專利名稱：一種利用斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測(cè)口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ab抗體的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用斑點(diǎn)免疫金滲濾法(DIGFA)檢測(cè)口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3AB抗體 的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄動(dòng)物共 患的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病以口腔黏膜、舌面、唇、鼻鏡、蹄部和乳房皮膚 發(fā)生水皰和潰爛為特征。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為A類動(dòng)物傳染病之首。由于 該病發(fā)病率高，傳播速度快，流行范圍廣，一旦暴發(fā)則不易控制和消滅，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)生 產(chǎn)和國(guó)際貿(mào)易，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，該病流行歷史長(zhǎng)久，在世界各地分布很廣。包括中國(guó)在 內(nèi)的大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家主要是通過(guò)注射滅活疫苗的方法預(yù)防FMD。因此，建立能區(qū)分滅活疫 苗免疫動(dòng)物與感染動(dòng)物的鑒別診斷方法非常必要。成熟的鑒別診斷方法既能真實(shí)的反映一 個(gè)地區(qū)或畜群中FMDV的感染狀況，也是OIE判定一個(gè)地區(qū)或國(guó)家有無(wú)FMD的依據(jù)之一?？谔阋叩牟≡瓰榭谔阋卟《?FMDV)，屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬。病毒有A、 C、0、SAT I、SAT II、SAT III和Asia I七個(gè)主型，每個(gè)型內(nèi)又有亞型，亞型內(nèi)還有抗原性差 異的毒株，各型之間抗原性不同，且?guī)缀鯖](méi)有交叉免疫性，這給FMD的診斷和防制帶來(lái)了極 大的困難。FMDV基因組含有一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)大的聚蛋白，聚蛋白逐級(jí)成熟 裂解為病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP :L、2A、2B、2C、3A、3B、3ABC、 3D等)。包括中國(guó)在內(nèi)的大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家主要是靠疫苗注射免疫來(lái)預(yù)防口蹄疫，而免疫 注射后的動(dòng)物血清中也能夠檢測(cè)到口蹄疫抗體，利用傳統(tǒng)口蹄疫病毒抗原包被檢測(cè)口蹄疫 抗體未能達(dá)到區(qū)分是野毒感染動(dòng)物還是滅活疫苗免疫動(dòng)物的目的。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供了一種利用斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測(cè)口 蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3AB抗體的檢測(cè)方法，本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便快速，不需特殊儀器設(shè)備，斑點(diǎn) 色澤鮮艷，特異性強(qiáng)，靈敏性高，結(jié)果易于判斷，且檢測(cè)樣本可以保存的特點(diǎn)。為達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種利用斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測(cè)口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3AB抗體的檢測(cè)方法，具體包 括如下步驟a) 口蹄疫FMD 3AB非結(jié)構(gòu)蛋白的合成；b) SPA膠體金的制備；c)反應(yīng)試劑盒的制作；d)應(yīng)用反應(yīng)試劑盒作為載體，先將步驟a)中合成的3AB非結(jié)構(gòu)蛋白抗原點(diǎn)于NC 膜上，封閉后加待測(cè)樣品，洗滌后用步驟b)中制備的SPA作為膠體金標(biāo)記蛋白檢測(cè)口蹄疫 非結(jié)構(gòu)蛋白3AB抗體。
所述的口蹄疫FMD 3AB非結(jié)構(gòu)蛋白的合成步驟為首先經(jīng)GenBank檢索分析，參照 已公布的亞洲株(AY687333)選取3AB基因，根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性和大腸桿菌的密碼子喜好 性原則，在不影響氨基酸序列的前提下，修改3AB序列中的部分稀有密碼子，將其分為9條 長(zhǎng)引物，各長(zhǎng)引物之間設(shè)計(jì)12個(gè)互補(bǔ)序列，經(jīng)重疊PCR法得到2條3AB基因，基因的核苷酸 序列分別為SEQIDN0. 1 P 3AB 5，NdeI 5，-GGAATTCCATATGATCAGCATTCCG-3 ’ ；SEQIDN0. 2 P 3AB 3，SalI 5，-ACGCGTCGACCTCAGT GACAATCAA 3，；然后在上述2條3AB基因中引入的酶切位點(diǎn)為NdeI和SalI ；所引入的表達(dá)載體 PET-28(a+)(購(gòu)于Novagen公司，代理商為廈門(mén)鷺隆生物科技發(fā)展有限公司)；利用表達(dá)載 體PET-28 (a+)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選重組質(zhì)粒，命 名為ΡΕΤ-28-3ΑΒ ；接著進(jìn)行重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)；然后將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體利用超聲破碎 儀破碎后進(jìn)行純化和復(fù)性。所述的超聲破碎時(shí)采用的超聲破碎緩沖液的配方為20mMTris-HCl，0. 5Μ NaCl, IMm EDTA PH8. 0，lmg/ml溶菌酶(BBI原裝，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司代理)。所述的純化過(guò)程中采用的包涵體洗滌液配方為20mM Tris_HClPH8. 0，0. 5M NaCl，2M碳酰二胺(Urea)，2%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton)；采用的包涵體變性緩沖液配 方為20mM Tris-HCl PH8. 0,0. 5M NaCl，8M 碳酰二胺(Urea)，IOOmM β-巰基乙醇，2% 聚 乙二醇辛基苯基醚(Triton)；所述的復(fù)性過(guò)程中采用的復(fù)性緩沖液配方為20mM Tris-HCl PH8. 0,50Mm NaCl，甘油。所述的SPA為為金黃色葡萄球菌重組A蛋白(購(gòu)于北京本元正陽(yáng)基因技術(shù)股份有 限公司)。所述的SPA膠體金的制備包括采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，然后膠體 金溶液中逐滴加入金黃色葡萄球菌重組A蛋白；其中所采用的重懸緩沖液為含酪蛋白， 0. 05%聚乙二醇 6000(PEG6000) ,0. 05% 吐溫-20，0. 01mol/L ρΗ7· 2 的 PBS 緩沖液；所采 用的膠體金稀釋液為含含1 %酪蛋白，0. 05%聚乙二醇6000 (PEG6000)，5 %蔗糖，0. 05%吐 溫-20，0. 01mol/L ρΗ7· 2 的 PBS 緩沖液。所述的反應(yīng)試劑盒為塑料方形小盒，大小為4. 8cmX3cmX0. 7cm，分底和蓋兩部 分，蓋面有直徑0. 5cm圓孔，盒內(nèi)有兩層，第一層為硝酸纖維素膜(NC膜)，NC膜下緊貼著第 二層為吸水紙墊。所述的步驟d)為在反應(yīng)試劑盒圓孔內(nèi)的NC膜上點(diǎn)兩點(diǎn)，一點(diǎn)為口蹄疫FMD 3AB 抗原lul，作為檢測(cè)點(diǎn)；另一點(diǎn)為已知口蹄疫FMD3AB抗體陽(yáng)性的豬血清IuL作為質(zhì)控點(diǎn)；室 溫干燥后加入IOOuL封閉液，滲入干燥后加入待檢血清IOOuL ；滲入后加入IOOuL沖洗；滲 入后加入標(biāo)記好的SPA膠體金SOuL ；待滲入后再加入洗滌液IOOuL,洗去未結(jié)合的SPA膠體 金；5min內(nèi)若在膜上檢測(cè)點(diǎn)和質(zhì)控點(diǎn)均出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)即為陽(yáng)性，若只有質(zhì)控點(diǎn)出現(xiàn)紅色斑 點(diǎn)，則為陰性，而檢測(cè)點(diǎn)和質(zhì)控點(diǎn)均不出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，則說(shuō)明試劑無(wú)效。所述的封閉液為含酪蛋白和0. 05%吐溫-20的0. 01mol/L pH 7. 2的PBS緩 沖液；所述的洗滌液為含0. 05%吐溫-20的0. 01mol/LpH 7. 2的PBS緩沖液；所述的PBS緩沖液配方為NaH2PO4 · H2O 0. 276g，無(wú)水 Na2HPO4 1. 136g，NaCl 8. 76g，KCl 0. 187g，加適 量蒸餾水溶解后定容至1000mL。所述的口蹄疫FMD 3AB抗原蛋白點(diǎn)樣時(shí)濃度為0. 0875mg/mL。本發(fā)明的有益效果是首先在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，絕大部分的非結(jié)構(gòu)蛋白已被消除， 因此免疫動(dòng)物后，體內(nèi)不產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體；而自然感染動(dòng)物體內(nèi)有非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)， 可刺激產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。本發(fā)明是以重組表達(dá)的口蹄疫3AB非結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原，利用SPA 膠體金的特性，研究膠體金免疫滲濾技術(shù)快速檢測(cè)口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3AB抗體，建立一種 能夠區(qū)分口蹄疫疫苗免疫動(dòng)物和野毒感染的快速檢測(cè)方法。主要應(yīng)用微孔濾膜(NC膜)作 載體的免疫檢測(cè)技術(shù)，先將抗原點(diǎn)于NC膜上，封閉后加待測(cè)樣品，洗滌后用膠體金探針檢 測(cè)相應(yīng)抗體。通過(guò)金顆粒來(lái)放大免疫反應(yīng)系統(tǒng)，使反應(yīng)結(jié)果在固相載體NC膜上顯示出來(lái)。 該法操作簡(jiǎn)便、快速，不需特殊儀器設(shè)備，斑點(diǎn)色澤鮮艷，易于判斷，且檢測(cè)樣本可以保存。 本發(fā)明是將純化的口蹄疫病毒3AB非結(jié)構(gòu)蛋白抗原包被在硝酸纖維膜上，利用膠體金標(biāo)記 SPA顯色，建立一種能夠區(qū)分口蹄疫疫苗免疫與野毒感染動(dòng)物的快速檢測(cè)方法。通過(guò)應(yīng)用 DIGFA法和ELISA方法同時(shí)對(duì)150份豬血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果DIGFA法陽(yáng)性率為6%，ELISA法 陽(yáng)性率為5.3%，兩者符合率達(dá)99. 3 %。本發(fā)明選用的口蹄疫病毒3AB非結(jié)構(gòu)蛋白抗原特 異性好，與膠體金標(biāo)記的SPA組成檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)口蹄疫病毒3AB非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，具 有特異性強(qiáng)，靈敏性高，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，結(jié)果易于判斷，且與口蹄疫免疫豬血清、豬細(xì)小 病毒、豬瘟、豬藍(lán)耳病和豬偽狂犬病毒陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。該方法的成功研制，能夠 簡(jiǎn)單快速地判斷動(dòng)物中是否感染口蹄疫病毒，為有效控制該病將發(fā)揮重要作用。特別對(duì)于 是養(yǎng)豬和養(yǎng)牛大國(guó)的中國(guó)，建立簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的區(qū)分口蹄疫疫苗抗體還是野毒感染產(chǎn)生 的抗體的檢測(cè)方法，以便更加廣泛地應(yīng)用到廣大養(yǎng)殖戶，隨時(shí)進(jìn)行檢測(cè)；基層獸醫(yī)部門(mén)定期 進(jìn)行大面積普查和監(jiān)測(cè)以及口岸一線部門(mén)開(kāi)展快速通關(guān)放行，這對(duì)于有效地控制口蹄疫的 傳播起到非常積極地效果，可以為預(yù)防這些傳染病提供診斷依據(jù)。


圖1是本發(fā)明FMD最佳點(diǎn)樣抗原濃度的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明一種配方，不同用量的封閉液的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明另一種配方，不同用量的封閉液的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖4是本發(fā)明膠體金標(biāo)記SPA最佳濃度的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。1、本實(shí)施例首先合成FMD 3AB非結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)引物和表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建所用的抗原為原核表達(dá)的口蹄疫3AB蛋白，F(xiàn)MD非結(jié)構(gòu)蛋白3AB基因的合成經(jīng)GenBank檢索分析，參照已公布的亞洲株(AY687333)選取3AB 基因，根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性和大腸桿菌的密碼子喜好性原則，在不影響氨基酸序列的前提 下，修改3AB序列中的部分稀有密碼子，將其分為9條長(zhǎng)引物，各長(zhǎng)引物之間設(shè)計(jì)12個(gè)互補(bǔ) 序列，經(jīng)重疊PCR法得到2條3AB基因，基因的核苷酸序列分別為SEQIDN0. 1
P 3AB 5，NdeI 5，~GGAATTCCATATGATCAGCATTCCG~3 ’ ；SEQIDNO. 2 P 3AB 3，Sail 5，-ACGCGTCGACCTCAGT GACAATCAA 3，。引入酶切位點(diǎn)NdeI和SalI用表達(dá)載體PET-28 (a+)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)，篩選重組質(zhì)粒，命名為ΡΕΤ-28-3ΑΒ。重組質(zhì)粒的表達(dá)將測(cè)序正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21 (DE3)感受態(tài)，挑取 陽(yáng)性單菌落到含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，按1 100接種于含50 μ g/ml卡那霉素的LB培 養(yǎng)基培養(yǎng)至0D0. 6 0. 8時(shí)加入IPTG至終濃度為lmmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)6h后收集菌體，取樣 用12% SDS-PAGE觀察分析結(jié)果。表達(dá)蛋白的純化、復(fù)性將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體用超聲破碎緩沖液(20mM Tris-HCl， 0. 5M NaCl，IMm EDTA，PH8. 0，lmg/ml溶菌酶)按20ml/g菌體重懸沉淀，用超聲破碎儀進(jìn)行 超聲破碎，分別收集超聲破碎上清和沉淀，取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，觀察目的蛋白表達(dá)情 況。超聲沉淀經(jīng)包涵體洗滌液(20mM Tris-HCl PH8. 0,0. 5M NaCl, 2M Urea, 2% Triton) 洗滌后用包涵體變性緩沖液(20mM Tris-HCl PH8. 0,0. 5MNaCl,8M Urea IOOmM β -巰基乙 醇，2% Triton)重懸，4°C攪拌過(guò)夜。溶解后的包涵體用鎳離子親和層析柱進(jìn)行純化，純化 方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將純化洗脫的蛋白用復(fù)性緩沖液(20mM Tris-HCl PH8. 0, 5OMmNaCl,
甘油)稀釋一倍后再用復(fù)性緩沖液至4°C進(jìn)行透析復(fù)性，每隔6 8h換液一次，共透析 24h，最后用超純水或用5mM Tris-HC1PH8.0進(jìn)行透析二次。為提高蛋白濃度可以用蔗糖或 PEG20000進(jìn)行濃縮，濃縮后的蛋白用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量，-80°C保存?zhèn)溆谩?、SPA膠體金的制備1)膠體金溶液的制備用檸檬酸三鈉還原法制備，取氯金酸ImL加入到99mL 超純水中，所得氯金酸溶液濃度為0.01%，用水浴磁力攪拌鍋加熱至沸騰，在磁力攪拌器以 一定轉(zhuǎn)速不斷攪拌下迅速加入2mL的1 %檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)攪拌加熱約15min至溶液 顏色穩(wěn)定不變。此法制得的膠體金呈葡萄酒色，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸收峰在520nm處， 得到的膠體金顆粒直徑約為20nm左右，冷卻后置4°C冰箱避光保存。2) SPA標(biāo)記取需制備量的膠體金溶液，用0. lmol/L K2CO3和0. lmol/L的HCl調(diào) 其pH至6.0。然后在磁力攪拌下逐滴加入SPA (每mL膠體金溶液加入6ug SPA)，繼續(xù)磁力 攪拌30min后加入5% PEG(MW6000)至終濃度0. 1 %，再繼續(xù)攪拌15min，最后放置4°C冰 箱，靜置過(guò)夜。次日將標(biāo)記好的SPA膠體金4000r/min離心lOmin，取上清液12000r/min 離心30min，小心吸棄上清。沉淀用重懸緩沖液(含酪蛋白，0.05% PEG6000,0. 05% Tween-20,0. 01mol/L ρΗ7· 2 的 PBS 緩沖液)恢復(fù)至原體積。12000r/min 離心 30min,棄 上清。沉淀用膠體金稀釋液(含酪蛋白，0.05% PEG6000，5%蔗糖，0.05% Tween-20， 0.01mol/L pH7. 2的PBS緩沖液)恢復(fù)至原體積的十分之一，置4°C冰箱備用。PBS緩沖液 配方為=NaH2PO4 .H2O 0. 276g，無(wú)水 Na2HPO4L 136g，NaCl 8. 76g，KCl 0. 187g，加適量蒸餾水 溶解后定容至1000mL。3、反應(yīng)試劑盒的制作反應(yīng)盒為塑料方形小盒，大小為4. 8cmX3cmX0. 7cm,分底和蓋兩部分，蓋面有直 徑0. 5cm圓孔，盒內(nèi)有兩層，朝蓋的第一層為硝酸纖維素膜(NC膜)，NC膜下緊貼著第二層 吸水紙墊。
4、應(yīng)用反應(yīng)試劑盒作為載體，先將步驟a)中合成的3AB非結(jié)構(gòu)蛋白抗原點(diǎn)于NC 膜上，封閉后加待測(cè)樣品，洗滌后用步驟b)中制備的SPA作為膠體金標(biāo)記蛋白檢測(cè)口蹄疫 非結(jié)構(gòu)蛋白3AB抗體。1)具體步驟在圓孔內(nèi)的NC膜上點(diǎn)兩點(diǎn)，一點(diǎn)為FMD 3AB抗原lul，作為檢測(cè)點(diǎn)； 另一點(diǎn)為已知FMD 3AB抗體陽(yáng)性的豬血清IuL作為質(zhì)控點(diǎn)；室溫干燥后加入IOOuL封閉液 (含酪蛋白和0.05%吐溫-20的O.Olmol/L pH 7. 2的PBS緩沖液)PBS緩沖液配方為 NaH2PO4 · H2O 0. 276g，無(wú)水 Na2HPO4 1. 136g，NaCl 8. 76g，KC10. 187g，加適量蒸餾水溶解后 定容至1000mL。滲入干燥后加入待檢血清IOOuL ；滲入后加入IOOuL洗滌液(含0. 05%吐 溫-20的0. 01mol/LpH 7. 2的PBS緩沖液)沖洗(可根據(jù)情況洗1遍 3遍)；滲入后加入 標(biāo)記好的SPA膠體金80uL ；待滲入后再加入洗滌液IOOuL (1遍 3遍)，洗去未結(jié)合的SPA 膠體金。5min內(nèi)若在膜上檢測(cè)點(diǎn)和質(zhì)控點(diǎn)均出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)即為陽(yáng)性，若只有質(zhì)控點(diǎn)出現(xiàn)紅 色斑點(diǎn)則為陰性，而檢測(cè)點(diǎn)和質(zhì)控點(diǎn)均不出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，則說(shuō)明試劑無(wú)效。2)最佳點(diǎn)樣抗原濃度的選擇將重組表達(dá)純化的FMD 3AB抗原用pH 9. 6的 0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液進(jìn)行倍比稀釋，然后根據(jù)濃度高低依次點(diǎn)樣在NC膜上，分別進(jìn)行 DIGFA實(shí)驗(yàn)，如圖1所示，本實(shí)施例所做的實(shí)驗(yàn)為1號(hào)板為檢測(cè)FMDV 3AB陽(yáng)性血清結(jié)果； 2號(hào)板為檢測(cè)FMDV 3AB陰性血清結(jié)果1 5.依次為濃度為0. 35,0. 175,0. 0875,0. 044和 0. 022mg/ml的重組3AB抗原；C.質(zhì)控點(diǎn)。由圖1可見(jiàn)點(diǎn)樣抗原量最小且實(shí)驗(yàn)結(jié)果斑點(diǎn)顏 色最清晰抗原濃度作為最佳點(diǎn)樣抗原濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)MDV 3AB蛋白以0.0875mg/mL 點(diǎn)樣時(shí)，抗原包被量最小且斑點(diǎn)顏色清晰。因此選擇0.0875mg/ml的FMDV 3AB蛋白點(diǎn)樣 IyL作為最佳抗原包被量。3)封閉液的選擇用不同配方的封閉液封閉NC膜進(jìn)行DIGFA實(shí)驗(yàn)，如圖2和圖3所示，本實(shí)施例所做的實(shí)驗(yàn)為圖2所用封閉液為(1)含酪蛋白、0.5% Tween-20的 0. 01mol/L ρΗ7·2 的 PBS ； (2)含 0. 5%酪蛋白、0. 5% Tween-20 的 0. 01mol/L ρΗ7·2 的 PBS ； (3)含 酪蛋白、0. 05% Tween-20 的0. 01mol/L PH7. 2 的PBS ； (4)含0. 5%酪蛋白、0. 05% Tween-20 的 0. 01mol/L PH7. 2 的 PBS ；圖 3 所用封閉液為(1)含 BSA,0. 5% Tween-20 的 0.01mol/L ρΗ7·2 的 PBS ； (2)含 0. 5% BSA、0. 5% Tween-20 的 0. 01mol/L ρΗ7· 2 的 PBS ； (3)含 1 % BSA,0. 05 % Tween-20 的 0. 01mol/L ρΗ7· 2 的 PBS ； (4)含 0. 5 % BSA,0. 05 % Tween-20的0. 01mol/L pH7. 2的PBS。并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，選擇斑點(diǎn)顏色清晰且背景 較淺的一組作為最適封閉液。結(jié)果顯示，用含酪蛋白、0.05% Tween-20的0. Olmol/L ρΗ7· 2 的 PBS 和 0. 5%酪蛋白、0. 05% Tween-20 的 0. 01mol/L ρΗ7· 2 的 PBS 封閉效果最好， 斑點(diǎn)顯色清楚，背景較淺。4)膠體金標(biāo)記SPA最佳濃度的選擇將SPA膠體金做倍比稀釋后與點(diǎn)有FMDV 3ΑΒ 抗原的NC膜作用，選擇背景顏色淺而效果最好的稀釋倍數(shù)作為膠體金標(biāo)記SPA濃度。如圖 4所示，本實(shí)施例所做的實(shí)驗(yàn)為1 4號(hào)板分別為按原體積1/15、1/10、1/5、1/2.5稀釋的 SPA膠體金，結(jié)果顯示，按原體積1/10的稀釋倍數(shù)效果較好，且背景顏色淺。
權(quán)利要求
一種利用斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測(cè)口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3AB抗體的檢測(cè)方法，其特征在于具體包括如下步驟a)口蹄疫FMD 3AB非結(jié)構(gòu)蛋白的合成；b)SPA膠體金的制備；c)反應(yīng)試劑盒的制作；d)應(yīng)用反應(yīng)試劑盒作為載體，先將步驟a)中合成的3AB非結(jié)構(gòu)蛋白抗原點(diǎn)于NC膜上，封閉后加待測(cè)樣品，洗滌后用步驟b)中制備的SPA作為膠體金標(biāo)記蛋白檢測(cè)口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3AB抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的一種利用斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測(cè)口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3AB抗體的 檢測(cè)方法，其特征在于所述的口蹄疫FMD 3AB非結(jié)構(gòu)蛋白的合成步驟為首先經(jīng)GenBank檢 索分析，參照已公布的亞洲株(AY687333)選取3AB基因，根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性和大腸桿菌 的密碼子喜好性原則，在不影響氨基酸序列的前提下，修改3AB序列中的部分稀有密碼子， 將其分為9條長(zhǎng)引物，各長(zhǎng)引物之間設(shè)計(jì)12個(gè)互補(bǔ)序列，經(jīng)重疊PCR法得到2條3AB基因， 基因的核苷酸序列分別為SEQIDN0. 1 P 3AB 5' Ndel 5' -GGAATTCCATATGATCAGCATTCCG-3’ ；SEQIDN0. 2 P 3AB 3' Sail 5' -ACGCGTCGACCTCAGT GACAATCAA 3'；然后在上述2條3AB基因中引入的酶切位點(diǎn)為Ndel和Sail ；所引入的表達(dá)載體 PET-28 (a+)；利用表達(dá)載體PET-28 (a+)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a感受態(tài) 細(xì)胞中，篩選重組質(zhì)粒，命名為PET-28-3AB ；接著進(jìn)行重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)；然后將誘導(dǎo)表 達(dá)后的菌體利用超聲破碎儀破碎后進(jìn)行純化和復(fù)性。
3.如權(quán)利要求2所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征 在于所述的超聲破碎時(shí)采用的超聲破碎緩沖液的配方為20mM Tris-HCl，0. 5M NaCl,lMm EDTA PH8. 0, lmg/ml 溶菌酶。
4.如權(quán)利要求2所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征 在于所述的純化過(guò)程中采用的包涵體洗滌液配方為20mM Tris-HCl PH8. 0,0. 5M NaCl, 2M碳酰二胺，2%聚乙二醇辛基苯基醚；采用的包涵體變性緩沖液配方為20mM Tris-HCl PH8. 0,0. 5M NaCl，8M碳酰二胺，100mM ^ -巰基乙醇，2%聚乙二醇辛基苯基醚；所述的復(fù)性 過(guò)程中采用的復(fù)性緩沖液配方為20mM Tris-HC1PH8. 0,50Mm NaCl，l%甘油。
5.如權(quán)利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征在 于所述的SPA為為金黃色葡萄球菌重組A蛋白。
6.如權(quán)利要求1或5所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特 征在于所述的SPA膠體金的制備包括采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，然后膠體金 溶液中逐滴加入金黃色葡萄球菌重組A蛋白；其中所采用的重懸緩沖液為含酪蛋白， 0. 05%聚乙二醇6000，0. 05%吐溫-20，0. 01mol/L pH7. 2的PBS緩沖液；所采用的膠體金稀 釋液為含含酪蛋白，0. 05%聚乙二醇6000，5%蔗糖，0. 05%吐溫-20，0. 01mol/L pH7. 2 的PBS緩沖液。
7.如權(quán)利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征在于所述的反應(yīng)試劑盒為塑料方形小盒，大小為4. 8cmX3cmX0. 7cm，分底和蓋兩部分，蓋 面有直徑0. 5cm圓孔，盒內(nèi)有兩層，第一層為硝酸纖維素膜，NC膜下緊貼著第二層為吸水紙墊。
8.如權(quán)利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征在 于所述的步驟d)為在反應(yīng)試劑盒圓孔內(nèi)的NC膜上點(diǎn)樣，一點(diǎn)為口蹄疫FMD 3AB抗原lul， 作為檢測(cè)點(diǎn)；另一點(diǎn)為已知口蹄疫FMD 3AB抗體陽(yáng)性的豬血清IuL作為質(zhì)控點(diǎn)；室溫干燥 后加入IOOuL封閉液，滲入干燥后加入待檢血清IOOuL ；滲入后加入IOOuL沖洗；滲入后加 入標(biāo)記好的SPA膠體金SOuL ；待滲入后再加入洗滌液IOOuL,洗去未結(jié)合的SPA膠體金； 5min內(nèi)若在膜上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)即為陽(yáng)性，否則為陰性。
9.如權(quán)利要求8所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征在 于所述的封閉液為含酪蛋白和0. 05%吐溫-20的0. 01mol/L pH 7. 2的PBS緩沖液； 所述的洗滌液為含0. 05%吐溫-20的0. Olmol/LpH 7. 2的PBS緩沖液；PBS緩沖液配方為 NaH2PO4 · H2O 0. 276g，無(wú)水 Na2HPO4L 136g，NaCl 8. 76g，KC10. 187g，加適量蒸餾水溶解后 定容至1000mL。
10.如權(quán)利要求8所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征 在于所述的口蹄疫FMD 3AB抗原蛋白點(diǎn)樣時(shí)濃度為0. 0875mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測(cè)口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3AB抗體的檢測(cè)方法，具體包括如下步驟a)口蹄疫FMD 3AB非結(jié)構(gòu)蛋白的合成；b)SPA膠體金的制備；c)反應(yīng)試劑盒的制作；d)應(yīng)用反應(yīng)試劑盒作為載體，先將步驟a)中合成的3AB非結(jié)構(gòu)蛋白抗原點(diǎn)于NC膜上，封閉后加待測(cè)樣品，洗滌后用步驟b)中制備的SPA作為膠體金標(biāo)記蛋白檢測(cè)口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3AB抗體。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便快速，不需特殊儀器設(shè)備，斑點(diǎn)色澤鮮艷，特異性強(qiáng)，靈敏性高，結(jié)果易于判斷，且檢測(cè)樣本可以保存的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101819209SQ20101017706
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月15日
發(fā)明者吳紹強(qiáng), 孔繁德, 徐淑菲, 朱文釧, 林祥梅, 梅琳, 陳信忠, 韓雪清, 龔艷清 申請(qǐng)人:廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心