專利名稱：一種變構(gòu)酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種變構(gòu)酸的制備方法，特別涉及一種利用脂肪酶水解變構(gòu)霉素來制 備變構(gòu)酸的制備方法。
背景技術(shù)：
核盤菌[Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary]是世界范圍的主要病害，它 可以侵染400多種雙子葉植物，給許多國家造成嚴重的經(jīng)濟損失。國際上雖對油菜菌核病 進行了廣泛研究，但由于目前在十字花科植物中缺少抗菌核病的基因源，利用傳統(tǒng)的育種 方法對菌核病抗性的提高，是一個漫長的過程，進展相當緩慢，難以滿足生產(chǎn)需求。此外，利 用多菌靈等農(nóng)藥防治菌核病雖然取得一定的成效，但是也造成病原菌對藥劑的抗性問題日 益突出。半知菌亞門葡萄孢屬灰葡萄孢(Botrytis cinerea)分生孢子梗直或屈曲，無色， 光滑，分枝，分枝末端常明顯膨大，形成無色或淡色的瓶狀產(chǎn)孢細胞。產(chǎn)孢細胞多芽生，分生 孢子橢圓形，單孢，無色或灰色，聚集成堆成灰色，通常產(chǎn)生黑色不規(guī)則的微菌核。由灰葡 萄孢引起的灰霉病是一種植物病害，灰葡萄孢能在生產(chǎn)期和收獲后運輸期侵染多種經(jīng)濟作 物，包括鮮果類植物草莓、葡萄、蘋果、柑橘等；蔬菜類番茄、黃瓜、甘藍、萵苣等；觀賞植物 郁金香、秋海棠、天竺葵、菊花等?；颐共〉陌l(fā)生會引起大面積植物死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損 失。尋求對環(huán)境相容性好，對病原菌具有持久效果的農(nóng)藥顯得格外重要。據(jù)現(xiàn)有資料報道，多種以順丁烯二酸酐結(jié)構(gòu)為核心結(jié)構(gòu)的天然化合物在殺菌、除 草方面表現(xiàn)出了很強的生物活性，其中Scytalidin、Heveadride和Dihydro印iheveadride 具有良好的抗真菌譜，Cornexistin和Hydroxycornexistin已經(jīng)被開發(fā)為高效除草劑。 Zopfiellin已在日本開發(fā)為抗灰霉病菌藥物，變構(gòu)霉素和變構(gòu)菌素具有高效的抗菌核 病菌活性。變構(gòu)酸可以通過對變構(gòu)霉素的堿法水解(Cheng，X.C. ；Ubukata, M. ；Isono, K. J. Antibiot. 1990，43，809-819.)或化學合成來制備(Deshpande，A. M. ；Natu, A. A.； Argade,N. P. Synthesis 2001，702-704.)，并對其抑制蛋白磷酸酶進行了研究。變構(gòu)酸的現(xiàn) 有工藝是堿水解，具有水解條件激烈、易產(chǎn)生副產(chǎn)物等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服變構(gòu)酸堿水解合成工藝水解條件激烈、易產(chǎn)生副產(chǎn)物等缺點，本發(fā)明提 供一種工藝簡單、得率高、副產(chǎn)物少的酶法水解變構(gòu)霉素制備變構(gòu)酸的新方法。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下—種如式(I)所示的變構(gòu)酸的制備方法，所述方法包括如下步驟將變構(gòu)霉素溶 解于0. 1-0. 5M的緩沖液A中，配制成濃度為5000-50000 u g/mL的變構(gòu)霉素溶液，再將脂肪 酶溶解于0. 1-0. 5M的緩沖液B中，配制成濃度為100-500U/mL的酶液；將酶液加入到變構(gòu) 霉素溶液中，并且變構(gòu)霉素與脂肪酶酶活力之比為500-5000 y g/U，即每個肪酶酶活力單位 加入500-5000 u g的變構(gòu)霉素，于25-40°C下反應(yīng)0. 5-5. Oh,反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液的pH調(diào)至4. 0，再將所述反應(yīng)液用等體積的萃取溶劑A萃取，分離出萃液層和水層；取水層將pH調(diào)至 2. 0，本發(fā)明通常以無機酸來調(diào)pH值，水層用等體積的萃取溶劑B萃取，取有機層，用飽和鹽 水洗滌后再用Na2S04干燥，真空蒸餾濃縮溶劑，得到變構(gòu)酸粗品；將所述變構(gòu)酸的粗品再以 乙酸和二氯甲烷溶劑為梯度洗脫的洗脫劑，經(jīng)硅膠柱進行梯度洗脫，取含變構(gòu)酸的柱層析 產(chǎn)品，將得到含變構(gòu)酸的柱層析產(chǎn)品合并用丙酮重結(jié)晶，得到如式(I)所示的變構(gòu)酸產(chǎn)品，
本發(fā)明所說的脂肪酶有酵母脂肪酶、黑曲霉脂肪酶、青霉脂肪酶、諾維信脂肪酶等寸。本發(fā)明所述的緩沖液A與緩沖液B并不是兩個不同的概念，而是以A和B來區(qū)別 它們用于不同的反應(yīng)階段，其含意就是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的“緩沖液”，所述緩沖 液A與緩沖液B可以相同或不同，各自獨立為下列之一磷酸緩沖液、磷酸氫二鈉_檸檬酸 緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。所述緩沖液A與緩沖液B均優(yōu)選為磷酸緩沖液；所述磷 酸緩沖液的濃度最優(yōu)選0. 2M。本發(fā)明方法優(yōu)選將酶液加入到變構(gòu)霉素溶液中時，使變構(gòu)霉素與脂肪酶酶活力之 比為 1000-4000 u g/Uo所述的變構(gòu)酸的制備方法，所述反應(yīng)溫度為35°C，反應(yīng)時間為3小時。本發(fā)明純化部分所有的萃取溶劑A、萃取溶劑B也是以A、B區(qū)分不同步驟中的萃 取溶劑，萃取溶劑A和萃取溶劑B都表示用來萃取的有機溶劑，它合可以相同或是不同；所 述萃取溶劑A優(yōu)選為下列之一乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，乙酸丁酯，苯；最優(yōu)選乙酸乙酯。 所述萃取溶劑B為下列之一乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，乙酸丁酯，苯；最優(yōu)選乙酸乙酯。具體的，本發(fā)明所述制備方法按如下步驟進行(1)、將變構(gòu)霉素溶解于0. 2M的磷 酸緩沖液中，配制成濃度為22500 u g/mL的變構(gòu)霉素溶液，再將脂肪酶溶解于0. 2M的磷酸 緩沖液中，配制成濃度為200U/mL的酶液；(2)、將酶液加入所述的變構(gòu)霉素溶液中，并且變 構(gòu)霉素與脂肪酶酶活力之比為1000-4000 yg/U，于35°C下反應(yīng)3h ； (3)、反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng) 液的PH調(diào)至4. 0，用反應(yīng)液等體積的乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯；合 并水層將pH調(diào)至2. 0，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，乙酸乙酯層用水洗 滌后以Na2S04干燥，真空濃縮，得到變構(gòu)酸粗品；(4)、將所述變構(gòu)酸粗品以乙酸和二氯甲烷 溶劑為梯度洗脫的洗脫劑，經(jīng)硅膠柱層析，取含變構(gòu)酸的柱層析產(chǎn)品，將得到的柱層析產(chǎn)品 合并用丙酮重結(jié)晶，得到所述變構(gòu)酸產(chǎn)品。本發(fā)明脂肪酶催化變構(gòu)霉素制備變構(gòu)酸的化學反應(yīng)式如下所示 上述方案利用市售脂肪酶對變構(gòu)霉素的水解制備變構(gòu)酸。脂肪酶在緩沖液中將發(fā) 酵的變構(gòu)霉素水解成變構(gòu)酸，設(shè)調(diào)PH至4. 0，再經(jīng)過乙酸乙酯萃取分離變構(gòu)醇部分，將水相 調(diào)pH至2. 0，用乙酸乙酯萃取變構(gòu)酸，取乙酸乙酸層經(jīng)飽和鹽水洗滌，濃縮蒸發(fā)除去溶劑得 到變構(gòu)酸固體粗品；再經(jīng)硅膠柱進一步分離純化，在丙酮中結(jié)晶，得到變構(gòu)酸晶體。本發(fā)明的技術(shù)效果在于而本發(fā)明利用脂肪酶對發(fā)酵的變構(gòu)霉素進行水解，獲得 變構(gòu)酸，具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)專一、高效等優(yōu)點，在文獻中沒有相關(guān)報道，是一種新的變 構(gòu)酸制備方法。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此。實施例1利用諾維信脂肪酶水解發(fā)酵的變構(gòu)霉素制備變構(gòu)酸將相對變構(gòu)霉素樣品溶解于0. 211的磷酸緩沖液中，配制成225001!8/1^的變構(gòu)霉 素溶液；取lg諾維信(Novozym)脂肪酶，溶于50mL的0. 2M的pH7. 0磷酸緩沖液，制成200U/ mL的酶液。在10mL變構(gòu)霉素溶液中，加入0. 3mL酶液(225000ii g 60U = 3750 1)，在 35°C下反應(yīng)3h，變構(gòu)霉素水解完成得到變構(gòu)霉素水解液約10mL。變構(gòu)酸的分離純化再將上述變構(gòu)霉素水解液10mL，pH用lmol/L的HC1調(diào)至4. 0， 然后用同等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯；再將萃余相(合并的水 相7mL)的pH用lmol/L的HC1調(diào)至2. 0，用同等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯 層共20mL，用5mL飽和食鹽水水洗滌，用5g Na2S04脫水，控制溫度低于40°C真空濃縮，得到 變構(gòu)酸的粗品0. 05g。再經(jīng)硅膠柱進一步純化所述變構(gòu)酸的粗品再以乙酸和二氯甲烷溶 劑為梯度洗脫的洗脫劑，分別以乙酸和二氯甲烷體積比為2 100,200mL;6 100,200mL ； 10 100，200mL為洗脫劑進行洗脫，收集到的洗脫液分別是al、a2、a3。通過TLC檢測，a2 是含變構(gòu)酸的柱層析產(chǎn)品，a2用丙酮重結(jié)晶，濃縮后用丙酮結(jié)晶得到變構(gòu)酸結(jié)晶樣品0. 03 克。實施例2利用黑曲霉脂肪酶水解發(fā)酵的變構(gòu)霉素制備變構(gòu)酸將相對變構(gòu)霉素樣品溶解于0. 4M的磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖液中，配制成 40000ii g/mL的變構(gòu)霉素溶液；取1. 5g黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶，溶于50mL的0. 4M的pH 7. 0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，制成300U/mL的酶液。在10mL變構(gòu)霉素溶液 中，加入0. 5mL酶液(活力比為400000U 150U = 2667 1)，在37°C下反應(yīng)4. Oh，變構(gòu)霉 素水解完成得到變構(gòu)霉素水解液約10mL。變構(gòu)酸的分離純化將上述變構(gòu)霉素水解液10mL，pH用lmol/L的HC1調(diào)至4. 0， 然后用同等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯；再將萃余相(合并的 水相8mL)的pH用lmol/L的HC1調(diào)至2.0，用同等體積的氯仿萃取3次，合并乙酸乙酯層 共25mL，用6mL飽和食鹽水水洗滌用5g Na2S04脫水，小于40°C真空濃縮，得到變構(gòu)酸的粗 品0.09g。后經(jīng)硅膠柱進一步純化，以乙酸和二氯甲烷體積比為2 100,200mL;6 100， 200mL;10 100，200mL為洗脫劑進行洗脫。通過TLC檢測，將含變構(gòu)酸的柱層析產(chǎn)品合并 濃縮，用丙酮結(jié)晶得到變構(gòu)酸結(jié)晶樣品0. 06g。實施例3利用酵母脂肪酶水解發(fā)酵的變構(gòu)霉素制備變構(gòu)酸將相對變構(gòu)霉素樣品溶解于0. 3M的磷酸緩沖液中，配制成30000 u g/mL的變構(gòu)霉 素溶液；取2g酵母(Candida rugosa)脂肪酶，溶于50mL的0. 2M的pH 7. 0磷酸緩沖液，制 成400U/mL的酶液。在10mL變構(gòu)霉素溶液中，加入0.4mL酶液(活力比為300000U 120U =2500 1)，在35°C下反應(yīng)3h，變構(gòu)霉素水解完成得到變構(gòu)霉素水解液約10mL。變構(gòu)酸的分離純化再將上述變構(gòu)霉素水解液10mL，pH用lmol/L的HC1調(diào)至4. 0， 然后用同等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯；再將萃余相(合并的水 相7mL)的pH用lmol/L的HC1調(diào)至2. 0，用同等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯 層共20mL，用5mL飽和食鹽水水洗滌，用5g Na2S04脫水，控制溫度低于40°C真空濃縮，得 到變構(gòu)酸的粗品0. 07g。后經(jīng)硅膠柱進一步純化所述變構(gòu)酸的粗品再以乙酸和二氯甲烷 溶劑為梯度洗脫的洗脫劑，分別以2 100比例，200mL;6 100比例，200mL ； 10 100比 例，200mL進行洗脫。通過TLC檢測，將含變構(gòu)酸的柱層析產(chǎn)品合并濃縮，用丙酮結(jié)晶，得到 變構(gòu)酸結(jié)晶樣品0. 05g。實施例4利用青霉脂肪酶水解發(fā)酵的變構(gòu)霉素制備變構(gòu)酸將相對變構(gòu)霉素樣品溶解于0. 3M的磷酸緩沖液中，配制成25000 u g/mL的變構(gòu) 霉素溶液；取1. 5g青霉(PeniciIlium camemberti)脂肪酶，溶于50mL的0. 2M的pH 7. 0 磷酸緩沖液，制成300U/mL的酶液。在10mL變構(gòu)霉素溶液中，加入0. 3mL酶液(活力比為 250000 90 = 2778 1)，在35°C下反應(yīng)3h，變構(gòu)霉素水解完成得到變構(gòu)霉素水解液約 10mL。變構(gòu)酸的分離純化再將上述變構(gòu)霉素水解液10mL，pH用lmol/L的HC1調(diào)至4. 0， 然后用同等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯；再將萃余相(合并的水 相7mL)的pH用lmol/L的HC1調(diào)至2. 0，用同等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯 層共20mL，用5mL飽和食鹽水水洗滌，用5g Na2S04脫水，控制溫度低于40°C真空濃縮，得 到變構(gòu)酸的粗品0. 05g。后經(jīng)硅膠柱進一步純化所述變構(gòu)酸的粗品再以乙酸和二氯甲烷 溶劑為梯度洗脫的洗脫劑，分別以2 100比例，200mL;6 100比例，200mL ； 10 100比 例，200mL進行洗脫。通過TLC檢測，將含變構(gòu)酸的柱層析產(chǎn)品合并濃縮，再用丙酮結(jié)晶，得 到變構(gòu)酸結(jié)晶樣品0. 03g。實施例5利用諾維信脂肪酶水解發(fā)酵的變構(gòu)霉素制備變構(gòu)酸將相對變構(gòu)霉素樣品溶解于0. 2M的磷酸緩沖液中，配制成40000 u g/mL的變構(gòu)霉素溶液；取2g諾維信(Novozym)脂肪酶，溶于50mL的0. 2M的pH 7. 0磷酸緩沖液，制成 400U/mL的酶液。在10mL變構(gòu)霉素溶液中，加入0. 4mL酶液(活力比為400000 160 = 2500 1)，在37°C下反應(yīng)4h，變構(gòu)霉素水解完成得到變構(gòu)霉素水解液約10mL。
變構(gòu)酸的分離純化再將上述變構(gòu)霉素水解液10mL，pH用lmol/L的HC1調(diào)至4. 0， 然后用同等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯；再將萃余相(合并的水 相8mL)的pH用lmol/L的HC1調(diào)至2. 0，用同等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯 層共25mL，用6mL飽和食鹽水水洗滌，用5g Na2S04脫水，控制溫度低于40°C真空濃縮，得到 變構(gòu)酸的粗品0. 08g后經(jīng)硅膠柱進一步純化所述變構(gòu)酸的粗品再以乙酸和二氯甲烷溶劑 為梯度洗脫的洗脫劑，分別以2 100比例，200mL ;6 100比例，200mL ； 10 100比例， 200mL進行洗脫。通過TLC檢測，將含變構(gòu)酸的柱層析產(chǎn)品合并濃縮，再用丙酮結(jié)晶，得到變 構(gòu)酸結(jié)晶樣品0. 06g。
權(quán)利要求
一種如式(I)所示的變構(gòu)酸的制備方法，其特征在于所述方法包括如下步驟將變構(gòu)霉素溶解于0.1-0.5M的緩沖液A中，配制成濃度為5000-50000μg/mL的變構(gòu)霉素溶液，再將脂肪酶溶解于0.1-0.5M的緩沖液B中，配制成濃度為100-500U/mL的酶液；將酶液加入到變構(gòu)霉素溶液中，并且變構(gòu)霉素與脂肪酶活力之比為500-5000μg/U，于25-40℃下反應(yīng)0.5-5.0h，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液pH調(diào)至4.0，用等體積的萃取溶劑A萃取，分離出萃液層和水層；取水層將pH調(diào)至2.0并用等體積的萃取溶劑B萃取，取有機層，用飽和鹽水洗滌后再用Na2SO4干燥，真空蒸餾濃縮溶劑，得到變構(gòu)酸粗品；將所述變構(gòu)酸的粗品再以乙酸和二氯甲烷溶劑為梯度洗脫的洗脫劑，經(jīng)硅膠柱進行梯度洗脫，將收集到的洗脫液分別進行薄層層析，取含變構(gòu)酸的柱層析產(chǎn)品，將得到的含變構(gòu)酸的柱層析產(chǎn)品合并用丙酮重結(jié)晶，得到如式(I)所示的變構(gòu)酸產(chǎn)品，F(xiàn)DA0000021593990000011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的變構(gòu)酸的制備方法，其特征在于所述緩沖液A與緩沖液B相同 或不同，各自獨立為下列之一磷酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉 緩沖液。
3.如權(quán)利要求1所述的變構(gòu)酸的制備方法，其特征在于所述緩沖液A與緩沖液B均為 磷酸緩沖液。
4.如權(quán)利要求3所述的變構(gòu)酸的制備方法，其特征在于所述磷酸緩沖液的濃度為 0. 2M。
5.如權(quán)利要求1所述的變構(gòu)酸的制備方法，其特征在于所述方法中將酶液加入到變構(gòu) 霉素溶液中時，使變構(gòu)霉素與脂肪酶酶活力之比為1000-4000 μ g/U。
6.如權(quán)利要求1所述的變構(gòu)酸的制備方法，其特征在于所述反應(yīng)溫度為35°C，反應(yīng)時 間為3小時。
7.如權(quán)利要求1所述的變構(gòu)酸的制備方法，其特征在于所述萃取溶劑A為下列之一 乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，乙酸丁酯，苯。
8.如權(quán)利要求1所述的變構(gòu)酸的制備方法，其特征在于所述萃取溶劑B為下列之一 乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，乙酸丁酯，苯。
9.如權(quán)利要求1所述的變構(gòu)酸的制備方法，其特征在于所述制備方法按如下步驟進 行⑴、將變構(gòu)霉素溶解于0. 2M的磷酸緩沖液中，配制成濃度為22. 5mg/mL的變構(gòu)霉素溶 液，再將脂肪酶溶解于0. 2M的磷酸緩沖液中，配制成配制成濃度為200U/mL的酶液；(2)、 將酶液加入所述的變構(gòu)霉素溶液中，并且變構(gòu)霉素與脂肪酶酶活力之比為1000-4000 μ g/ U，于35°C下反應(yīng)3h ； (3)、反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液的pH調(diào)至4. 0，用等體積的乙酸乙酯萃取3 次，取乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯；合并水層將pH調(diào)至2. 0，用等體積的乙酸乙酯萃取3次， 合并乙酸乙酯層，乙酸乙酯層用飽和食鹽水洗滌后以Na2SO4干燥，真空濃縮，得到變構(gòu)酸粗 品；(4)、將所述變構(gòu)酸粗品以乙酸和二氯甲烷溶劑為梯度洗脫的洗脫劑，經(jīng)硅膠柱層析，取 含變構(gòu)酸的柱層析產(chǎn)品，將得到的含變構(gòu)酸的柱層析產(chǎn)品合并用丙酮重結(jié)晶，得到所述變 構(gòu)酸產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提供一種變構(gòu)酸的制備方法，將變構(gòu)霉素溶解于0.1-0.5M的緩沖液A中，配制成變構(gòu)霉素溶液，再將脂肪酶溶解于緩沖液B中，配制酶液；將酶液加入到變構(gòu)霉素溶液中，于25-40℃下反應(yīng)0.5-5.0h，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液pH調(diào)至4.0，用等體積的萃取溶劑A萃??；取水層將pH調(diào)至2.0并用等體積的萃取溶劑B萃取，取有機層，用飽和鹽水洗滌后再用Na2SO4干燥，真空蒸餾濃縮溶劑，得到變構(gòu)酸粗品；將所述變構(gòu)酸的粗品再以乙酸和二氯甲烷溶劑為梯度洗脫的洗脫劑，取含變構(gòu)酸的柱層析產(chǎn)品用丙酮重結(jié)晶，得到變構(gòu)酸產(chǎn)品。本發(fā)明利用脂肪酶對發(fā)酵的變構(gòu)霉素進行水解，獲得變構(gòu)酸，具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)專一、高效等優(yōu)點。
文檔編號C12P17/04GK101864467SQ201010178819
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者嘉曉勤, 芮云峰, 范永仙, 陳小龍, 黃振 申請人:浙江工業(yè)大學