酵72h左右的發(fā)酵液用自行研制的營養(yǎng)液稀釋5倍后，拌入經(jīng) 前處理的紅豆杉枝葉，20°C 25°C條件下處理120h左右，轉(zhuǎn)化紫杉醇前體物。4、紅豆杉枝葉處理采用熱蒸汽瞬時表面脫蠟和消毒，平鋪于發(fā)酵床上，采用通風(fēng) 發(fā)酵的方式進(jìn)行發(fā)酵。5、發(fā)酵后，機械攪拌成糊狀，加入三倍體積95%乙醇，攪拌均勻，靜置浸提30min， 提取液經(jīng)離心去渣，于40°C以下真空干燥，獲得浸膏狀產(chǎn)品。本發(fā)明的創(chuàng)新體現(xiàn)在以下幾個方面①工藝技術(shù)創(chuàng)新利用本發(fā)明的工藝技術(shù)，生產(chǎn)過程中一致保持較低溫度(40°C 以下)，不破壞紫杉醇結(jié)構(gòu)，提高得率，同時不涉及原料干燥等步驟，低能耗且無三廢排放。②原始創(chuàng)新選育出的紫杉醇生產(chǎn)菌作為唯一的生產(chǎn)菌株，轉(zhuǎn)化紅豆杉枝葉中的 紫杉醇前體物提高紫杉醇產(chǎn)率，是以前的研究從來沒有提到的。本發(fā)明采用南方紅豆杉中分離的紫杉醇產(chǎn)生菌，接種到經(jīng)脫蠟、消毒處理的紅豆 杉枝葉材料中，進(jìn)行保溫發(fā)酵，利用紅豆杉枝葉中的紫杉醇前體物生物合成紫杉醇。不僅解 決了以紅豆杉樹皮為原料的生產(chǎn)紫杉醇的原材料短缺問題，又規(guī)避了化學(xué)合成法的復(fù)雜化 學(xué)反應(yīng)過程控制問題，利用選育的天然微生物進(jìn)行發(fā)酵，細(xì)胞株選育時間短，投產(chǎn)容易上規(guī) 模，提取工藝簡單，徹底解決了工業(yè)化生產(chǎn)的各種限制因素。
具體實施例方式通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述實施例一
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1材料與儀器南方紅豆杉新鮮枝葉原料(六安市研誠農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司提供)，氫氧化鈉、 鹽酸、葡萄糖、(NH4)2NO3 KH2PO4 MgSO4 FeSO4等均為國產(chǎn)分析純，馬鈴薯等從當(dāng)?shù)厥?場購置。超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、全自動中試用不銹鋼發(fā)酵罐(S⑶1000)、5m3儲液 罐、通風(fēng)發(fā)酵池(1. 2mX0. 8mX 8m)，工業(yè)用離心機、真空干燥設(shè)備、板框壓濾機、酒精回收設(shè) 備(JS-500)2實驗方法2. 1紫杉醇生產(chǎn)菌培養(yǎng)生產(chǎn)菌株細(xì)極鏈格孢“WM20094001”號菌株，由六安市西山生物技術(shù)有限責(zé)任公 司科研人員分離自大別山區(qū)生長的鮮活南方紅豆杉韌皮部，經(jīng)過紫外線誘變，篩選出的紫 杉醇前體物活性最強、增殖速度最快的一個菌株。斜面種子培養(yǎng)基固體MS培養(yǎng)基。液體種子培養(yǎng)基液體MS培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基液體MS培養(yǎng)基。菌液制作取活化的斜面菌種，接種于種子培養(yǎng)基中，每只搖瓶接1環(huán)，在搖床上 150r/min, 25°C培養(yǎng)72h左右，作為種子液，按5%比例接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，1. 8L/min的通 氣量25°C培養(yǎng)72h左右，用4倍于發(fā)酵液體積的液體基本MS培養(yǎng)基稀釋，作為接種菌液。2. 2原料發(fā)酵(紅豆杉枝葉中紫杉醇前體物轉(zhuǎn)化)紅豆杉新鮮枝葉經(jīng)過125°C蒸汽處理Imin左右，溫度冷卻至室溫后，平鋪于通風(fēng) 發(fā)酵池的發(fā)酵床上，均勻噴灑紫杉醇生產(chǎn)用接種菌液，22°C 士3°C條件下處理120h完成發(fā) 酵過程。③將發(fā)酵后的紅豆杉枝葉，機械打碎成漿，加入3倍于漿狀物體積的95%乙醇，攪 拌均勻，靜置后分層，傾出上清液，沉淀層采用板框壓濾機壓濾，濾液與傾出的上清液合并 后離心除去雜質(zhì)，進(jìn)行低溫真空干燥，獲得膏狀紫杉醇粗品，回收乙醇可循環(huán)使用。3 結(jié)論利用細(xì)極鏈格孢“WM20094001”號菌株，通過上述工藝流程進(jìn)行紅豆杉新鮮枝葉處 理，獲得的紫杉醇比新鮮枝葉直接提取紫杉醇得率提高1. 2倍。實驗結(jié)果證明，采用本方法生產(chǎn)的紫杉醇，生產(chǎn)條件溫和，對紅豆杉枝葉中含有的 紫杉醇結(jié)構(gòu)損傷小，同時盡最大程度的轉(zhuǎn)化了紫杉醇前體物，節(jié)約了資源，提高了紫杉醇得 率，并且能耗少，無污染，有利于環(huán)境保護(hù)和野生紅豆杉資源。特別說明以上對本發(fā)明的優(yōu)選實施例方式作了詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于上 述實施方式，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還可以在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下作出其它等效變 化和修飾。
權(quán)利要求
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)紫杉醇新菌種，其特征是所述的新菌種為從本地野生南方紅豆杉樹皮中分離篩選的菌株，該菌株于2007年委托中國微生物菌種保藏中心(CGMCC)作專利保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)紫杉醇新菌種發(fā)酵紅豆杉枝葉生產(chǎn)紫杉醇方法，其特征是(1)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基采用液體MS培養(yǎng)基；(2)紅豆杉枝葉處理紅豆杉新鮮枝葉經(jīng)過125°C蒸汽處理Imin左右，溫度冷卻至室溫 后，平鋪于通風(fēng)發(fā)酵池的發(fā)酵床上。(3)發(fā)酵培養(yǎng)取活化的斜面菌種，接種于液體MS培養(yǎng)基中，每只搖瓶接1環(huán)，在搖床 上150r/min，25°C培養(yǎng)72h左右，作為種子液，按5%比例接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，1. 8L/min的 通氣量25°C培養(yǎng)72h左右，用4倍于發(fā)酵液體積的液體基本MS培養(yǎng)基稀釋，作為紫杉醇生 產(chǎn)用接種菌液，均勻噴灑于處理好的紅豆杉枝葉上，22°C 士3°C條件下通風(fēng)發(fā)酵120h完成 發(fā)酵過程。(4)紫杉醇的提取將發(fā)酵后的紅豆杉枝葉，機械打碎成漿，加入3倍于漿狀物體積的 95 %乙醇，攪拌均勻，靜置后分層，傾出上清液，沉淀層采用板框壓濾機壓濾，濾液與傾出的 上清液合并后離心除去雜質(zhì)，進(jìn)行低溫真空干燥，獲得膏狀紫杉醇粗品，回收乙醇可循環(huán)使用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)紫杉醇菌株發(fā)酵南方紅豆杉枝葉生產(chǎn)紫杉醇的新方法。其特征是產(chǎn)紫杉醇菌株的菌種培養(yǎng)采用固體MS培養(yǎng)基，發(fā)酵采用液體MS培養(yǎng)基；將紅豆杉新鮮枝葉經(jīng)清洗、脫蠟、消毒處理后作為發(fā)酵主原料，發(fā)酵菌株添加液體基本MS培養(yǎng)基調(diào)配后接種，在22℃±3℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程完成后再經(jīng)浸提、純化、干燥處理，獲得膏狀紫杉醇粗提物。本發(fā)明的產(chǎn)紫杉醇菌株培養(yǎng)方法簡單；發(fā)酵紅豆杉枝葉過程中對紫杉醇前體轉(zhuǎn)化效率較高，同時整個過程溫度不高于40℃，不破壞紫杉醇結(jié)構(gòu)，提高了紫杉醇的提取率。
文檔編號C12R1/645GK101892162SQ201010170989
公開日2010年11月24日 申請日期2010年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月24日
發(fā)明者萬賓, 劉體云, 李耀亭, 潘勤, 熊春盛, 程斌, 鄭蕾 申請人:程斌