專利名稱：Delta1轉(zhuǎn)導(dǎo)的OP9細(xì)胞共培養(yǎng)體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞共培養(yǎng)體系，尤其是一種簡單有效的體外T細(xì)胞定向分化的體系，即Deltal轉(zhuǎn)導(dǎo)的0P9細(xì)胞共培養(yǎng)體系的方法。
背景技術(shù)：
人體對自身的病變細(xì)胞和病原體的清除由免疫系統(tǒng)來承擔(dān)。免疫系統(tǒng)的細(xì)胞成分主要由B細(xì)胞、T細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞來完成。T細(xì)胞分為細(xì)胞殺傷CD8T細(xì)胞和CD4助細(xì)胞。由于T細(xì)胞在自身免疫性疾病、病毒感染、腫瘤殺傷、細(xì)菌及真菌感染中的重要作用，T細(xì)胞及人工改造的抗原特異性細(xì)胞被用來治療腫瘤、對特定病毒缺乏免疫力的病原體感染和針對自身的過度免疫反應(yīng)。體外人工誘導(dǎo)功能性T細(xì)胞并賦于其抗原特異性是治療自身免疫生疾病、久治不愈的感染性疾病的有效手段之一。在一種簡單的單層基質(zhì)細(xì)胞的作用下，能夠分化出T細(xì)胞的這種能力不僅有助于解決關(guān)于T細(xì)胞的產(chǎn)生需要分子間的相互作用的基礎(chǔ)性問題，而且提供一個研究T細(xì)胞發(fā)育的新系統(tǒng)。在發(fā)現(xiàn)0P9-DL1細(xì)胞之前，研究T細(xì)胞的發(fā)育需要FTOCs。這種FTOCs雖然有效，但是很復(fù)雜而且效率相當(dāng)?shù)?。因此，需要發(fā)明一種新的簡單有效的體外T細(xì)胞分化體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，設(shè)計(jì)了一個操作簡便、效率高的0P9-DL1細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系，體外獲得T細(xì)胞。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種Deltal轉(zhuǎn)導(dǎo)的0P9細(xì)胞共培養(yǎng)體系的方法，包括以下步驟(D0P9-DL1細(xì)胞失去支持HSCs發(fā)育成為B細(xì)胞的能力；(2)0P9-DL1獲得誘導(dǎo)HSCs發(fā)育成為T細(xì)胞的正常的程序。具體地說，0P9-載體和小鼠Delta-like 1轉(zhuǎn)導(dǎo)0P9細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞系保存在添加了 20%牛血清的改良培養(yǎng)基中；干細(xì)胞因子Flt3-L和IL-7的濃度依照R&D使用說明添加，祖細(xì)胞接種到平板的前一天，每個孔板中的基質(zhì)細(xì)胞數(shù)要達(dá)到2X104;將祖細(xì)胞以不同的密度添加到不同孔板的基質(zhì)細(xì)胞，確定產(chǎn)生最佳淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞添加濃度；培養(yǎng)一周后，用 0. 53m MEDTA/PBS，pH7. 4來收集基質(zhì)細(xì)胞和造血細(xì)胞，然后，3000-10000的造血細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共同轉(zhuǎn)接到新鮮的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；經(jīng)過幾周的分化觀察后，用基質(zhì)細(xì)胞通過 VCAM-I抗體染色的方法被去除，而死亡細(xì)胞則通過7-aminoactinomycinS染色被去除，當(dāng)造血細(xì)胞的得率達(dá)到95%，此培養(yǎng)條件和細(xì)胞密度可取。本發(fā)明的有益效果是0P9_DL1細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系，可以誘導(dǎo)許多不同來源的祖細(xì)胞發(fā)育成為T細(xì)胞。到目前為止，我們已經(jīng)可以高效的誘導(dǎo)或者說支持分化為T細(xì)胞的干細(xì)胞有小鼠胚胎肝細(xì)胞來源的HSCs，從骨髓來源的HSCs，未分化的ESCs，骨髓來源的淋巴祖細(xì)胞，胸腺來源的祖細(xì)胞和人Cord血來源的HSCs。
具體實(shí)施例方式小鼠胚胎嵌入RAG-1/GFP基因的雄性小鼠與C57BL/6雌性小鼠交配產(chǎn)生的 RAG-I/GFP 胚胎。0P9共培養(yǎng)0P9-載體和小鼠Delta-like 1轉(zhuǎn)導(dǎo)0P9細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞系保存在添加了 20%牛血清的改良培養(yǎng)基中。干細(xì)胞因子Flt3-L和IL-7的濃度依照R&D使用說明添加。祖細(xì)胞接種到平板的前一天，每個孔板中的基質(zhì)細(xì)胞數(shù)要達(dá)到2X104。然后，將祖細(xì)胞以不同的密度添加到不同孔板的基質(zhì)細(xì)胞，目的是為了確定產(chǎn)生最佳淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞添加濃度。培養(yǎng)一周后，用0.53m M EDTA/PBS(pH7. 4)來收集基質(zhì)細(xì)胞和造血細(xì)胞。然后，3000-10000的造血細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共同轉(zhuǎn)接到新鮮的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。經(jīng)過幾周的分化觀察后，用基質(zhì)細(xì)胞通過VCAM-I抗體染色的方法被去除，而死亡細(xì)胞則通過 7-aminoactinomycinS染色被去除。當(dāng)造血細(xì)胞的得率達(dá)到95%則認(rèn)為此培養(yǎng)條件和細(xì)胞密度可取。細(xì)胞分選骨髓陰性細(xì)胞的獲取和富集是通過與標(biāo)記抗體的混合孵化，包括 ⑶45RA，⑶19，Gr-I,⑶llb/Mac-1，Ter-119 ；然后通過MACS細(xì)胞分離系統(tǒng)分離陰性細(xì)胞部分。陽性細(xì)胞則被電子控出。移植移植前4小時(shí)，同類系LY5. 1小鼠要經(jīng)過單劑量960rad的照射。然后，IO5 受體骨髓細(xì)胞與105Lin_c-Kit_Sca-l_分離細(xì)胞混合，注射到受體內(nèi)。經(jīng)過21- 天觀察細(xì)胞注射和分化情況，并觀察其致瘤性。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種Deltal轉(zhuǎn)導(dǎo)的0P9細(xì)胞共培養(yǎng)體系的方法，其特征在于，包括以下步驟(1) 0P9-DL1細(xì)胞失去支持HSCs發(fā)育成為B細(xì)胞的能力；(2)0P9_DL1獲得誘導(dǎo)HSCs發(fā)育成為 T細(xì)胞的正常的程序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Deltal轉(zhuǎn)導(dǎo)的0P9細(xì)胞共培養(yǎng)體系的方法，其特征在于，包括以下步驟0P9-載體和小鼠Delta-like 1轉(zhuǎn)導(dǎo)0P9細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞系保存在添加了 20% 牛血清的改良培養(yǎng)基中；干細(xì)胞因子Flt3-L和IL-7的濃度依照R&D使用說明添加，祖細(xì)胞接種到平板的前一天，每個孔板中的基質(zhì)細(xì)胞數(shù)要達(dá)到2X104 ；將祖細(xì)胞以不同的密度添加到不同孔板的基質(zhì)細(xì)胞，確定產(chǎn)生最佳淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞添加濃度；培養(yǎng)一周后，用 0. 53m M EDTA/PBS, pH7. 4來收集基質(zhì)細(xì)胞和造血細(xì)胞，然后，3000-10000的造血細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共同轉(zhuǎn)接到新鮮的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；經(jīng)過幾周的分化觀察后，用基質(zhì)細(xì)胞通過VCAM-I抗體染色的方法被去除，而死亡細(xì)胞則通過7-aminoactinomycinS染色被去除， 當(dāng)造血細(xì)胞的得率達(dá)到95 %，此培養(yǎng)條件和細(xì)胞密度可取。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Delta1轉(zhuǎn)導(dǎo)的OP9細(xì)胞共培養(yǎng)體系的方法，包括以下步驟(1)OP9-DL1細(xì)胞失去支持HSCs發(fā)育成為B細(xì)胞的能力；(2)OP9-DL1獲得誘導(dǎo)HSCs發(fā)育成為T細(xì)胞的正常的程序。本發(fā)明OP9-DL1細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系，可以誘導(dǎo)許多不同來源的祖細(xì)胞發(fā)育成為T細(xì)胞。到目前為止，我們已經(jīng)可以高效的誘導(dǎo)或者說支持分化為T細(xì)胞的干細(xì)胞有小鼠胚胎肝細(xì)胞來源的HSCs，從骨髓來源的HSCs，末分化的ESCs，骨髓來源的淋巴祖細(xì)胞，胸腺來源的祖細(xì)胞和人Cord血米源的HSCs。
文檔編號C12N5/0789GK102250834SQ20101017825
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者侯士芳, 孟恒星, 張宇光, 王雪蓮, 陳曉波, 黃家學(xué) 申請人:協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司