專利名稱：蝸牛酶在定向水解蘆丁生物合成槲皮素中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物生物合成領(lǐng)域，具體涉及一種蝸牛酶在水解蘆丁制備槲皮素 中的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)搬皮素(Quercetin，3，5，7，3' ，4' —pentahydroxyflavanone)是一禾中 在自然界分布非常廣泛的黃酮類苷元化合物，是一種優(yōu)秀的天然抗氧化劑，具有去痰止咳 平喘、抗炎、抗過敏、解痙、強心、降血壓、降血脂、抗心律失常、抗血小板聚集、抗氧化、抗腫 瘤、抗病毒等廣泛的藥理作用。因此，槲皮素一直是藥學界的熱點化合物之一，國內(nèi)外對其 理化性質(zhì)、提取分離、藥理活性及臨床應(yīng)用均做了大量研究。槲皮素作為蘆丁(Rutin，Quercetin-3-rutinose)的苷元，是自然界中具有顯著 生理活性的代表性苷元型黃酮類化合物。盡管槲皮素廣泛存在于食用或藥用植物中，但真 正以苷元形式分布在自然界中較少，絕大多數(shù)是以其蕓香糖苷的形式(蘆丁)存在，如在槐 花中蘆丁含量最高可達28%。此外，由于槲皮素分子中含有五個活潑的酚羥基，由于羥基的 保護_去保護使得其化學合成的成本居高不下，因此其制備方法主要有以下兩種提取法 和水解法。提取法從植物或植物提取物中采用溶劑萃取法提純槲皮素，如CN00808993公開 的從生物類黃酮中回收異槲皮素(Isoquercitrin，Quercetin-3-glucose)方法，即從生物 類黃酮漿(回收類黃酮的母液殘余物)中采用乙酸甲酯和水的混合溶劑提取，但由于類黃 酮漿中含有槲皮素、異槲皮素以及其他類似物，單純采用溶劑萃取法難以低成本制備槲皮
ο水解法以蘆丁等低成本糖苷型黃酮化合物為原料采用水解法制備槲皮素的報道 較多，其水解反應(yīng)過程常使用化學催化或酶催化水解法。(1)化學法水解文獻報道最多， 是由于蘆丁苷鍵(鼠李糖苷鍵和葡萄糖苷鍵)為半縮醛結(jié)構(gòu)，對酸不穩(wěn)定，對堿較穩(wěn)定，易 被酸催化水解，主要采用鹽酸、硫酸等無機酸作催化劑，水解反應(yīng)機理是苷鍵原子先被質(zhì)子 化，然后苷鍵斷裂形成糖基正離子或半椅型的中間體，該中間體再與水結(jié)合形成糖，并釋 放催化劑質(zhì)子。但是酸催化水解法的水解溫度較高，使用的酸對設(shè)備腐蝕嚴重，并產(chǎn)生大 量的酸性廢水，對環(huán)境造成污染。水解方式除前述常規(guī)水解方法外，還有加壓水解法，如 CN200610065217公開的用蘆丁制備槲皮素和異槲皮苷的方法，在高壓反應(yīng)釜中投入蘆丁漿 液，加熱至沸，采用加壓水解獲得水解產(chǎn)物槲皮素和異槲皮苷，但蘆丁的水解過程中槲皮素 和異槲皮苷共存，必須對水解產(chǎn)物采用分離手段才能獲得槲皮素。(2)酶催化水解法主要以 糖苷酶為催化劑，如CN03133636公開的酶法水解蘆丁制備異槲皮素和槲皮素的方法，以槐 米為高溫好氧菌或曲霉菌或羅倫隱球酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)酶誘導物，液態(tài)或固態(tài)法產(chǎn)糖苷酶， 通過調(diào)控反應(yīng)條件水解蘆丁產(chǎn)異槲皮苷和槲皮素的混合物，但未實現(xiàn)槲皮素的定向轉(zhuǎn)化。 綜上，上述水解法均未能實現(xiàn)蘆丁定向水解制備槲皮素。考慮到水解反應(yīng)的效率和對環(huán)境 友好，采用酶法制備槲皮素更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
蝸牛酶曾報道用于降解天然產(chǎn)物以及多糖，如CN01136891公開的應(yīng)用蝸牛酶降 解纖維素、人參、黃芪、甘草等天然產(chǎn)物和殼聚糖、果膠、卡拉膠、瓊膠、褐藻膠、黃原膠、田菁 膠、葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、肝素、硫酸多糖等多糖的方法，均是以內(nèi)切β (1-4)糖苷鍵 的形式實現(xiàn)。類似的研究，還有CNOl 133410公開的用酶水解人參皂甙制備20- β -D-吡喃葡 萄糖基原人參二醇的方法，均表明蝸牛酶應(yīng)用于天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化具有良好的可行性。 但是，未見應(yīng)用蝸牛酶定向水解蘆丁分子中蕓香糖苷鍵的報道。因此，本專利首次應(yīng)用蝸牛酶催化水解蘆丁分子中的蕓香糖苷鍵，實現(xiàn)槲皮素的 定向生物合成，表現(xiàn)出酶法水解蘆丁制備槲皮素過程的高度專一性，為今后大規(guī)模工業(yè)化 生物合成槲皮素的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為推動其在醫(yī)藥、食品、化妝品等工業(yè)中的廣泛應(yīng)用具 有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對以上問題，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用蝸牛酶催化水解蘆丁定向生物 合成槲皮素的方法。該方法可以高效地實現(xiàn)定向水解蘆丁分子中的蕓香糖苷鍵，為酶法制 備槲皮素的工業(yè)化應(yīng)用提供了新工藝。技術(shù)方案蝸牛酶在定向水解蘆丁生物合成槲皮素中的應(yīng)用，將蝸牛酶粗酶制劑 加入濃度為0. 005 0. 100g/L的蘆丁底物溶液中，使得溶液中蝸牛酶濃度為0. 1 50g/L， PH 3 9，進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度10 70°C，反應(yīng)時間0. 1 36h，反應(yīng)結(jié)束，獲得水 解產(chǎn)物槲皮素。上述反應(yīng)時間優(yōu)選為0. 1 6h。蝸牛酶在定向水解蘆丁生物合成槲皮素中的應(yīng)用，配制作固定化酶用的膠體溶 液，所述膠體溶液中膠體的質(zhì)量濃度為0. 5 15%，加入蝸牛酶粗酶粉，使得溶液中蝸牛酶 的濃度為0. 1 50g/L，混合均勻后，滴入交聯(lián)劑溶液中固化0. 5 12h，制成大小均勻的 球狀或方形固定化顆粒，洗滌后備用；將固定化蝸牛酶裝填于柱狀反應(yīng)器，用泵輸送濃度為 0. 005 0. 100g/L的蘆丁底物溶液經(jīng)過固定床，進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度10 70°C， 反應(yīng)時間0. 1 72h，反應(yīng)結(jié)束，獲得水解產(chǎn)物槲皮素。上述膠體為海藻酸鈉、卡拉膠或明膠。上述反應(yīng)時間為0. 5 24h。上述蝸牛酶粗酶在溶液中的濃度優(yōu)選為0. 5 20g/L。上述蘆丁底物溶液濃度優(yōu)選為0. 01 0. 05g/L。上述pH優(yōu)選5 7。上述反應(yīng)溫度優(yōu)選為20 45°C。有益效果(1)以蝸牛酶的粗酶制劑或固定化酶制劑用于催化水解蘆丁定向生物 合成槲皮素，不僅催化劑來源廣泛、制備容易、成本低廉，而且酶制劑穩(wěn)定性高、易于保存、 催化效率和專一性高。因此，使用蝸牛酶可大幅度降低槲皮素的生產(chǎn)成本，酶催化轉(zhuǎn)化率 高，且產(chǎn)物專一。(2)采用本發(fā)明所述的技術(shù)方案得到的槲皮素由于在極性溶劑中的溶解度低于底 物蘆丁，可以通過常規(guī)的減壓濃縮輕易地從酶促轉(zhuǎn)化體系中分離，剩余的底物蘆丁可以繼 續(xù)酶促水解。因而，整個酶促反應(yīng)工藝基本上無廢棄物產(chǎn)生，無環(huán)境污染，催化劑價格低廉，具有非常良好的工業(yè)化應(yīng)用前景，可以滿足迅速發(fā)展的醫(yī)藥工業(yè)和日化工業(yè)的需要。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。本發(fā)明實施例中使用的蘆丁和槲皮素測定方法為高效液相色譜法(1)蘆丁色譜柱Alltima C18 (4. 6mmX 250mm，5 μ m)，流動相四氫呋喃-0. 02% 磷酸(25 75，V/V)；檢測波長:360nm ；流速1. OmL/min ；進樣量20 μ L。(2)槲皮素色譜柱Alltima C18 (4. 6讓X 250讓，5 μ m)，流動相乙腈 _0· 5mol/ LpH4. O醋酸緩沖液(27 73，V/V)；檢測波長:360nm ；流速1. OmL/min ；進樣量20 μ L。其中，產(chǎn)物槲皮素的轉(zhuǎn)化率計算方法為
轉(zhuǎn)產(chǎn)物槲皮素的摩爾g ^10QQi ^4- ~初始蘆丁原料的摩爾量 &
蝸牛酶為催化劑，以蘆丁為原料定向生物合成槲皮素的反應(yīng)式見下。
鍋牛酶
A、蝸牛酶的游離酶催化水解蘆丁定向生物合成槲皮素
將蘆丁溶于PH 7的緩沖液中，得到濃度為0.005g/L的蘆丁底物溶液。將該底物 溶液置于50mL具塞錐形瓶中，將蝸牛酶粗酶制劑按50g/L的比例加入，塞緊磨口瓶塞，于 120rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床中進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度40°C，反應(yīng)時間0. 5h。反應(yīng)結(jié)束，HPLC 檢測水解產(chǎn)物槲皮素的摩爾轉(zhuǎn)化率為92%。B、蝸牛酶的固定化酶催化水解蘆丁定向生物合成槲皮素用卡拉膠配制作固定化酶用的0. 5% wt膠體溶液，加入50g/L的蝸牛酶粗酶粉，混 合均勻后，滴入交聯(lián)劑溶液中固化3h，制成大小均勻的方形固定化顆粒，洗滌后備用。將固定化蝸牛酶裝填于柱狀反應(yīng)器，用泵輸送濃度為0. 005g/L的蘆丁底物溶液 經(jīng)過固定床，進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度40°C，反應(yīng)時間12h，反應(yīng)結(jié)束，HPLC檢測水解產(chǎn) 物槲皮素的摩爾轉(zhuǎn)化率為82%。實施例2A、蝸牛酶的游離酶催化水解蘆丁定向生物合成槲皮素將蘆丁溶于pH3的緩沖液中，得到濃度為0. 100g/L的蘆丁底物溶液。將該底物
5溶液置于50mL具塞錐形瓶中，將蝸牛酶粗酶制劑按0. lg/L的比例加入，塞緊磨口瓶塞，于 120rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床中進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度10°C，反應(yīng)時間36h。反應(yīng)結(jié)束，HPLC 檢測水解產(chǎn)物槲皮素的摩爾轉(zhuǎn)化率為22%。B、蝸牛酶的固定化酶催化水解蘆丁定向生物合成槲皮素用明膠配制作固定化酶用的15% wt膠體溶液，加入0. 100g/L的蝸牛酶粗酶粉，混 合均勻后，滴入交聯(lián)劑溶液中固化12h，制成大小均勻的方形固定化顆粒，洗滌后備用。將固定化蝸牛酶裝填于柱狀反應(yīng)器，用泵輸送濃度為0. 100g/L的蘆丁底物溶液 經(jīng)過固定床，進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度10°c，反應(yīng)時間72h，反應(yīng)結(jié)束，HPLC檢測水解產(chǎn) 物槲皮素的摩爾轉(zhuǎn)化率為48%。實施例3A、蝸牛酶的游離酶催化水解蘆丁定向生物合成槲皮素將蘆丁溶于pH 9的緩沖液中，得到濃度為0. 025g/L的蘆丁底物溶液。將該底物 溶液置于50mL具塞錐形瓶中，將蝸牛酶粗酶制劑按0. 5g/L的比例加入，塞緊磨口瓶塞，于 120rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床中進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度70°C，反應(yīng)時間0. Ih0反應(yīng)結(jié)束，HPLC 檢測水解產(chǎn)物槲皮素的摩爾轉(zhuǎn)化率為23%。B、蝸牛酶的固定化酶催化水解蘆丁定向生物合成槲皮素用海藻酸鈉配制作固定化酶用的5% wt膠體溶液，加入0. 5g/L的蝸牛酶粗酶粉， 混合均勻后，滴入交聯(lián)劑溶液中固化0. 5h，制成大小均勻的球狀固定化顆粒，洗滌后備用。將固定化蝸牛酶裝填于柱狀反應(yīng)器，用泵輸送濃度為0. 025g/L的蘆丁底物溶液 經(jīng)過固定床，進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度70°C，反應(yīng)時間0. Ih,反應(yīng)結(jié)束，HPLC檢測水解 產(chǎn)物槲皮素的摩爾轉(zhuǎn)化率為11%。實施例4A、蝸牛酶的游離酶催化水解蘆丁定向生物合成槲皮素將蘆丁溶于pH 6. 2的緩沖液中，得到濃度為0. 024g/L的蘆丁底物溶液。將該底 物溶液置于50mL具塞錐形瓶中，將蝸牛酶粗酶制劑按0. 25g/L的比例加入，塞緊磨口瓶塞， 于120rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床中進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度34°C，反應(yīng)時間0. 5h。反應(yīng)結(jié)束， HPLC檢測水解產(chǎn)物槲皮素的摩爾轉(zhuǎn)化率為95%。B、蝸牛酶的固定化酶催化水解蘆丁定向生物合成槲皮素用海藻酸鈉配制作固定化酶用的2% wt膠體溶液，加入0. 5g/L的蝸牛酶粗酶粉， 混合均勻后，滴入交聯(lián)劑溶液中固化3h，制成大小均勻的球狀固定化顆粒，洗滌后備用。將固定化蝸牛酶裝填于柱狀反應(yīng)器，用泵輸送濃度為0. 024g/L的蘆丁底物溶液 經(jīng)過固定床，進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度35°C，反應(yīng)時間36h，反應(yīng)結(jié)束，HPLC檢測水解產(chǎn) 物槲皮素的摩爾轉(zhuǎn)化率為98%。
權(quán)利要求
蝸牛酶在定向水解蘆丁生物合成槲皮素中的應(yīng)用，其特征在于將蝸牛酶粗酶制劑加入濃度為0.005～0.100g/L的蘆丁底物溶液中，使得溶液中蝸牛酶濃度為0.1～50g/L，pH3～9，進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度10～70℃，反應(yīng)時間0.1～36h，反應(yīng)結(jié)束，獲得水解產(chǎn)物槲皮素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝸牛酶在定向水解蘆丁生物合成槲皮素中的應(yīng)用，其特征在 于所述反應(yīng)時間優(yōu)選為0. 1 6h。
3.蝸牛酶在定向水解蘆丁生物合成槲皮素中的應(yīng)用，其特征在于配制作固定化酶用 的膠體溶液，所述膠體溶液中膠體的質(zhì)量濃度為0. 5 15%，加入蝸牛酶粗酶粉，使得溶液 中蝸牛酶的濃度為0. 1 50g/L，混合均勻后，滴入交聯(lián)劑溶液中固化0. 5 12h，制成大小 均勻的球狀或方形固定化顆粒，洗滌后備用；將固定化蝸牛酶裝填于柱狀反應(yīng)器，用泵輸送 濃度為0. 005 0. 100g/L的蘆丁底物溶液經(jīng)過固定床，進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度10 70°C，反應(yīng)時間0. 1 72h，反應(yīng)結(jié)束，獲得水解產(chǎn)物槲皮素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蝸牛酶在定向水解蘆丁生物合成槲皮素中的應(yīng)用，其特征在 于所述膠體為海藻酸鈉、卡拉膠或明膠。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蝸牛酶在定向水解蘆丁生物合成槲皮素中的應(yīng)用，其特征在 于所述反應(yīng)時間為0. 5 24h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的蝸牛酶在定向水解蘆丁生物合成槲皮素中的應(yīng)用，其特 征在于所述蝸牛酶粗酶在溶液中的濃度優(yōu)選為0. 5 20g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的蝸牛酶在定向水解蘆丁生物合成槲皮素中的應(yīng)用，其特 征在于所述蘆丁底物溶液濃度優(yōu)選為0. 01 0. 05g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的蝸牛酶在定向水解蘆丁生物合成槲皮素中的應(yīng)用，其特 征在于所述pH優(yōu)選5 7。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的蝸牛酶在定向水解蘆丁生物合成槲皮素中的應(yīng)用，其特 征在于所述反應(yīng)溫度優(yōu)選為20 45°C。
全文摘要
蝸牛酶在定向水解蘆丁生物合成槲皮素中的應(yīng)用，將蝸牛酶粗酶制劑加入濃度為0.005～0.100g/L的蘆丁底物溶液中，使得溶液中蝸牛酶濃度為0.1～50g/L，pH 3～9，進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度10～70℃，反應(yīng)時間0.1～36h，反應(yīng)結(jié)束，獲得水解產(chǎn)物槲皮素。以蝸牛酶的粗酶制劑或固定化酶制劑用于催化水解蘆丁定向生物合成槲皮素，不僅催化劑來源廣泛、制備容易、成本低廉，而且酶制劑穩(wěn)定性高、易于保存、催化效率和專一性高。因此，使用蝸牛酶可大幅度降低槲皮素的生產(chǎn)成本，酶催化轉(zhuǎn)化率高，且產(chǎn)物專一。
文檔編號C12P17/06GK101880698SQ20101017806
公開日2010年11月10日 申請日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者吳福安, 張妍, 王俊, 王蒙, 謝謝 申請人:江蘇科技大學