專利名稱：一種產(chǎn)油微生物rna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物RNA的提取方法，特別是涉及到產(chǎn)油微生物RNA的提取方
法。

背景技術(shù)：
自然界中部分微生物，如細(xì)菌、酵母菌、霉菌和藻類等，能在特定的培養(yǎng)條件下，在胞內(nèi)貯存質(zhì)量超過(guò)其細(xì)胞干重20% (w/w)的油脂，具有這種表型的微生物被稱為產(chǎn)油微生物。這些產(chǎn)油微生物所產(chǎn)的油脂主要以脂肪酸甘油三酯的形式存在，其組成與一般的動(dòng)植物油脂相似。近年來(lái)微生物油脂發(fā)酵也逐漸成為生物柴油產(chǎn)業(yè)和工業(yè)生物技術(shù)的重要研究方向。相對(duì)于一般的微生物來(lái)說(shuō)，產(chǎn)油微生物胞內(nèi)油脂含量較高。如某些紅酵母屬的菌株能以糖質(zhì)原料為碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵，在胞內(nèi)積累超過(guò)其細(xì)胞干重70% (w/w)的油脂(Li YH, Zhao ZB, Bai Fff. Enzyme Microb Technol，2007 (41) :312_317)，而同時(shí)還大量合成色素。 這些高含量的油脂與色素對(duì)RNA的分離純化會(huì)產(chǎn)生很大的干擾，嚴(yán)重影響提取RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量。而分離提取高質(zhì)量的RNA是基因表達(dá)、調(diào)控與基因工程等研究的基礎(chǔ)。目前微生物RNA提取方法有很多，單獨(dú)采用Trizol試劑盒(Gilchrist Μ, MacDonald AJ, Neverova I，et al.J Immunol methods, 1997(201) :207_214)、熱酸酚處理(Schmitt ME, Brown, TA, Trumpower LB. Nucleic Acids Res, 1990(18) :3091_3092)、玻璃珠破碎細(xì)胞(奧斯伯 F， 金斯頓R，塞德曼J.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南.1998 :597-598)和液氮研磨(Sayler GS, Fleming JT, Nivens DE. Curr Opin Biotechnol. 2001(12) :455_60)等方法均不能有效的從產(chǎn)油微生物中提取高質(zhì)量的RNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單的操作方法，從產(chǎn)油微生物中提取高質(zhì)量 (高純度)的細(xì)胞總RNA。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的操作步驟為一種從產(chǎn)油微生物中提取高質(zhì)量RNA的方法，產(chǎn)油菌體首先采用液氮研磨成粉末、然后于RNA提取緩沖液中采用玻璃珠振蕩(相結(jié)合的方式)進(jìn)行細(xì)胞破碎，得細(xì)胞破碎液；在細(xì)胞破碎液中加入有機(jī)溶劑去除油脂，離心后取水相，加入醋酸鈉、酸性苯酚、氯仿和異戊醇除去胞內(nèi)蛋白，離心后取水相加入異丙醇沉淀RNA，洗滌沉淀，真空干燥后加入DEPC 處理水溶解。具體操作過(guò)程為，1)取細(xì)胞密度為1 X IO7-I X IO8細(xì)胞/ml的菌體經(jīng)液氮速凍的產(chǎn)油菌體研磨破碎 0. 5-30min至粉末狀，刮取粉末裝于離心管中，加入RNA提取緩沖液，菌體與RNA提取緩沖液體積比例為IOml l-2ml ；2)向離心管中加入玻璃珠間歇振蕩，總的破碎時(shí)間為0. 5-30min ；每IOml菌體 (5ml離心管中)加入0. 5-1. 5g玻璃珠；
3)向離心管中加入有機(jī)溶劑，充分混勻后0-4°C，12000-18000Xg離心5-lOmin ； 有機(jī)溶劑的量為1/4-3/4RNA提取緩沖液體積；4)取分層后的水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入濃度為3M、pH為4. 6的醋酸鈉和體積比為25 24 1酸性苯酚/氯仿/異戊醇混合液，充分混勻0-4°C，12000-18000Xg 離 心5-15min ；按IOml菌體計(jì)，加入100 μ 1的醋酸鈉和Iml混合液；5)取分層后的水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入等體積異丙醇混勻，置于 0—70°C放置 5min-16h，然后 0-4°C，12000-18000 X g 離心 5_15min 獲得沉淀的 RNA ；6)獲得的RNA沉淀用70%的乙醇洗滌干燥后加入體積比0. 01 % -0. 5%的DEPC 處理水溶解保存。RNA提取緩沖液為內(nèi)含4M異硫氰酸胍、0. 5wt%十二烷基肌氨酸鈉、25mM檸檬酸鈉、pH 7.0,0. 5wt%巰基乙醇的水溶液。所述的玻璃珠振蕩破碎方法為間歇振蕩，每次振蕩IOs-IOmin后置于冰上冷卻 0. 5-10min，總的破碎時(shí)間為0. 5_30min，玻璃珠直徑為0. 2_lmm。所述去除油脂的有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲烷、石油醚或它們之間的任意比例混合。本發(fā)明區(qū)別于傳統(tǒng)的微生物RNA提取方法，為了快速的破碎細(xì)胞，采用液氮研磨和玻璃珠振蕩相結(jié)合的方式。本發(fā)明加入有機(jī)試劑，有效的去除了產(chǎn)油微生物胞內(nèi)大量油脂及色素，減少了對(duì) RNA分離純化的干擾。本發(fā)明使用的產(chǎn)油微生物包括但不限于產(chǎn)油真菌，如 Rhodosporidiumtoruloides、Cryptococcus curvatus、Yarrowia IipoIytica、Rhodotorula glutinis、Rhizopus arrhizus、Lipomyces starkeyi、Mortierella isabellina、 Mucorcircinelloides 禾口 Cunninghamella ；產(chǎn)油細(xì)菌，如 Croynebacterium、Nocardia 禾口 Mycobacterium ；產(chǎn)油微藻，如 Botryococcus braunii、Crypthecodiniumcohni i、ChloreIla protothecoides>Nannochloropsis sp.禾口 Schizochytriumlimacinum。所得的高質(zhì)量 RNA 可廣泛應(yīng)用于如Northern雜交、mRNA分離、RACE、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等。


圖1.產(chǎn)油酵母Lipomyces starkeyi AS 2. 1560總RNA提取電泳分析，泳道1 沒有加入有機(jī)試劑去除油脂；2 加入有機(jī)試劑去除油脂(以下相同)。圖 2.產(chǎn)油酵母 Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389 總 RNA 提取電泳分析。圖3.產(chǎn)油微藻Botryococcus braunii LB572總RNA提取電泳分析。圖 4.產(chǎn)油酵母 Yarrowia lipolytica AS 2. 1398 總 RNA 提取電泳分析。圖 5.產(chǎn)油霉菌 Mucor circinelloides AS 3. 2208 總 RNA 提取電泳分析。圖 6.產(chǎn)油酵母 Rhodotorula glutinis AS 2. 703 總 RNA 提取電泳分析。圖 7.產(chǎn)油細(xì)菌 Corynebacterium glutanicum 總 RNA 提取電泳分析。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例選取了一些典型的產(chǎn)油微生物菌株，說(shuō)明了產(chǎn)油微生物RNA的提取方法，這將有助于了解本專利，但不以任何形式限制在其它菌株材料上應(yīng)用本發(fā)明。下述實(shí)施例中所用試劑1. RNA提取緩沖液4M異硫氰酸胍，0. 5 %十二烷基肌氨酸鈉，25mM檸檬酸鈉，pH 7.0，0.5%巰基乙醇；2. DEPC處理水100ml去離子水加入100 μ 1 DEPC,常溫下混勻，高壓滅菌，得體積比0. 1 %的DEPC處理水；3.醋酸鈉將24. 61g醋酸鈉溶于DEPC處理水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH為4. 6，定容置 100ml，高壓滅菌。

實(shí)施例一將產(chǎn)油酵母Lipomyces starkeyi AS 2. 1560 (菌株來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)培養(yǎng)到細(xì)胞密度為IX IO8細(xì)胞/ml，收集IOml菌體液氮速凍。酵母細(xì)胞液氮研磨IOmin至粉末狀，刮取粉末裝于5ml離心管中，加入Iml預(yù)冷的RNA提取緩沖液，混勻，加入1. 5g直徑為0. 4mm的玻璃珠，渦旋振蕩lOmin，間歇lOmin，總破碎時(shí)間為 30min，加入500 μ 1氯仿后充分混勻(對(duì)照組不加氯仿)，13，OOO X g離心IOmin,小心吸取水相，依次加入ΙΟΟμΙ的醋酸鈉、Iml酸性苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為25 24 1)， 顛倒轉(zhuǎn)幾次混合均勻，冰浴15min，4°C條件下13，OOOXg離心15min，將水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，并加入等體積的異丙醇，混勻后置于-70°C放置lh，4°C條件下13，OOOXg離心15min，去除上清液，70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥后加入100 μ 1 DEPC處理水沉淀，置于-70°C低溫條件下保存。實(shí)施例二 將產(chǎn)油酵母Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389 (菌株來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)培養(yǎng)到細(xì)胞密度為IX IO8細(xì)胞/ml，收集IOml菌體液氮速凍。酵母細(xì)胞液氮研磨30min至粉末狀，刮取粉末裝于5ml離心管中，加入Iml預(yù)冷的 RNA提取緩沖液，混勻，加入1. 5g直徑為0. 4mm的玻璃珠，渦旋振蕩0. 5min,間歇0. 5min, 總破碎時(shí)間為Ιπ η,ΜΛδΟΟμΙ氯仿后充分混勻(對(duì)照組不加氯仿)，13，OOOXg離心 IOmin,小心吸取水相，依次加入100 μ 1的醋酸鈉、Iml酸性苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為 25 24 1)，顛倒轉(zhuǎn)幾次混合均勻，冰浴1511^11，41條件下13，000乂8離心151^11，將水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，并加入等體積的異丙醇，混勻后置于-20°C放置5min，4°C條件下 13，000 Xg離心15min，去上清液，70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥后加入100 μ 1 DEPC處理水溶解沉淀，置于-70°C低溫條件下保存。實(shí)施例三將產(chǎn)油微藻Botryococcus braunii LB572 (菌株來(lái)源于美國(guó)德克薩斯大學(xué))培養(yǎng)到細(xì)胞密度為ι χ IO7細(xì)胞/ml，收集IOml菌體液氮速凍。細(xì)胞液氮研磨2min至粉末狀，刮取粉末裝于5ml離心管中，加入Iml預(yù)冷的RNA提取緩沖液，混勻，加入1. 5g直徑為0. 6mm玻璃珠，渦旋振蕩3min，間歇3min，總破碎時(shí)間為9min，加入500 μ 1 二氯甲烷后充分混勻(對(duì)照組不加二氯甲烷)，13，000 Xg離心lOmin，小心吸取水相，依次加入100 μ 1 的醋酸鈉、Iml酸性苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為25 24 1)，顛倒轉(zhuǎn)幾次混合均勻，冰浴15min，4°C條件下13，000 Xg離心15min，將水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，并加入等體積的異丙醇，混勻后置于_50°C放置20min，4°C條件下13，OOOXg離心15min，去上清液，70% 乙醇洗沉淀一次，真空干燥后加入100 μ 1 DEPC處理水溶解沉淀，置于_70°C低溫條件下保存。實(shí)施例四將產(chǎn)油酵母Yarrowia lipolytica AS 2. 1398 (菌株來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)培養(yǎng)到細(xì)胞密度為1 X IO8細(xì)胞/ml，收集IOml菌體，液氮速凍。酵母細(xì)胞液氮研磨IOmin至粉末狀，刮取粉末裝于5ml離心管中，加入Iml預(yù)冷的RNA提取緩沖液，混勻，加入1. 5g直徑為0. 4mm的玻璃珠，渦旋振蕩2min，間歇2min，總破碎時(shí)間為6min，加入500μ1氯仿/ 二氯甲烷(體積比為1 1)后充分混勻(對(duì)照組不加氯仿/ 二氯甲烷)，13，000Xg離心lOmin，小心吸取水相，依次加入100 μ 1的醋酸鈉、Iml酸性苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為25 24 1)，顛倒轉(zhuǎn)幾次混合均勻，冰浴15min，4°C條件下 13，OOOXg離心15min，將水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，并加入等體積的異丙醇，混勻后 置于-60°C放置16h，4°C條件下13，OOOXg離心15min，小心去除上清液，70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥后加入100 μ 1 DEPC處理水溶解沉淀，置于-70°C低溫條件下保存。實(shí)施例五將產(chǎn)油霉菌Mucor circinelloides AS 3. 2208 (菌株來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)培養(yǎng)到細(xì)胞密度為1 X IO8細(xì)胞/ml，收集IOml菌體，液氮速凍。 酵母細(xì)胞研磨15min至粉末狀，刮取粉末裝于5ml離心管中，加入Iml預(yù)冷的RNA提取緩沖液，混勻，加入1. 5g直徑為Imm的玻璃珠，渦旋振蕩5min，間歇5min，總破碎時(shí)間為lOmin， 加入500 μ 1 二氯甲烷后充分混勻(對(duì)照組不加二氯甲烷)，13，000 X g離心lOmin，小心吸取水相，依次加入ΙΟΟμΙ的醋酸鈉、Iml酸性苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為25 24 1)， 顛倒轉(zhuǎn)幾次混合均勻，冰浴15min，4°C條件下13，OOOXg離心15min，將水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，并加入等體積的異丙醇，混勻后置于_20°C放置10h，4°C條件下13，OOOXg離心 15min，去上清液，70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥后加入100 μ 1 DEPC處理水溶解沉淀，置于-70°C低溫條件下保存。實(shí)施例六將產(chǎn)油酵母Rhodotorula glutinis AS 2. 703 (菌株來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)培養(yǎng)到細(xì)胞密度為IX IO8細(xì)胞/ml，收集IOml菌體，液氮速凍。 酵母細(xì)胞液氮研磨IOmin至粉末狀，刮取粉末裝于5ml離心管中，加入Iml預(yù)冷的RNA提取緩沖液，混勻，加入Ig直徑為0. 2mm的玻璃珠，渦旋振蕩3min，間歇4min，總破碎時(shí)間為 15min，加入500 μ 1石油醚后充分混勻(對(duì)照組不加石油醚)，13，000 X g離心5min，小心取上清，依次加入ΙΟΟμΙ的醋酸鈉、Iml酸性苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為25 24 1)， 顛倒轉(zhuǎn)幾次混合均勻，冰浴15min，4°C條件下13，OOOXg離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，并加入等體積的異丙醇，混勻后置于0°C放置21!，41條件下13，000\8離心 20min,小心去除上清液，70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥后加入100 μ 1 DEPC處理水溶解沉淀，置于-70°C低溫條件下保存。實(shí)施例七將產(chǎn)油細(xì)菌Corynebacterium glutanicum(菌株來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)培養(yǎng)到細(xì)胞密度為IX IO8細(xì)胞/ml，收集IOml菌體，液氮速凍。酵母細(xì)胞液氮研磨0. 5min至粉末狀，刮取粉末裝于5ml離心管中，加入Iml預(yù)冷的RNA提取緩沖液，混勻，加入0. 5g直徑為0. 2mm的玻璃珠，渦旋振蕩10s，間歇0. 5min,總破碎時(shí)間為 0.5min，加入500μ1石油醚/氯仿(體積比為1 1)后充分混勻(對(duì)照組不加石油醚/氯仿)，13，000 Xg離心lOmin，小心吸取水相，依次加入100 μ 1的醋酸鈉、Iml酸性苯酚/氯仿 /異戊醇(體積比為25 24 1)，顛倒轉(zhuǎn)幾次混合均勻，冰浴15min，4°C條件下13，OOOXg 離心15min，將水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，并加入等體積的異丙醇，混勻后置于-30°C放置2h，4°C條件下13，000 Xg離心15min，小心去除上清液，70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥后加入100 μ 1 DEPC處理水溶解沉淀，置于-70°C低溫條件下保存。以上實(shí)施例所表述的，加入或不加有機(jī)溶劑去除胞內(nèi)油脂所提取的細(xì)胞總RNA，它們的電泳分析結(jié)果分別見說(shuō)明書附圖1-7。從圖中可以看出，采用本發(fā)明方法提取的細(xì)胞總 RNA,電泳檢測(cè)28S和18S rRNA條帶相對(duì)于沒有加有機(jī)溶劑的方法要清晰，說(shuō)明RNA保持了良好的完整性。取實(shí)施例1-7中加入有機(jī)試劑去除油脂所得到的RNA樣品，加蒸餾水稀釋50倍， 并以蒸餾水做空白對(duì)照，分別在230nm、260nm、280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)至零， 然后讀出待測(cè)樣品在三個(gè)波長(zhǎng)處的OD值。表1結(jié)果顯示通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 的OD26tZOD28tl值，均介于1. 8-2. 2之間，說(shuō)明RNA純度符合要求。表IRNA純度檢測(cè)
權(quán)利要求
1.一種從產(chǎn)油微生物中提取高質(zhì)量RNA的方法，其特征在于產(chǎn)油菌體首先采用液氮研磨成粉末、然后于RNA提取緩沖液中采用玻璃珠振蕩進(jìn)行細(xì)胞破碎，得細(xì)胞破碎液；在細(xì)胞破碎液中加入有機(jī)溶劑去除油脂，離心后取水相，加入醋酸鈉、酸性苯酚、氯仿和異戊醇除去胞內(nèi)蛋白，離心后取水相加入異丙醇沉淀RNA，洗滌沉淀， 真空干燥后加入DEPC處理水溶解。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的產(chǎn)油微生物為產(chǎn)油真菌、產(chǎn)油細(xì)菌和/或產(chǎn)油微藻。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述產(chǎn)油真菌為Rhodosporidium toruloides、Cryptococcus curvatus、Yarrowia lipolyica、Rhodotorula glutinis、 Rhizopus arrhizus、 Lipomyces starkeyi、 Mortiere1Iaisabe11ina、 Mucor circinelloides、Cunninghamella 中白勺一禾中或多禾中，產(chǎn)油細(xì)菌為 Croynebacterium、 Nocardia 禾口 Mycobacterium 中的一禾中或多禾中；產(chǎn)油微藻為 Botryococcus braunii、 Crypthecodinium cohnii、 Chlorellaprotothecoides、 Nannochloropsis sp.禾口 Schizochytrium Iimacinum 中的一禾中或多禾中。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于具體操作過(guò)程為，1)取細(xì)胞密度為IXIO7-I X IO8細(xì)胞/ml的菌體經(jīng)液氮速凍的產(chǎn)油菌體研磨破碎 0. 5-30min至粉末狀，刮取粉末裝于離心管中，加入RNA提取緩沖液，菌體與RNA提取緩沖液體積比例為IOml l-2ml ；2)向離心管中加入玻璃珠間歇振蕩，總的破碎時(shí)間為0.5-30min ；每IOml菌體加入 0. 5-1. 5g玻璃珠；3)向離心管中加入有機(jī)溶劑，充分混勻后0-4°C，12000-18000Xg離心5-lOmin ；有機(jī)溶劑的量為1/4-3/4RNA提取緩沖液體積；4)取分層后的水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入濃度為3M、pH為4.6的醋酸鈉和體積比為25 24 1酸性苯酚/氯仿/異戊醇混合液，充分混勻0-4°C，12000-18000 Xg離心 5-15min ；按IOml菌體計(jì)，加入100 μ 1的醋酸鈉和Iml混合液；5)取分層后的水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入等體積異丙醇混勻，置于0--70°C放置 5min-16h，然后 0-4°C，12000-18000X g 離心 5_15min 獲得沉淀的 RNA。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于獲得的RNA沉淀用70%的乙醇洗滌干燥后加入DEPC處理水溶解保存。
6.按照權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于RNA提取緩沖液為內(nèi)含4M異硫氰酸胍、0. 5wt%十二烷基肌氨酸鈉、25mM檸檬酸鈉、pH7. 0,0. 5wt%巰基乙醇的水溶液。
7.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征還在于所述的玻璃珠振蕩破碎方法為間歇振蕩，每次振蕩IOs-IOmin后置于冰上冷卻0. 5-lOmin，總的破碎時(shí)間為0. 5-30min，玻璃珠直徑為 0. 2-lmm。
8.按照權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征還在于所述去除油脂的有機(jī)溶劑為氯仿、 二氯甲烷、石油醚或它們之間的任意比例混合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從產(chǎn)油微生物中提取RNA的方法。該方法包括以下步驟產(chǎn)油微生物菌體采用液氮研磨和玻璃珠振蕩相結(jié)合的方式進(jìn)行細(xì)胞破碎，在細(xì)胞破碎液中加入有機(jī)溶劑去除油脂，加入酸性苯酚/氯仿/異戊醇除去蛋白，離心取水相加入異丙醇沉淀，最后經(jīng)乙醇洗滌沉淀，真空干燥，可成功提取產(chǎn)油微生物RNA。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，成本低，完整性好。采用本方法獲得的RNA，可以滿足產(chǎn)油微生物分子生物學(xué)如Northern雜交、mRNA分離、RACE、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等方面的研究。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102250875SQ201010176579
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者唐偉, 張素芳, 譚海東 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所