專利名稱：海洋甲殼類動物支原體培養(yǎng)基及分離純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到一種支原體培養(yǎng)基及分離純化方法。
背景技術：
現(xiàn)有的支原體屬于原核細胞生物，是目前能在無活性細胞培養(yǎng)基中獨立生存、 自我繁殖的最小微生物，無細胞壁結構，有高度的多形性，可透過微孔濾膜。支原體除了 能引起人類傳染病外，還能引起家畜、家禽和作物病害(Razin S. Peculiar properties ofmycoplasmas :the smallest self-replicating prokaryotes. FEMS Microbiol Lett, 1992,79(1-3) :423_431.)。自1937年分離出第一株人系支原體以來，迄今已有120余種 支原體被陸續(xù)報道，且多見于哺乳動物和節(jié)支動物昆蟲綱種類(Razin S. Yogev D. Naot Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiol Mol Biol Rev. 1998,62(4) :1094_1156.)。然而有關甲殼綱的支原體，目前國內(nèi)外均極少報道。楊季 芳等(楊季芳，中國對蝦枝原體超微結構及宿主的主要超微病理變化，海洋與湖沼，1997， Vol. 28，No. 2 ；楊季芳，中國對蝦流行性肝胰腺壞死綜合癥研究I病毒和類枝原體合并感染 對蝦肝胰腺，1993，東海海洋，Vol 11，N03，34-39.)從養(yǎng)殖中國對蝦腸道結節(jié)病和白斑綜合 癥中發(fā)現(xiàn)支原體與細菌及支原體與白斑綜合癥病毒的混合感染。無致病性支原體在環(huán)境中 大量存在并在健康動物體內(nèi)長期存在，攜帶支原體的動物在沒有受到應激脅迫之前并不會 表現(xiàn)任何癥狀。然而，從患病死亡的對蝦眼、鰓、腦中分離的支原體純培養(yǎng)物能夠使健康對 蝦發(fā)病，或使健康動物更容易受到病毒和細菌的感染(Ghadersohi A5Leigh 0. Isolation, charactersation and DNA analysis of Mycoplasma spp. from moribund prawnsPenaeus monodon cultured in Austualia. Dis Aquat Org, 1999, 35 :53_61)。對甲殼動物支原體進行科學研究，首要要解決的瓶頸問題是制備適合甲殼動物支 原體體外生長繁殖的培養(yǎng)基。目前用于人類及畜禽支原體培養(yǎng)的培養(yǎng)基均不能滿足甲殼動 物支原體的生長需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的現(xiàn)狀提供一種海洋甲殼類動物支
原體培養(yǎng)基。本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是針對現(xiàn)有技術的現(xiàn)狀提供一種海洋甲殼類 動物支原體培養(yǎng)基分離純化方法。本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為該海洋甲殼類動物支原體培養(yǎng) 基，包括液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其特征在于將支原體肉湯培養(yǎng)基12. O 15. Og0.4_lwt%苯酚紅2. 35 3. OOmL重蒸水470 600mL
在pH為7. 0-8. OUlO0C _121°C的條件下滅菌10_20min后，加入5_30mL小牛血 清在56°C滅活30min，然后再加入10_4(^%新鮮酵母浸出液5-20mL、5-10wt %葡萄糖溶液 0. 5-3mL、5-15wt%醋酸鉈水溶液0. 1-0. 5mL和5_20mg/mL青霉素0. 5_2mL混合均勻得到所 述的液體培養(yǎng)基；將 支原體肉湯培養(yǎng)基12.0 15. Og重蒸水470 600mL瓊脂粉0.94 1.2wt%在ρΗ7· 0-8. OUlO0C _121°C條件下滅菌10_20min，待冷卻至55 60°C后，加入 已過濾除菌的小牛血清5-301^、10-4(^%新鮮酵母浸出液5-20mL、5-15wt%醋酸鉈水溶液 0. 1-0. 5mL和5-15mg/mL青霉素0. 5_2mL，混合均勻后將混合液傾注到滅菌平板上制成固體 培養(yǎng)基；上述瓊脂粉的用量為每IOOmL固體培養(yǎng)基加入0. 94-1. 2g。其中，所述新鮮酵母浸出液的制備方法如下稱取高活性干活酵母，懸浮于2-6倍的蒸餾水中，在20-40°C攪拌5-30min后，在 室溫下發(fā)酵15-60min，然后加熱至沸點，冷卻得到發(fā)酵液；將發(fā)酵液以2000-4000rpm離心 15-30min,取上清液，用NaOH調(diào)pH值至7. 0 8. 0，然后將上清液置于90 95°C水浴中 10-20min ；冷卻后，再以7000 8000rpm離心15_30min，取上清液用0. 22-0. 45 μ m膜過濾 除菌即得到新鮮的酵母浸出液。使用上述液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基進行海洋甲殼類動物支原體的分離純化方法， 其特征在于包括下述步驟1)無菌剪取病樣器官，加3 6倍病樣器官體積的支原體肉湯培養(yǎng)基及0. 5-1 倍病樣器官體積的石英砂，無菌研磨成乳劑，3000-5000rpm離心10-20min，將上清液經(jīng) 0. 22-0. 45 μ m膜無菌過濾，除去雜菌，得到無菌上清液；2)取無菌上清液接種于10倍體積所述的液體培養(yǎng)基中，置于22-41°C、濃度為 5% 10v%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48-72h盲傳，將盲傳代接種到所述的固體培養(yǎng)基上 進行菌落生長，得到特征菌落；3)將所述的特征菌落再接種到所述的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長，將得到的培養(yǎng)物接 種到所述固體培養(yǎng)基上進行菌落生長；重復該步驟，直至得到所需支原體的特征菌落；4)用無菌刀片挑取所述的特征菌落接種于所述的液體培養(yǎng)基，于22-41°C、 50-100rpm震蕩培養(yǎng)，至液體培養(yǎng)基顏色由紅變黃時取出培養(yǎng)物；對該培養(yǎng)物與所述液體 培養(yǎng)基進行10倍稀釋法，稀釋至所需濃度，得到稀釋液；取0. I-ImL上述稀釋液接種于固體 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分離出支原體特征病菌；5)重復步驟4三次以上，得到純化的海洋甲殼類支原體。另一種海洋甲殼類動物支原體的分離純化方法，其特征在于包括下述步驟1)無菌剪取病樣器官，加3 6倍病樣器官體積的支原體肉湯培養(yǎng)基及0. 5-1 倍病樣器官體積的石英砂，無菌研磨成乳劑，3000-5000rpm離心10-20min，將上清液經(jīng) 0. 22-0. 45 μ m無菌濾器過濾，除去雜菌，得到無菌上清液；2)取0. 2-lmL無菌上清液涂布于所述的固體培養(yǎng)基上，22_41°C下置于二氧化碳 培養(yǎng)箱的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)，CO2濃度范圍為5% 10v%，培養(yǎng)3 5天，得到支原體特征菌落；用無菌刀片選取所述的特征菌落接種于液體培養(yǎng)基，在22-4rC、50-100rpm條件下震 蕩培養(yǎng)，至液體培養(yǎng)基的顏色變黃時得到培養(yǎng)物；向該培養(yǎng)物中加入所述的液體培養(yǎng)基進 行10倍稀釋法，得到所需濃度的稀釋液；將該稀釋液接種至所述固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分 離出支原體特征菌落；3)對得到的特征菌落 重復步驟2三次以上，得到純化的海洋甲殼類支原體。再一種海洋甲殼類動物支原體的分離純化方法，其特征在于包括下述步驟1)用接種環(huán)無菌沾取取3_5mm3大小的病樣組織塊在所述的固體培養(yǎng)基上直接劃 線接種，置于潮濕環(huán)境、22-41°C的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，CO2濃度范圍為5% 10v%，培 養(yǎng)3 14天，生長出菌落；2)用無菌刀片選取所需菌落接種于液體培養(yǎng)基，置22-4rC、50-100rpm震蕩培 養(yǎng)，至液體培養(yǎng)基顏色變黃時得到支原體培養(yǎng)物；向該培養(yǎng)物中加入所述的液體培養(yǎng)基進 行10倍稀釋法，得到所需濃度的稀釋液；將該稀釋液接種至所述固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分 離出支原體特征菌落；3)對得到的特征菌落重復步驟2三次以上，得到純化的海洋甲殼類支原體。又一種海洋甲殼類動物支原體的分離純化方法，其特征在于包括下述步驟1)取活體病樣，無菌條件下剪切病樣，將流出的組織液接種于10倍體積所述的液 體培養(yǎng)基中，置于22-41°C、濃度為5% 10v%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48-72h盲傳，將 盲傳代接種到所述的固體培養(yǎng)基上進行菌落生長，得到特征菌落；2)將所述的特征菌落再接種到所述的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長，將得到的培養(yǎng)物接 種到所述固體培養(yǎng)基上進行菌落生長；重復該步驟，直至得到所需支原體的特征菌落；3)用無菌刀片挑取所述的特征菌落接種于所述的液體培養(yǎng)基，于22-41°C、 50-100rpm震蕩培養(yǎng)，至液體培養(yǎng)基顏色由紅變黃時取出培養(yǎng)物；對該培養(yǎng)物與所述液體 培養(yǎng)基進行10倍稀釋法，稀釋至所需濃度，得到稀釋液；取0. I-ImL上述稀釋液接種于固體 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分離出支原體特征病菌；4)重復步驟4三次以上，得到純化的海洋甲殼類支原體。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供了一種用于甲殼動物、尤其是青蟹支原體體外培養(yǎng) 的培養(yǎng)基及使用該培養(yǎng)基對甲殼動物支原體的分離純化方法。該液體及固體培養(yǎng)基能有效 促進支原體體外生長，本方明分離方法所分離出甲殼類動物體內(nèi)支原體的成功率較高。
具體實施例方式以下結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。實施例1培養(yǎng)基制備1、液體培養(yǎng)基的制備稱取支原體肉湯培養(yǎng)基2. 04g溶于SOmL重蒸水中，力口 0. 4mL0. 4%苯酚紅，用IM NaOH調(diào)pH至7. 8，121°C滅菌15min ；將得到的液體培養(yǎng)基冷卻 55°C后加入已過濾除菌的小牛血清201^，25￥%新鮮酵母浸出液10mL，10wt%葡萄糖溶液 ImL, IOwt %醋酸鉈水溶液0. 2mL, 10mg/mL青霉素lmL，混合均勻后用5mL試管分裝備用。2、固體培養(yǎng)基的制備稱取支原體肉湯培養(yǎng)基2. 04g溶于SOmL重蒸水中，用 IMNaOH調(diào)pH至7. 8，加入終濃度為1. 02wt%的瓊脂粉，121°C滅菌15min，待冷卻至57°C左右，加入已過濾除菌的小牛血清201^、25￥%新鮮酵母浸出液10mL、IOwt%醋酸鉈水溶液 0. 2mL和lOmg/mL青霉素lmL，混合均勻后傾注到IOmL滅菌平板上制成固體培養(yǎng)基備用。上述新鮮酵母浸出液的制備方法 為稱取250g高活性干活酵母，懸浮于IOOOmL 蒸餾水中，在37°C攪拌20min后，在室溫下發(fā)酵40min，然后加熱至沸點，冷卻得到發(fā)酵液； 將發(fā)酵液以3000rpm離心20min，取上清液，用IM NaOH調(diào)pH值至7. 8，然后將上清液置于 90 95°C水浴中15min ；冷卻后，再以7500rpm離心20min，取上清液用0. 25 μ m膜過濾除 菌即得到新鮮的酵母浸出液。本實施例中制備的培養(yǎng)基供實施例2-6使用。實施例21)無菌條件下，采取青蟹腮組織約5. 7g加入15mL支原體肉湯培養(yǎng)基研磨液及 3mL石英砂，無菌研磨成乳劑，4000rpm離心15min ；將上清液吸入注射器中經(jīng)0. 45 μ m濾膜 過濾除去雜菌，得到無菌上清液。2)取0. 5ml上清液接種于5mL液體培養(yǎng)基中，置于37°C、5v% CO2的二氧化碳培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72h盲傳一代，將盲傳代一分為二分別接種到液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。液 體培養(yǎng)基用于保存并生長該盲傳代培養(yǎng)物；固體培養(yǎng)基上在37°C、5v% CO2條件下培養(yǎng)3天 后在顯微鏡下每日觀察固體培養(yǎng)基上菌落的生長情況。選擇菌落生長分布均勻的固體培養(yǎng) 基，在低倍顯微鏡下記號典型的單個支原體特征菌落。如果經(jīng)過一代盲傳不能得到特征菌 落，可以進行多代盲傳，直至得到特征菌落。通常情況下，經(jīng)過三代盲傳后即會分離出特征 菌落，如果三代盲傳后還沒有發(fā)現(xiàn)特征菌落，那該培養(yǎng)物中可能不含有支原體。實施例2至實施例5中固體培養(yǎng)基上特征菌落的分離、純化條件以及菌落在液體 培養(yǎng)基中的生長培養(yǎng)均是在22-41°C、濃度為5% 1(^%的二氧化碳培養(yǎng)箱中進行的。3)用無菌刀片挑取得到的特征菌落接種于液體培養(yǎng)基，在37°C、80rpm震蕩培養(yǎng)， 至液體培養(yǎng)基顏色由紅變黃；取培養(yǎng)物10倍稀釋至10_6后，得到稀釋液；將該稀釋液接種 到固體培養(yǎng)基上，在潮濕環(huán)境下、37°C、5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)，5d后觀察到固體培養(yǎng)基上 出現(xiàn)均勻分布的、大小如針尖狀的菌落，在低倍顯微鏡下觀察，這些菌落呈典型的“油煎蛋” 樣，菌落呈圓形，直徑均小于ΙΟΟμπι，中間部分較厚，為陷入瓊脂內(nèi)部的生長部分；邊緣整 齊，周邊為一層薄薄的透明區(qū)，此為菌落在瓊脂表面散開的生長部分。菌落較小時常為無 色，陳舊后變成淡黃色或棕黃色，部分菌落分布密集呈珍珠狀，圓形表面圓潤光滑，深入瓊 脂中，大小約50μπι左右。挑取單個菌落，在無菌條件下接種于液體培養(yǎng)基，37°C潮濕環(huán)境 下SOrpm震蕩培養(yǎng)，至液體培養(yǎng)基顏色變黃后再10倍稀釋至10_6，涂布于固體培養(yǎng)基上培 養(yǎng)，得到支原體特征菌落。4)挑取單個支原體特征菌落，依次重復步驟3三次以上，即可得到純化的海洋甲 殼類動物支原體，可于-80°C超低溫甘油中保存。實施例31)無菌剪取病樣器官，可以是海洋甲殼類動物的腮、胃、腸、肝胰腺或心臟等器官， 加4倍體積的支原體肉湯培養(yǎng)基及0. 5 Ig石英砂，用NaOH調(diào)節(jié)pH為8，無菌研磨成乳 齊IJ，3000rpm離心20min取上清液，吸入注射器中經(jīng)0. 45 μ m膜無菌過濾，除去雜菌，得到無 菌上清液。2)取0. 5mL無菌上清液接種于5mL液體培養(yǎng)基中，置于37°C的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，CO2濃度范圍為7%，72h后盲傳，盲傳接種在液體培養(yǎng)基的同時也接種固體培養(yǎng)基，接 種在液體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物用于保留并生長該盲傳菌種，接種在固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物用 于分離、純化所需要的支原體菌落。
3)接種在固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物在37°C、5v% CO2條件下培養(yǎng)3天后(培養(yǎng)條 件？)在顯微鏡下每日觀察菌落生長情況。選擇菌落生長分布均勻的固體培養(yǎng)基，在低倍 顯微鏡下記號典型的單個菌落，用無菌刀片挑取記號部位菌落接種于液體培養(yǎng)基，置37°C、 80rpm震蕩培養(yǎng)，至液體培養(yǎng)基顏色由紅變黃時，取培養(yǎng)物10倍法稀釋至10_4，得到稀釋物。 取0. 2mL該稀釋液接種至固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。重復步驟3至少三次，得到純化的海洋夾克類動物支原體，可于-80°C超低溫甘油 中保存?zhèn)溆?。實施?1)用接種環(huán)無菌沾取病蟹腹水接種于固體培養(yǎng)基，取約3mm3大小的組織塊在固體 培養(yǎng)基上直接劃線接種，置于潮濕環(huán)境、37°C的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，CO2濃度為6v%，培 養(yǎng)3d后在顯微鏡下每日觀察菌落生長情況。2)選擇菌落生長分布均勻的固體培養(yǎng)基，在低倍顯微鏡下記號典型的單個菌落 后，用無菌刀片挑去記號部位菌落接種于液體培養(yǎng)基，置37°C、80rpm震蕩培養(yǎng)，至液體培 養(yǎng)基顏色由紅變黃時取培養(yǎng)物10倍稀釋法稀釋至10_4，得到稀釋液；取0. 2mL稀釋液接種 至固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，得到純化的支原體特征菌落。3)挑取支原體特征菌落，重復步驟2三次以上，得到純化的海洋夾克類動物支原 體，可于-80°C超低溫甘油中保存?zhèn)溆?。實施?1)取活體病樣，用酒精棉消毒外部，無菌條件下剪切病樣，將病樣流出的組織液滴 入液體培養(yǎng)基中進行生長培養(yǎng)。同時將樣品組織液滴于固體培養(yǎng)基上，涂布后置于潮濕環(huán) 境、37°C的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，CO2濃度范圍為5v%。72小時后盲傳，將盲傳代接種到 所述的固體培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)，3天后每日在顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基上菌落的生長 情況，選擇菌落生長分布均勻的固體培養(yǎng)基，在低倍顯微鏡下記號典型的單個支原體特征 菌落。如果經(jīng)過一代盲傳不能得到特征菌落，可以進行多代盲傳，直至得到特征菌落。通常 情況下，經(jīng)過三代盲傳后即會分離出特征菌落，如果三代盲傳后還沒有發(fā)現(xiàn)特征菌落，那該 培養(yǎng)物中可能不含有支原體。2)選擇菌落生長分布均勻的固體培養(yǎng)基，在低倍顯微鏡下記號典型的單個菌落 后，用無菌刀片挑去記號部位菌落接種于液體培養(yǎng)基，置37°C、80rpm震蕩培養(yǎng)，至液體培 養(yǎng)基顏色由紅變黃時取出培養(yǎng)物10倍稀釋法稀釋至10_4，得到稀釋液；取0. 2mL該稀釋液 接種至固體培養(yǎng)基平板繼續(xù)培養(yǎng)，得到純化的支原體特征菌落。3)重復步驟2，對依次得到的支原體菌落進行純化，重復三次以上，得到純化的海 洋夾克類動物支原體，可于-80°C超低溫甘油保存?zhèn)溆?。上述各實施例中未涉及到的?nèi)容部分與現(xiàn)有技術相同。
權利要求
一種海洋甲殼類動物支原體培養(yǎng)基，包括液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，其特征在于將支原體肉湯培養(yǎng)基 12.0～15.0g0.4-1wt％苯酚紅 2.35～3.00mL重蒸水470～600mL在pH為7.0-8.0、110℃-121℃的條件下滅菌10-20min，冷卻至50-60℃后加入5-30mL小牛血清在56℃滅活30min，然后再加入10-40v％新鮮酵母浸出液5-20mL、5-10wt％葡萄糖溶液0.5-3mL、5-15wt％醋酸鉈水溶液0.1-0.5mL和5-20mg/mL青霉素0.5-2mL混合均勻得到所述的液體培養(yǎng)基；將支原體肉湯培養(yǎng)基12.0～15.0g重蒸水 470～600mL瓊脂粉 0.94～1.2wt％在pH7.0-8.0、110℃-121℃條件下滅菌10-20min，待冷卻至55～60℃后，加入已過濾除菌的小牛血清5-30mL、10-40v％新鮮酵母浸出液5-20mL、5-15wt％醋酸鉈水溶液0.1-0.5mL和5-15mg/mL青霉素0.5-2mL，混合均勻后將混合液傾注到滅菌平板上制成固體培養(yǎng)基；其中，所述新鮮酵母浸出液的制備方法如下稱取高活性干活酵母，懸浮于2-6倍的蒸餾水中，在20-40℃攪拌5-30min后，在室溫下發(fā)酵15-60min，然后加熱至沸點，冷卻得到發(fā)酵液；將發(fā)酵液以2000-4000rpm離心15-30min，取上清液，用NaOH調(diào)pH值至7.0～8.0，然后將上清液置于90～95℃水浴中10-20min；冷卻后，再以7000～8000rpm離心15-30min，取上清液用0.22-0.45μm膜過濾除菌即得到新鮮的酵母浸出液。
2.一種海洋甲殼類動物支原體的分離純化方法，其特征在于包括下述步驟1)無菌剪取病樣器官，加3 6倍病樣器官體積的支原體肉湯培養(yǎng)基及0.5-1倍 病樣器官體積的石英砂，無菌研磨成乳劑，3000-5000rpm離心10-20min，將上清液經(jīng) 0. 22-0. 45um膜無菌過濾，除去雜菌，得到無菌上清液；2)取無菌上清液接種于10倍體積所述的液體培養(yǎng)基中，置于22-41°C、濃度為5% 10v%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48-72h盲傳，將盲傳代接種到所述的固體培養(yǎng)基上，置于 22-41°C、濃度為5% 1(^%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進行菌落生長，得到特征菌落；3)將所述的特征菌落再接種到所述的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長，將得到的培養(yǎng)物接種到 所述固體培養(yǎng)基上進行菌落生長；重復該步驟，直至得到所需支原體的特征菌落；4)用無菌刀片挑取所述的特征菌落接種于所述的液體培養(yǎng)基，于22-4rC、50-100rpm 震蕩培養(yǎng)，至液體培養(yǎng)基顏色由紅變黃時取出培養(yǎng)物；對該培養(yǎng)物與所述液體培養(yǎng)基進行 10倍稀釋法，稀釋至所需濃度，得到稀釋液；取0. 1-lmL上述稀釋液接種于固體培養(yǎng)基繼續(xù) 培養(yǎng)，分離出支原體特征病菌；5)重復步驟4三次以上，得到純化的海洋甲殼類支原體。
3.一種海洋甲殼類動物支原體的分離純化方法，其特征在于包括下述步驟1)無菌剪取病樣器官，加3 6倍病樣器官體積的支原體肉湯培養(yǎng)基及0. 5-1倍病樣器官體積的石英砂，無菌研磨成乳劑，3000-5000rpm離心10-20min，將上清液經(jīng) 0. 22-0. 45um無菌濾器過濾，除去雜菌，得到無菌上清液；2)取0.2-lmL無菌上清液涂布于所述的固體培養(yǎng)基上，22-41°C下置于二氧化碳培養(yǎng) 箱的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)，C02濃度范圍為5% 10v%，培養(yǎng)3 5天，得到支原體特征菌落； 用無菌刀片選取所述的特征菌落接種于液體培養(yǎng)基，在22-41°C、50-100rpm條件下震蕩培 養(yǎng)，至液體培養(yǎng)基的顏色變黃時得到培養(yǎng)物；向該培養(yǎng)物中加入所述的液體培養(yǎng)基進行10 倍稀釋法，得到所需濃度的稀釋液；將該稀釋液接種至所述固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分離出支 原體特征菌落；3)對得到的特征菌落重復步驟2三次以上，得到純化的海洋甲殼類支原體。
4.一種海洋甲殼類動物支原體的分離純化方法，其特征在于包括下述步驟1)用接種環(huán)無菌沾取取3-5mm3大小的病樣組織塊在所述的固體培養(yǎng)基上直接劃線接 種，置于潮濕環(huán)境、22-41°C的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，C02濃度范圍為5% 10v%，培養(yǎng) 3 14天，生長出菌落；2)用無菌刀片選取所需菌落接種于液體培養(yǎng)基，置22-4rC、50-100rpm震蕩培養(yǎng)，至 液體培養(yǎng)基顏色變黃時得到支原體培養(yǎng)物；向該培養(yǎng)物中加入所述的液體培養(yǎng)基進行10 倍稀釋法，得到所需濃度的稀釋液；將該稀釋液接種至所述固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分離出支 原體特征菌落；3)對得到的特征菌落重復步驟2三次以上，得到純化的海洋甲殼類支原體。
5.一種海洋甲殼類動物支原體的分離純化方法，其特征在于包括下述步驟1)取活體病樣，無菌條件下剪切病樣，將流出的組織液接種于10倍體積所述的液體培 養(yǎng)基中，置于22-41°C、濃度為5% 10v%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48-72h盲傳，將盲傳 代接種到所述的固體培養(yǎng)基上進行菌落生長，得到特征菌落；2)將所述的特征菌落再接種到所述的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長，將得到的培養(yǎng)物接種到 所述固體培養(yǎng)基上進行菌落生長；重復該步驟，直至得到所需支原體的特征菌落；3)用無菌刀片挑取所述的特征菌落接種于所述的液體培養(yǎng)基，于22-4rC、50-100rpm 震蕩培養(yǎng)，至液體培養(yǎng)基顏色由紅變黃時取出培養(yǎng)物；對該培養(yǎng)物與所述液體培養(yǎng)基進行 10倍稀釋法，稀釋至所需濃度，得到稀釋液；取0. 1-lmL上述稀釋液接種于固體培養(yǎng)基繼續(xù) 培養(yǎng)，分離出支原體特征病菌；4)重復步驟4三次以上，得到純化的海洋甲殼類支原體。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種海洋甲殼類動物支原體培養(yǎng)基及支原體的分離純化方法。其特征在于將支原體肉湯培養(yǎng)基、苯酚紅和重蒸水滅菌后加入小牛血清滅活然后再加入新鮮酵母浸出液、葡萄糖溶液、醋酸鉈水溶液和青霉素混合均勻得到所述的液體培養(yǎng)基；將支原體肉湯培養(yǎng)基、重蒸水和瓊脂粉滅菌后加入小牛血清、新鮮酵母浸出液、醋酸鉈水溶液和青霉素，混合均勻后將混合液傾注到滅菌平板上制成固體培養(yǎng)基。利用上述培養(yǎng)基進行海洋甲殼類動物支原體的分離純化方法是在固體培養(yǎng)基上分離菌落，將分離的菌落置于液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)生長后在放置到固體培養(yǎng)基上純化，重復上述步驟直至得到純化的支原體。本發(fā)明所分離出甲殼類動物體內(nèi)支原體的成功率高。
文檔編號C12R1/35GK101864387SQ20101017503
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權日2010年5月14日
發(fā)明者楊季芳, 樓丹, 陳吉剛 申請人:楊季芳