專利名稱：采用熒光定量pcr技術檢測常見致病菌的寡核苷酸引物及其檢測常見致病菌的方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種致病菌檢測技術領域，特別是涉及一種方便快捷、準確、高效和應 用范圍廣的采用熒光定量PCR技術檢測常見致病菌的寡核苷酸引物及其檢測常見致病菌 的方法和用途。
背景技術：
眾所周知，致病菌檢測在疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品中毒檢測、進出口食品檢疫、科 學研究等領域中有著重要的應用。傳統(tǒng)的致病菌檢驗方法仍停留在分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生 化鑒定和血清學分型水平，不僅花費的時間長，而且無法對難以培養(yǎng)的病原菌進行有效檢 測，且只能對有限的種類進行逐個的檢測。隨著科學技術的發(fā)展，一些新的技術可以實現(xiàn) 對致病菌的快速檢測或定量檢測或同時高通量檢測，如常規(guī)PCR技術、定量PCR技術、多重 PCR、生物芯片技術等，它們均存在一定的不足。常規(guī)PCR可以實現(xiàn)對微生物尤其是致病菌的快速檢測，但不能對待檢的致病菌進 行定量，而且一次實驗只能檢測一種致病菌，效率低；定量PCR可以對待檢致病菌進行定量 檢測，但一次實驗只能檢測一種待檢致病菌，不能實現(xiàn)對致病菌的高通量(同時)檢測；多重 PCR和基因芯片雖然具備一次同時檢測幾種致病菌的能力，但這兩種方法的最大不足就是 不能對待檢致病菌進行定量，此外，多重PCR對引物的要求較高，且有電泳階段，容易發(fā)生 交叉感染，引起假陽性的發(fā)生；基因芯片需要設計探針。

發(fā)明內容
本發(fā)明為解決公知技術中存在的技術問題而提供一種方便快捷、準確、高效和應 用范圍廣的采用熒光定量PCR技術檢測常見致病菌的寡核苷酸引物及其檢測常見致病菌 的方法和用途。本發(fā)明為解決公知技術中存在的技術問題，所采取的技術方案是一種采用熒光 定量PCR技術檢測常見致病菌的寡核苷酸引物，包含以下各對引物的全部或部分引物的組 合
蠟樣芽胞桿菌 Bc-gyrB-1 5，-GCTTCACCATCTTGTTTGG-3， Bc-gyrB-2 5' -CGCCCATTATCCGTTACA-3‘ 阪崎腸桿菌 Es-ompA-1 5’ - GCTGAGCGTAGGTGTTTCCT-3’ Es-ompA-2 5’ -CAGGGTGAAGTGCTTGGTCT-3’ 副溶血性弧菌 Vp-tdh-1 5’ - AATGGTTGACATCCTACATGACTG-3， Vp-tdh-2 5’ - ACTTGACCTGATTTTACGAACACA -3’
腸出血性大腸桿菌 0157 0157-eae-l 5’ - TTACCAGCGATACCAAGAGC -3， 0157-eae-2 5’ - CAACATGACCGATGACAAGG -3， 沙門氏菌Sal-fim-1 5，- TACCAACCGGCAAGGCATAA -3，
4Sal-fim-2 5’ - GACACCGCCGTTTAAGAAATG -3，
單核細胞增生李斯特氏菌 Lm-hly-1 5，- GGGAAATCTGTCTCAGGTGATGT -3， Lm-hly-2 5， -CGATGATTTGAACTTCATCTTTTGC-3， 志賀氏菌Sf-ipa-1 5，- CCGGGATAAAGTCAGAACTC -3，
Sf-ipa-2 5’ - CTCCCGACACGCCATAGAAA -3’
空腸彎曲菌 Cj-htp-1 5，- CTGAATTTGATACCTTAAGTGCAGC -3， Cj-htp-2 5’ - AGGCACGCCTAAACCTATAGCT -3， 銅綠假單胞桿菌 Pa-gyr-1 5，- CAAGCCCTACAAGAAATCCG -3， Pa-gyr-2 5’ - TCCACCGAACCGAAGTTG -3，
肺炎克雷伯氏桿菌 Kp-pho-1 5，- TGCCCAGACCGATAACTTTA -3，
Kp-pho-2 5， - CTGTTTCTTCGCTTCACGG -3， 所述引物長度為15-30bp，堿基成分中G+C含量40%-60%，避免形成穩(wěn)定的寡核苷酸引 物二聚體和發(fā)夾結構，產物長度在100 200bp，所有寡核苷酸引物具有相似的Tm值。所述引物長度優(yōu)選為18_25bp。所述的寡核苷酸引物用于檢測常見致病菌的方法，包括以下步驟查詢目標致病 菌的特異保守基因，以此為靶基因設計寡核苷酸引物，使其退火溫度在50 60°C之間；對 檢測樣品進行處理，提取核酸模板；將模板分別加入裝有不同特異寡核苷酸引物對的小管 中，再加入相應的熒光定量PCR試劑；在同一輪熒光定量PCR循環(huán)下，使各寡核苷酸引物在 各自的反應管中對樣品進行同時、快速和定量檢測。所述各菌的引物的退火溫度差在0_5°C之間。所述熒光定量PCR條件為預變性94°C、20秒，變性94°C、5 秒，退火60°C、31秒，40個循環(huán)。所述的常見致病菌包括蠟樣芽胞桿菌、阪崎腸桿菌、副溶血性弧菌、腸出血性大腸 桿菌0157、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、銅綠假單胞桿菌、 肺炎克雷伯氏桿菌、霍亂弧菌、小腸結腸耶爾森氏菌、創(chuàng)傷弧菌、腸球菌、變形桿菌、肉毒梭 狀芽孢桿菌、血溶性鏈球菌或產氣莢膜梭菌的一種或幾種的組合。所述的檢測樣品源于血液、痰液的臨床標本，水、食品、大氣、土壤環(huán)境中的致病菌 組分。所述的寡核苷酸引物用于檢測常見致病菌的方法，在提供臨床疾病數(shù)據(jù)、環(huán)境監(jiān) 測與評價、水質與食品的監(jiān)督與檢測、食物中毒病源菌檢測、細菌學分類與流行病學調查、 生物戰(zhàn)劑檢測中的應用。本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是采用特異寡核苷酸引物和熒光定量PCR技 術在同一 PCR循環(huán)中同時對多種致病菌進行鑒別和快速、定量檢測，方便快捷，準確，高效 和應用范圍廣，可廣泛用于臨床疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測與評價、水質與食品的監(jiān)督與檢測、食 物中毒病源菌檢測、細菌學分類與流行病學調查、生物戰(zhàn)劑檢測。
具體實施例方式為能進一步了解本發(fā)明的發(fā)明內容、特點及功效，茲例舉以下實施例，詳細說明如 下本發(fā)明采用熒光定量PCR技術檢測常見致病菌的寡核苷酸引物，包含以下各對引物的 全部或部分引物的組合
蠟樣芽胞桿菌 Bc-gyrB-1 5，-GCTTCACCATCTTGTTTGG-3， Bc-gyrB-2 5' -CGCCCATTATCCGTTACA-3‘ 阪崎腸桿菌 Es-ompA-1 5’ - GCTGAGCGTAGGTGTTTCCT-3’ Es-ompA-2 5’ -CAGGGTGAAGTGCTTGGTCT-3’ 副溶血性弧菌 Vp-tdh-1 5’ - AATGGTTGACATCCTACATGACTG-3， Vp-tdh-2 5’ - ACTTGACCTGATTTTACGAACACA -3’
腸出血性大腸桿菌 0157 0157-eae-l 5’ - TTACCAGCGATACCAAGAGC -3， 0157-eae-2 5’ - CAACATGACCGATGACAAGG -3， 沙門氏菌Sal-fim-1 5，- TACCAACCGGCAAGGCATAA -3，
Sal-fim-2 5’ - GACACCGCCGTTTAAGAAATG -3，
單核細胞增生李斯特氏菌 Lm-hly-1 5，- GGGAAATCTGTCTCAGGTGATGT -3， Lm-hly-2 5， -CGATGATTTGAACTTCATCTTTTGC-3， 志賀氏菌Sf-ipa-1 5，- CCGGGATAAAGTCAGAACTC -3，
Sf-ipa-2 5’ - CTCCCGACACGCCATAGAAA -3’
空腸彎曲菌 Cj-htp-1 5，- CTGAATTTGATACCTTAAGTGCAGC -3， Cj-htp-2 5’ - AGGCACGCCTAAACCTATAGCT -3， 銅綠假單胞桿菌 Pa-gyr-1 5，- CAAGCCCTACAAGAAATCCG -3， Pa-gyr-2 5’ - TCCACCGAACCGAAGTTG -3，
肺炎克雷伯氏桿菌 Kp-pho-1 5，- TGCCCAGACCGATAACTTTA -3，
Kp-pho-2 5， - CTGTTTCTTCGCTTCACGG -3， 所述引物長度為15-30bp，堿基成分中G+C含量40%-60%，且上下游寡核苷酸引物序 列GC含量的差異不要太大，避免形成穩(wěn)定的寡核苷酸引物二聚體和發(fā)夾結構，產物長度在 100 200bp，所有寡核苷酸引物具有相似的Tm值。所述引物長度優(yōu)選為18-25bp。所述的寡核苷酸引物用于檢測常見致病菌的方法，包括以下步驟查詢目標致病 菌的特異保守基因，以此為靶基因設計寡核苷酸引物，使其退火溫度在50 60°C之間；對 檢測樣品進行處理，提取核酸模板；將模板分別加入裝有不同特異寡核苷酸引物對的小管 中，再加入相應的熒光定量PCR試劑；在同一輪熒光定量PCR循環(huán)下，使各寡核苷酸引物在 各自的反應管中對樣品進行同時、快速和定量檢測。所述各菌的引物的退火溫度差在0_5°C之間。所述熒光定量PCR條件為預變性94°C、20秒，變性94°C、5 秒，退火60°C、31秒，40個循環(huán)。所述的常見致病菌包括蠟樣芽胞桿菌、阪崎腸桿菌、副溶血性弧菌、腸出血性大腸 桿菌0157、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、銅綠假單胞桿菌、 肺炎克雷伯氏桿菌、霍亂弧菌、小腸結腸耶爾森氏菌、創(chuàng)傷弧菌、腸球菌、變形桿菌、肉毒梭 狀芽孢桿菌、血溶性鏈球菌或產氣莢膜梭菌的一種或幾種的組合。所述的檢測樣品源于血液、痰液的臨床標本，水、食品、大氣、土壤環(huán)境中的致病菌組分。所述的寡核苷酸引物用于檢測常見致病菌的方法，在提供臨床疾病數(shù)據(jù)、環(huán)境監(jiān) 測與評價、水質與食品的監(jiān)督與檢測、食物中毒病源菌檢測、細菌學分類與流行病學調查、 生物戰(zhàn)劑檢測中的應用。下面對本發(fā)明進行具體說明
本發(fā)明可以選用所設計的針對蠟樣芽胞桿菌、阪崎腸桿菌、副溶血性弧菌、腸出血性大 腸桿菌0157、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、銅綠假單胞桿菌 和肺炎克雷伯氏桿菌等的特異寡核苷酸引物全部或部分組合，然后，在同一輪PCR循環(huán)下， 使各寡核苷酸引物在各自的反應管中對樣品進行檢測，以達到同時快速檢測的目的，反應 采用熒光定量PCR，即可同時實現(xiàn)快速、定量的效果。為了達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明需要以下步驟首先根據(jù)檢測的對象或背景資 料確定目標致病菌，搜尋相應致病菌的能應用于檢測目的的特異性、保守基因，然后，在基 因數(shù)據(jù)庫中尋找、比對序列，設計特異寡核苷酸引物之間的退火溫度為(5(T60°C)不相差 5°C，之后，對樣品進行處理，提取核酸模板，然后，將模板分別加入裝有不同特異寡核苷酸 引物對的小管中，再加入相應的熒光定量PCR試劑，在同一輪反應中對所確定的所有目標 致病菌進行定量檢測?？蓪崿F(xiàn)對樣品中的多種不同致病菌進行同時定量檢測。因為熒光定 量PCR儀有96個反應孔，所以，可以對多個樣品進行檢測。如果樣品中含有上述的致病菌， 那么相應的引物管中就會給出熒光定量PCR擴增曲線，通過與標準曲線比較，即可實現(xiàn)準 確定量。這樣在較短的時間內，便可通過一次反應完成多種致病菌的定量檢測，方便快捷。所檢測的致病菌包括常見的致病菌蠟樣芽胞桿菌、阪崎腸桿菌、副溶血性弧菌、腸 出血性大腸桿菌0157、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、銅綠假 單胞桿菌和肺炎克雷伯氏桿菌等，也可以采用該方法，根據(jù)需要添加相應的檢測對象后，應 用于檢測血液、痰液等臨床標本，水、食品、大氣、土壤等環(huán)境中的致病菌組分以及致病菌生 態(tài)評估。特異寡核苷酸引物的設計在本發(fā)明多種致病菌同時、快速、定量檢測方法及其應 用的體系中，特異寡核苷酸引物設計是整個體系中最為重要的因素；特異寡核苷酸引物設 計的步驟如下
(1)登錄GenBank (http://ncbi. nlm. nih. gov/entrez)，在核酸數(shù)據(jù)庫中檢索相關致 病菌的目的基因序列，逐個核對后篩選出測序質量較好的幾組序列；
(2)應用PrimerPremier 5. 0軟件對目的基因序列進行引物設計，寡核苷酸引物設計 原則包括
a.長度一般為15-30bp，常用的是18-25bp。b.堿基成分中G+C含量40%_60%，且上下游寡核苷酸引物序列GC含量的差異不要 太大。c.避免形成穩(wěn)定的寡核苷酸引物二聚體和發(fā)夾結構。d.產物長度在100 200bp比較理想。e.所有寡核苷酸引物應具有相似的Tm值。(3)根據(jù)以上的寡核苷酸引物設計原則，找出適于作為寡核苷酸引物的所有序列， 將候選序列遞交到GenBanK進行BLAST比較，篩選出特異性最好的進行合成。
以下結合實施例對本發(fā)明采用熒光定量PCR技術和特異寡核苷酸引物 檢測常見致病菌的方法及應用做進一步描述。實施例1 以同時檢測水中沙門氏菌和單核細胞增生李斯特氏菌為例
I ·進行沙門氏菌和單核細胞增生李斯特氏菌特異性寡核苷酸引物的設計引物設計 是PCR技術中至關重要的一環(huán)，尤其是在本發(fā)明多種致病菌檢測方法及應用的體系中，它 更是整個體系中最為重要的因素；特異寡核苷酸引物設計的步驟如下
⑴登錄GenBank (http://ncbi.nlm.nih. gov/entrez)，在核酸數(shù)據(jù)庫中檢索沙門氏菌 的目的基因fimA序列和單核細胞增生李斯特氏菌的目的基因hly序列，逐個核對后篩選出 測序質量較好的序列；
⑵應用Primer Premier 5. 0軟件對目的基因序列進行特異寡核苷酸引物設計； ⑶將設計的候選序列遞交到GenBanK進行BLAST比較，篩選出特異性最好的進行合成， 其中，沙門氏菌的引物為 Sal-fim-1 (5，- TACCAACCGGCAAGGCATAA -3，)和 Sal-fim-2 (5，-GACACCGCCGTTTAAGAAATG -3，)，該對引物的PCR產物長度為120bp ；單核細胞增生李斯特 氏菌的引物為 Lm-hly-1 (5，-GGGAAATCTGTCTCAGGTGATGT-3，)和 Lm-hly-2 (5，-CGATGATTT GAACTTCATCTTTTGC-3，)，該對引物的PCR產物長度為106bp。II.沙門氏菌和單核細胞增生李斯特氏菌同時、快速和定量鑒定
⑴模板制備采用煮沸法。取ImL水樣(人為接種5 X IO8CFU沙門氏菌和3 X IO8CFU單 核細胞增生李斯特氏菌)加入1. 5mL Eppendorf管，室溫12000r/min離心2min，棄上清，加 IOOuL滅菌蒸餾水重懸沉淀，隔水煮沸l(wèi)Omin，10000r/min離心2min，取上清作為模板。⑵選擇上述的全部或部分引物的組合，分別添加在各自的小管中，按下表添加個 組份
⑶在ABI7300熒光定量PCR儀上進行反應并選擇下述反應條件 94 0C預變性 20秒
94 0C變性 5秒
60 0C退火 31秒40循環(huán)
⑷反應結束后，通過分析可知，ImL水樣中含有沙門氏菌2 X IO8CFU和IO8CFU單核 細胞增生李斯特氏菌。其優(yōu)點是采用特異寡核苷酸引物和熒光定量PCR技術在同一 PCR循環(huán)中同時對 多種致病菌進行鑒別和快速、定量檢測，方便快捷，準確，高效和應用范圍廣，可廣泛用于臨 床疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測與評價、水質與食品的監(jiān)督與檢測、食物中毒病源菌檢測、細菌學分 類與流行病學調查、生物戰(zhàn)劑檢測。實施例2 以同時檢測食品中志賀氏菌和空腸彎曲菌為例
I ·進行志賀氏菌和空腸彎曲菌特異性寡核苷酸引物的設計寡核苷酸引物設計的步 驟如下
8⑴登錄GenBank (http://ncbi.nlm.nih. gov/entrez)，在核酸數(shù)據(jù)庫中檢索志賀氏菌 的目的基因ipaH序列和空腸彎曲菌的目的基因htp序列，逐個核對后篩選出測序質量較好 的序列；
⑵應用Primer Premier 5. 0軟件對目的基因序列進行特異引物設計； ⑶將設計的候選序列遞交到GenBanK進行BLAST比較，篩選出特異性最好的進行合成， 其中，志賀氏菌的引物為 Sf-ipa-l(5，_ CCGGGATAAAGTCAGAACTC-3，)和 Sf-ipa-2 (5，_CTCC CGACACGCCATAGAAA -3’)，該對引物的PCR產物長度為131bp ；空腸彎曲菌的引物為Cj-htp -1 (5，-CTGAATTTGATACCTTAAGTGCAGC-3，)和 C j-htp-2 (5，- AGGCACGCCTAAACCTATAGCT-3，)， 該對引物的PCR產物長度為86bp。II .志賀氏菌和空腸彎曲菌同時、快速和定量鑒定
⑴模板制備采用煮沸法。取25g待檢熟制烤雞肉(人為接種8X IO8CFU志賀氏菌和 6 X IO8CFU空腸彎曲菌)加入225mL無菌生理鹽水中，均質后，室溫2000r/min離心5min，取 上清室溫12000r/min離心2min，棄上清，沉淀用生理鹽水洗滌3次后，加IOOuL滅菌蒸餾水 重懸，隔水煮沸l(wèi)Omin，10000r/min離心2min，取上清作為模板。⑵選擇權利要求1所述的全部或部分引物的組合，分別添加在各自的小管中，按 下表添加個組份
⑷反應結束后，通過分析可知，每g待檢熟制烤雞肉中含有沙門氏菌2X IO7CFU和 IO7CFU單核細胞增生李斯特氏菌。其優(yōu)點與實施例1相同。實施例3以同時檢測糞便中阪崎腸桿菌、腸出血性大腸桿菌0157為例
I ·進行阪崎腸桿菌、腸出血性大腸桿菌0157特異性引物的設計引物設計的步驟如
下
⑴登錄GenBank (http://nCbi. nlm. nih. gov/entrez)，在核酸數(shù)據(jù)庫中檢索阪崎腸桿 菌的目的基因ompA序列和腸出血性大腸桿菌0157的目的基因eae序列，逐個核對后篩選 出測序質量較好的序列；
⑵應用Primer Premier 5. 0軟件對目的基因序列進行特異引物設計； ⑶將設計的候選序列遞交到GenBank進行BLAST比較，篩選出特異性最好的進行合 成，其中，阪崎腸桿菌的引物為 Es-ompA-1 (5’- GCTGAGCGTAGGTGTTTCCT-3’)和 Es_omp A-2(5’-CAGGGTGAAGTGCTTGGTCT-3，)，該對引物的PCR產物長度為109bp ；腸出血性大腸 桿菌 0157 的引物為 0157-eae-l (5，- TTACCAGCGATACCAAGAGC -3，)和 0157-eae_2 (5，-CAACATGACCGATGACAAGG -3，)，該對引物的 PCR 產物長度為 126bp。II.阪崎腸桿菌、腸出血性大腸桿菌0157同時、快速和定量鑒定
⑴模板制備采用煮沸法。取Ig待檢糞便(人為接種6X106CFU阪崎腸桿菌和 5 X IO6CFU腸出血性大腸桿菌0157)加入20mL無菌生理鹽水中，均質后，室溫2000r/min離 心5min，取上清室溫12000r/min離心2min，棄上清，沉淀用生理鹽水洗滌3次后，加IOOuL 滅菌蒸餾水重懸，隔水煮沸l(wèi)Omin，10000r/min離心2min，取上清作為模板。⑵選擇權利要求1所述的全部或部分引物的組合，分別添加在各自的小管中，按 下表添加個組份
⑶在ABI7300熒光定量PCR儀上進行反應并選擇下述反應條件 94 0C預變性 20秒
94 0C變性 5秒
60 0C退火 31秒40循環(huán)
⑷反應結束后，通過分析可知，每g待檢糞便中含有5 X IO6CFU阪崎腸桿菌和5 X IO8CFU 腸出血性大腸桿菌0157。其優(yōu)點與實施例1相同。實施例4 以同時檢測水中銅綠假單胞桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌、蠟樣芽胞桿菌 和副溶血性弧菌為例
I .進行銅綠假單胞桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌、蠟樣芽胞桿菌和副溶血性弧菌特異性 引物的設計引物設計的步驟如下
⑴登錄GenBank (http //ncbi. nlm. nih. gov/entrez)，在核酸數(shù)據(jù)庫中檢索銅綠假單 胞桿菌目的基因gyrA序列、蠟樣芽胞桿菌目的基因gyrB序列和副溶血性弧菌、肺炎克雷伯 氏桿菌的目的基因tdh序列和phoE序列，逐個核對后篩選出測序質量較好的序列； ⑵應用Primer Premier 5. O軟件對目的基因序列進行特異引物設計； ⑶將設計的候選序列遞交到GenBank進行BLAST比較，篩選出特異性最好的 進行合成，其中，蠟樣芽胞桿菌的引物為Bc-gyrB-1 (5’ -GCTTCACCATCTTGTTTGG-3 ，)禾口 Bc-gyrB-2 (5，-CGCCCATTATC CGTTACA-3，)，該對弓丨物的 PCR 產物長度為 123bp ；銅綠假單胞桿菌的引物為 Pa-gyrA-1 (5’ -CAAGCCCTACAAGAAATCCG-3’)和 Pa-gyrA-2 (5，-TCCACCGAACCGAAGTTG-3，)，該對引物的 PCR 產物長度為 159bp ；副 溶血性弧菌的引物為 Vp-tdh-1 (5，- AATGGTTGACATCCTACATGACTG-3，)和 Vp-tdh-2 (5，- ACTTGACCTGATTTTACGAACACA-3，)，該對引物的 PCR 產物長度為 112bp ；肺炎 克雷伯氏桿菌的引物為 Kp-phoE-1 (5，-TGCCCAGACCGATAACTTTA，)和 Kp-phoE-2 (5’ -CTGTTTCTTCGCTTCACGG-3’)，該對引物的 PCR 產物長度為 142bp。II .銅綠假單胞桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌、蠟樣芽胞桿菌和副溶血性弧菌同時、快 速和定量鑒定⑴模板制備采用煮沸法。取ImL水樣(分別人為接種8 X IO6CFU銅綠假單胞桿菌、肺 炎克雷伯氏桿菌、蠟樣芽胞桿菌和副溶血性弧菌)加入1. 5mL Eppendorf管，室溫12000r/ min離心2min，棄上清，加IOOuL滅菌蒸餾水重懸沉淀，隔水煮沸l(wèi)Omin，10000r/min離心 2min，取上清作為模板。 ⑵選擇權利要求1所述的全部或部分引物的組合，分別添加在各自的小管中，按 下表添加個組份
⑶在ABI7300熒光定量PCR儀上進行反應并選擇下述反應條件 94 0C預變性 20秒
94 0C變性 5秒
60 0C退火 31秒40循環(huán)
⑷反應結束后，通過分析可知，ImL水樣中含有6X IO6CFU銅綠假單胞桿菌、 6 X IO6CFU肺炎克雷伯氏桿菌、7 X IO6CFU蠟樣芽胞桿菌和8 X IO6CFU副溶血性弧菌。其優(yōu)點與實施例1相同。以上所述的實施例僅用于說明本發(fā)明的技術思想及特點，其目的在于使本領域內 的技術人員能夠理解本發(fā)明的內容并據(jù)以實施，不能僅以本實施例來限定本發(fā)明的專利范 圍，即凡本發(fā)明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內。
序列表(SEQUENCE LISTING)
<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所 <120> 采用熒光定量PCR技術檢測常見致病菌的寡核苷酸引物及其檢測常見致病菌 的方法和用途 <160> 20
<170> PatentIn version 3. 3 <210> 1 <211> 19 <212> DNA
<213> 蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus) <400> 1
gcttcaccat cttgtttgg19
<210> 2 <211> 18 <212> DNA
<213> 蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus) <400> 2cgcccattat ccgttaca18
<210> 3 <211> 20 <212> DNA
<213> 阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii) <400> 3
gctgagcgta ggtgtttcct20
<210> 4 <211> 20 <212> DNA
<213> 阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii) <400> 4
cagggtgaag tgcttggtct20
<210> 5 <211> 24 <212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibro parahaemolyticus) <400> 5
aatggttgac atcctacatg actg24
<210> 6 <211> 24 <212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibro parahaemolyticus) <400> 6
acttgacctg attttacgaa caca24
<210> 7 <211> 20 <212> DNA
<213> 腸出血性大腸桿菌0157 (EHEC 0157) <400> 7
ttaccagcga taccaagagc20
<210> 8 <211> 20 <212> DNA
<213> 腸出血性大腸桿菌0157 (EHEC 0157) <400> 8
caacatgacc gatgacaagg20
<210> 9 <211> 20<212>DNA
<213>沙門氏菌(Salmonella sp.)
<400>9
taccaaccgg caaggcataa20
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>沙門氏菌(Salmonella sp.)
<400>10
gacaccgccg tttaagaaat g21
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)
<400>11
gggaaatctg tctcaggtga tgt23
<210>12
<211>25
<212>DNA
<213>單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)
<400>12
cgatgatttg aacttcatct tttgc25
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>志賀氏菌(Shigella flexneri)
<400>13
ccgggataaa gtcagaactc20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>志賀氏菌(Shigella flexneri)
<400>14
ctcccgacac gccatagaaa20
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)
<400>15
13ctgaatttga taccttaagt gcagc25
<210> 16 <211> 22 <212> DNA
<213> 空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni) <400> 16
aggcacgcct aaacctatag ct22
<210> 17 <211> 20 <212> DNA
<213> Wi^fx^-MMM (Pseudomonas aeruginosa) <400> 17
caagccctac aagaaatccg20
<210> 18 <211> 18 <212> DNA
<213> Wi^fx^-MMM (Pseudomonas aeruginosa) <400> 18
tccaccgaac cgaagttg18
<210> 19 <211> 20 <212> DNA
<213> 肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae) <400> 19
tgcccagacc gataacttta20
<210> 20 <211> 19 <212> DNA
<213> 肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae) <400> 20
ctgtttcttc gcttcacgg19
1權利要求
一種采用熒光定量PCR技術檢測常見致病菌的寡核苷酸引物，其特征在于，包含以下各對引物的全部或部分引物的組合 蠟樣芽胞桿菌 Bc gyrB 1 5’ GCTTCACCATCTTGTTTGG 3’Bc gyrB 2 5’ CGCCCATTATCCGTTACA 3’阪崎腸桿菌Es ompA 1 5’ GCTGAGCGTAGGTGTTTCCT 3’Es ompA 2 5’ CAGGGTGAAGTGCTTGGTCT 3’副溶血性弧菌 Vp tdh 1 5’ AATGGTTGACATCCTACATGACTG 3’Vp tdh 2 5’ ACTTGACCTGATTTTACGAACACA 3’腸出血性大腸桿菌O157 0157 eae 1 5’ TTACCAGCGATACCAAGAGC 3’0157 eae 2 5’ CAACATGACCGATGACAAGG 3’沙門氏菌 Sal fim 1 5’ TACCAACCGGCAAGGCATAA 3’Sal fim 2 5’ GACACCGCCGTTTAAGAAATG 3’單核細胞增生李斯特氏菌Lm hly 1 5’ GGGAAATCTGTCTCAGGTGATGT 3’Lm hly 2 5’ CGATGATTTGAACTTCATCTTTTGC 3’志賀氏菌Sf ipa 1 5’ CCGGGATAAAGTCAGAACTC 3’Sf ipa 2 5’ CTCCCGACACGCCATAGAAA 3’空腸彎曲菌 Cj htp 1 5’ CTGAATTTGATACCTTAAGTGCAGC 3’Cj htp 2 5’ AGGCACGCCTAAACCTATAGCT 3’銅綠假單胞桿菌Pa gyr 1 5’ CAAGCCCTACAAGAAATCCG 3’Pa gyr 2 5’ TCCACCGAACCGAAGTTG 3’肺炎克雷伯氏桿菌 Kp pho 1 5’ TGCCCAGACCGATAACTTTA 3’ Kp pho 2 5’ CTGTTTCTTCGCTTCACGG 3’。
2.根據(jù)權利要求1所述的采用熒光定量PCR技術檢測常見致病菌的寡核苷酸引物，其 特征在于，所述引物長度為15-30bp，堿基成分中G+C含量40%-60%，避免形成穩(wěn)定的寡核苷 酸引物二聚體和發(fā)夾結構，產物長度在100 200bp，所有寡核苷酸引物具有相似的Tm值。
3.根據(jù)權利要求2所述的采用熒光定量PCR技術檢測常見致病菌的寡核苷酸引物，其 特征在于，所述引物長度優(yōu)選為18-25bp。
4.含有權利要求1所述的寡核苷酸引物用于檢測常見致病菌的方法，其特征在于，包 括以下步驟查詢目標致病菌的特異保守基因，以此為靶基因設計寡核苷酸引物，，使其退 火溫度在50 60°C之間，對檢測樣品進行處理，提取核酸模板；將模板分別加入裝有不同 特異寡核苷酸引物對的小管中，再加入相應的熒光定量PCR試劑；在同一輪熒光定量PCR循 環(huán)下，使各寡核苷酸引物在各自的反應管中對樣品進行同時、快速和定量檢測。
5.根據(jù)權利要求4所述的寡核苷酸引物用于檢測常見致病菌的方法，其特征在于，所 述各菌的引物的退火溫度差在0-5 °C之間。
6.根據(jù)權利要求4所述的寡核苷酸引物用于檢測常見致病菌的方法，其特征在于，所 述熒光定量PCR條件為預變性94V、20秒，變性94°C、 5秒，退火60°C、31秒，40個循 環(huán)。
7.根據(jù)權利要求4所述的寡核苷酸引物用于檢測常見致病菌的方法，其特征在于，所 述的常見致病菌包括蠟樣芽胞桿菌、阪崎腸桿菌、副溶血性弧菌、腸出血性大腸桿菌0157、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、銅綠假單胞桿菌、肺炎克雷伯 氏桿菌、霍亂弧菌、小腸結腸耶爾森氏菌、創(chuàng)傷弧菌、腸球菌、變形桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、 血溶性鏈球菌或產氣莢膜梭菌的一種或幾種的組合。
8.根據(jù)權利要求4所述的寡核苷酸引物用于檢測常見致病菌的方法，其特征在于，所 述的檢測樣品源于血液、痰液的臨床標本，水、食品、大氣、土壤環(huán)境中的致病菌組分。
9.權利要求4所述的寡核苷酸引物用于檢測常見致病菌的方法，在提供臨床疾病數(shù) 據(jù)、環(huán)境監(jiān)測與評價、水質與食品的監(jiān)督與檢測、食物中毒病源菌檢測、細菌學分類與流行 病學調查、生物戰(zhàn)劑檢測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用熒光定量PCR技術檢測常見致病菌的寡核苷酸引物及其檢測常見致病菌的方法和用途，提供了10對用于該方法中退火溫度(50~60℃)不相差5℃的特異寡核苷酸引物序列，可同時對多種致病菌同時、快速、準確、高效地鑒定和定量檢測。檢測范圍包括蠟樣芽胞桿菌、阪崎腸桿菌、副溶血性弧菌、腸出血性大腸桿菌O157、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、銅綠假單胞桿菌和肺炎克雷伯氏桿菌等。本發(fā)明還可用于疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測、水質與食品的監(jiān)督與檢測、食物中毒病源菌檢測、細菌學分類與流行病學調查、生物戰(zhàn)劑檢測等領域。方便快捷，準確，高效和應用范圍廣。
文檔編號C12N15/11GK101928773SQ20101017222
公開日2010年12月29日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權日2010年5月14日
發(fā)明者孫飛龍, 李君文, 王新為, 諶志強, 邱志剛, 金敏, 陳照立 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所