專利名稱：一種醛縮酶、編碼基因、載體、工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醛縮酶，以及編碼該醛縮酶的基因、載體、工程菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
醛縮酶作為催化碳碳原子立體成鍵的酶，可以廣泛的應(yīng)用在有機(jī)化學(xué)合成中，它 可以方便的以小分子為起點向大的復(fù)雜分子方向進(jìn)行不對稱催化合成，這個過程在碳水化 合物為底物的反應(yīng)中意義尤為突出。應(yīng)用酶的高區(qū)域選擇性，能夠容易避開對碳水化合物 中的活潑的羥基的保護(hù)，更為突出的是在催化碳碳鍵合成的同時醛縮酶可以引入新的手性 中心。正是這種能夠高效引入手性碳原子的能力，使得醛縮酶在藥物分子合成領(lǐng)域中有著 廣泛的應(yīng)用，與化學(xué)工藝相比，具有明顯優(yōu)勢，如避免了有毒有害物質(zhì)的使用，合成可在常 溫常壓條件下進(jìn)行。從替代傳統(tǒng)化學(xué)合成工藝催化劑的角度，該酶催化的反應(yīng)具有很強(qiáng)的 綠色屬性，對傳統(tǒng)化學(xué)工藝的綠色化學(xué)改造有著重要意義，因而該酶具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的、編碼基因、載體、工程菌及其應(yīng)用。該新的醛縮酶 與常規(guī)醛縮酶相比具有很好的耐高溫、耐有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種來源于 Aciduliprofundum boonei 的醛縮酶基因(DERA)，具有 SEQ ID NO 1 所示的核苷酸序列atgaatcgcaaggagcttgc3.3.3.3. 3. 3. gaccatacaaatttgaaggcctttgccaca60
agggaagacataaagagattgtgcgatgaggcgaaagagtatggattctatgcggtgtgc120
gtaaatccatacagggttaaggatgctgccgagtttttgaagggcacgga ￡Ι ￡1￡1￡1￡1￡Ι ￡1180
gcctctgtagttggctttcctctgggggcaacattcaccgaaacaaaggttcaagaggcg240
ataatgaccgttcgcaacggtgcggatgagattgatatggttatgaacataggggctatg300
aaggatggagattatggatttgtggaaagagatataagagaagttgttgaagcggtgcat360
ccaatgggtgccaaggtaaaggtgataattgagacatgctatctaagcgatgaggagaaa420
attaaggcatgcgaacttgccaagaaagcaggtgcagattttgtgaagacctccactggg480
ttcggcacagcgggagcgaaggttgaggatgttaaattgatgcgcagtgtggttggcaat540
gatatgggtgtaaaagctgctggcggaatacataatgcaaaggaggcaattgcaatgata600
gaggcgggagcgacaagaataggagctagcagaagtgtgcagattattgaaacgctggaa660
ttgatatga669
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO 1所示多核苷酸的變體，只要其與該多核
苷酸具有90%以上同源性，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具 有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的等位變異體或非 生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是 一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的氨基酸的功能。 一種耐熱耐有機(jī)溶劑的醛縮酶，由所述醛縮酶基因編碼。具體的，所述醛縮酶具有 SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列MetAsnArgLysGluLeuAlaLysTyrlieAspHisThrAsnLeuLys
151015
AlaPheAlaThrArgGluAsplieLysArgLeuCysAspGluAlaLys
202530
GluTyrGlyPheTyrAlaValCysValAsnProTyrArgValLysAsp
354045
AlaAlaGluPheLeuLysGlyThrAsplieLyslieAlaSerValVal
505560
GlyPheProLeuGlyAlaThrPheThrGluThrLysValGlnGluAla
65707580
IleMetThrValArgAsnGlyAlaAspGlulieAspMetValMetAsn
859095
IleGlyAlaMetLysAspGlyAspTyrGlyPheValGluArgAsplie
100105110
ArgGluValValGluAlaValHisProMetGlyAlaLysValLysVal
115120125
IleIleGluThrCysTyrLeuSerAspGluGluLyslieLysAlaCys
130135140
GluLeuAlaLysLysAlaGlyAlaAspPheValLysThrSerThrGly
145150155160
PheGlyThrAlaGlyAlaLysValGluAspValLysLeuMetArgSer
165170175
ValValGlyAsnAspMetGlyValLysAlaAlaGlyGlylieHisAsn
180185190
AlaLysGluAlalieAlaMetlieGluAlaGlyAlaThrArglieGly
195200205
AlaSerArgSerValGlnlielieGluThrLeuGluLeulie
210215220
經(jīng)實驗證明，上述結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)具有很好的耐高溫.、耐有機(jī)浮 劑的穩(wěn)定性。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQNO 2所示氨基酸,序列的多肽的
其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該多肽的片段或多肽變體與前述氨 基酸序列同源性在95%以上，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。具體的，所述改變可包括氨基酸 序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與 原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變， 如用色氨酸替換甘氨酸。 本發(fā)明還涉及一種含有所述醛縮酶基因的重組載體，以及所述重組載體轉(zhuǎn)化得到
4的重組基因工程菌。本發(fā)明還涉及所述的醛縮酶基因在制備重組醛縮酶中的應(yīng)用。具體的，所述的應(yīng)用為構(gòu)建含有所述醛縮酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn) 化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)(通常以IPTG為誘導(dǎo)劑)，培養(yǎng)液分 離得到含有重組醛縮酶的菌體細(xì)胞。本發(fā)明的要點在于提供了 SEQ NO :1所示的核苷酸序列和SEQ NO :2所示的氨基酸 序列，在已知該核苷酸序列和氨基酸序列的情況下，該核苷酸序列和氨基酸序列的獲得，以 及相關(guān)載體、宿主細(xì)胞的獲得，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說均是顯而易見的。本發(fā)明的耐高溫、耐有機(jī)溶劑的醛縮酶可按如下方法獲得1、DERA基因全長的 cDNA合成與克隆根據(jù)DERA基因的核苷酸序列，進(jìn)行全基因合成，獲得SEQ ID NO. 1所示 的核苷酸序列的醛縮酶基因。2、含目的基因的表達(dá)載體的構(gòu)建將步驟1得到的醛縮酶基 因克隆至中間載體。3、將步驟2得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，如大腸桿菌 (Escherichiacoli)BL 21，在適合表達(dá)醛縮酶的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。4、從步驟3的培養(yǎng)物中分離出醛縮酶。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種醛縮酶，以及編碼該醛縮酶的基因、載 體、工程菌及其應(yīng)用，該醛縮酶可用于2，4，6-三脫氧己糖化合物的合成，綠色環(huán)保，應(yīng)用前 景廣闊。


圖 1 為 Aciduliprofundum boonei 的醛縮酶表達(dá)結(jié)果(M :marker ；1 宿主細(xì)胞；2 表達(dá)后的宿主細(xì)胞；3 純化后的DERA)。圖2為不同溫度處理下DERA的相對活力。圖3為不同時間乙醛處理后DERA的相對剩余活力。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此實施例1 :DERA基因全長的cDNA合成與克隆根據(jù)NCBI中的來自Aciduliprofundum boonei的DERA基因的核苷酸序列，交上 海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因合成，成功獲得SEQ ID NO. 1所示核苷酸的序列。 根據(jù)Aciduliprofundum boonei的DERA基因編碼序列(SEQ ID N0. 1)，設(shè)計擴(kuò)增出完整編 碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點，以便表達(dá)載體。以基 因合成的產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將Aciduliprofundum boonei的DERA克隆至中間載 體pET303/CT (購自Invitrogen公司)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體， 再將其轉(zhuǎn)入 E. Coil BL21 中，得到工程菌 E. Coil BL21/pET 303CT/DERA 021。實施例2 =DERA蛋白的表達(dá)將實施例1 中獲得的 E. Coil BL21/pET 303CT/DERA 021 在含 IOOmLlOO μ g/mL 氨 芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中搖床過夜培養(yǎng)。將IOml過夜培養(yǎng)后的菌液倒入IL 100 μ g/
5mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，直到菌液OD6tltl達(dá)到0. 6 0. 8時加入IPTG終濃度為 0. 5mM, 28°C誘導(dǎo)16h后，離心收集菌體，菌體用25ml磷酸緩沖液pH7. 4使其重懸浮，超聲破 碎細(xì)胞。離心取上清，含DERA 021的上清用0. 22 μ m醋酸纖維素濾膜過濾后鎳柱親和層析 進(jìn)行純化獲得DERA 021純酶。數(shù)據(jù)表明LB培養(yǎng)基中DERA 021酶的表達(dá)量達(dá)到45mg/L (圖 1)。實施例3 =DERA的熱穩(wěn)與耐有機(jī)溶劑穩(wěn)定性本發(fā)明以2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯為底物，室溫條件下，DERA催化裂解一分子 底物解得到一分子三磷酸甘油醛，其在NADH及丙糖磷酸異構(gòu)酶存在的情況下，被甘油三磷 酸脫氫酶催化，每一分子三磷酸甘油醛被催化消耗一分子NADH。通過測量NADH在340nm波 長的UV吸收來檢測動力學(xué)曲線以分析測定DERA的天然底物分解活性。一分子NADH的消 耗對應(yīng)一分子2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯的分解。具體操作如下用IOOmM咪唑鹽酸緩沖 液(pH8. 0)溶解DERA配成酶液，加入至底物的混合溶液(0. ImM NADH，0. 4mM 2-脫氧-D-核 糖-5-磷酸酯，1 lU/mL丙糖磷酸異構(gòu)酶，4U/mL甘油三磷酸脫氫酶)，測定340nm處動力學(xué)曲 線。將DERA 021 分別在 30 V，40°C，50 V，60°C，70 V，80°C，90 "C, 100 V 下溫浴 lOmin， 之后與反應(yīng)液混合，于50°C下測定分解活力。以未處理的DERA 021在相同條件下測定的分 解活力為100%，得到各個溫度處理后的DERA 021相對分解活力。如圖2所示，結(jié)果表明來 自Aciduliprofundum boonei的DERA酶具很高的熱穩(wěn)定性。將DERA 021與IOOmM乙醛在25°C下孵育不同時間后，用IOOmM咪唑鹽酸緩沖液 (pH7. 0)于Microcon YM-IO (Millipore, Tokyo)內(nèi)反復(fù)洗脫去除乙醛，之后于25°C測定分 解活力，以未處理的DERA 021在相同條件下測定的分解活力為100%，得到不同時間乙醛 處理后DERA021的相對分解活力。如圖3所示，來自Aciduliprofundum boonei的DERA酶 具很高的乙醛耐受，在20h處理后，剩余酶活力僅下降29%。
權(quán)利要求
一種來源于Aciduliprofundum boonei的醛縮酶基因，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.一種耐熱耐有機(jī)溶劑的醛縮酶，由權(quán)利要求1所述醛縮酶基因編碼。
3.如權(quán)利要求2所述的醛縮酶，其特征在于所述醛縮酶具有SEQID NO :2所示的氨基 酸序列。
4.一種含有權(quán)利要求1所述醛縮酶基因的重組載體。
5.一種用權(quán)利要求4所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
6.如權(quán)利要求1所述的醛縮酶基因在制備重組醛縮酶中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為構(gòu)建含有所述醛縮酶基因的 重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng) 液分離得到含有重組醛縮酶的菌體細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了涉及一種醛縮酶，以及編碼該醛縮酶的基因、載體、工程菌及其應(yīng)用。所述來源于Aciduliprofundum boonei的醛縮酶基因(DERA)，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，所述醛縮酶具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明所述醛縮酶可用于2，4，6-三脫氧己糖化合物的合成，綠色環(huán)保。
文檔編號C12N1/15GK101921789SQ201010175780
公開日2010年12月22日 申請日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者杜鵬飛, 王秋巖, 謝恬, 趙淑娟 申請人:杭州師范大學(xué)